心脏圆锥干畸形TBX1基因多态性研究

心脏圆锥干畸形(Conotruncal Heart Malformation,MIM217095)是一类较常见的先天性心脏病,占先天性心脏病的1/4～1/3,常见有法乐氏四联症,肺动脉瓣畸形,大动脉转位和右室双出口等.1988年,Pirepont等发现圆锥干畸形有较强的复发倾向,是一种遗传性疾病[1];1997年Chieffo等在22q11.2克隆了TBX1基因,并认为心脏圆锥干畸形发病与TBX1基因有关,但突变检测未发现有意义的突变[2].     

视黄酸对乳鼠心肌细胞凋亡及凋亡相关因子表达的影响

目的探讨视黄酸对乳鼠心肌细胞凋亡及凋亡相关基因、蛋白表达的影响。方法原代培养Balb/c乳鼠心肌细胞,并纯化获得心肌细胞。用不同浓度视黄酸(0.5、1.0、2.0、4.0μmol/L)进行处理,24h后倒置显微镜下观察各组心肌细胞的形态、搏动情况;流式细胞仪检测心肌细胞凋亡率;RT-PCR检测凋亡相关基因———Fas,Fasl mRNA的表达。Western blot测定乳鼠心肌细胞Fas,Fasl蛋白的表达。结果不同浓度的视黄酸对心肌细胞的影响不同。与对照组相比,低浓度组(0.5、1.0μmol/L)对心肌细胞形态、搏动影响不明显,Fas、Fasl mRNA及蛋白表达增加,差异无统计学意义(P>0.05);当视黄酸的浓度大于2.0μmol/L时,心肌细胞损伤明显,搏动力减弱、凋亡增加,Fas、Fasl mRNA及蛋白表达均明显增高(P<0.05)。结论高浓度视黄酸对心肌细胞有明显的抑制及促凋亡作用,与Fas,Fasl介导的死亡受体信号转导途径密切相关。     

外源性视黄酸对斑马鱼心血管系统发育的影响

目的观察不同浓度外源性视黄酸对斑马鱼早期胚胎和心血管系统发育的影响,为进一步研究视黄酸影响斑马鱼心脏前后轴(A-P轴)发育的分子机制提供形态学依据。方法选择斑马鱼胚胎孵育的3,6,9·5,12h四个时间点,用不同浓度视黄酸(1×10-6,1×10-7,4×10-8,1×10-8mol/L)处理斑马鱼胚胎,在解剖显微镜下实时观察斑马鱼胚胎心脏发育的全过程和视黄酸对斑马鱼心脏发育的影响。并采用胚胎整体原位杂交技术观察flk-1mRNA在斑马鱼胚胎的表达。结果1×10-6mol/L视黄酸可导致斑马鱼胚胎表现出多系统的严重畸形,胚胎很快死亡。在胚胎孵育的9·5、12h给与10-7~10-8mol/L浓度的视黄酸,胚胎只表现出心血管系统的畸形,其他系统无明显异常。胚胎整体原位杂交显示视黄酸对flk-1mRNA在斑马鱼胚胎血管的表达没有影响。结论视黄酸影响斑马鱼胚胎心脏发育有剂量依赖性和严格的时间窗,视黄酸影响心脏前后轴发育的关键时间是原肠胚晚期。视黄酸处理组胚胎的循环缺陷主要为心脏发育异常所致。10-7~10-8mol/L浓度视黄酸在9·5、12h处理斑马鱼胚胎可以作为研究心脏发育调控机制的动物模型。     

TBX3基因突变致Ulnar-Mammary综合征1例家系报道并文献复习

Ulnar-Mammary综合征(Ulnar-Mammary syndrome,UMS)是由TBX3基因突变所致的一种罕见单基因遗传病。本文报告1个UMS家系,先证者为15岁男性患者,表现为乳腺发育不良、尺侧肢体缺陷、身材矮小和发育迟缓。全外显子测序发现其TBX3基因的第6外显子存在1294＿1301dup变异。用Sanger测序验证家系中其他成员,结果提示患者母亲也携带同样的突变,但仅表现为左侧小指发育异常。仅单侧手指受累而无任何系统器官受累的UMS患者鲜有报道。予患者重组人生长激素(recombinant human growth hormone,rhGH)和人绒毛膜促性腺激素(human chorionic gonadotropin,hCG)治疗1年半,身高及第二性征均得到明显改善。该疾病的临床表现异质性强,容易误诊漏诊,当诊断不明时,基因检测有助于辅助诊断。     

心脏圆锥动脉干畸形患儿TBX1C基因3′UTR区域突变分析

目的 筛查心脏圆锥动脉干畸形（CTHD）患者中TBX1C基因3′UTR区域存在的基因突变,探讨该区域突变影响TBX1C基因表达的可能机制。方法 选取无22q11-2区微缺失的52例CTHD患儿（CTHD组）和89名健康儿童（对照组）作为研究对象,PCR扩增TBX1C基因完整3′UTR区序列,所有扩增片段均进行双向测序;将测序结果与GenBank中TBX1C 3′UTR序列（NM 080647.1）进行比对,筛查出可能存在的基因突变;PicTar和TargetScan在线预测软件预测可能与TBX1C基因3′UTR区结合的微RNA （miRNA）,分析TBX1C基因3′UTR区突变对miRNA调控TBX1C基因表达的影响。结果 在CTHD组中发现1例突变c.＊164_＊165insC,即在距离终止密码子164位与165位核苷酸之间插入1个胞嘧啶;该突变在对照组中不存在,其他研究中未见报道,为新发突变;预测结果显示10种miRNA能与TBX1C基因3′UTR区结合,该突变并不位于10 种miRNA与TBX1C3′UTR的结合区域。结论 TBX1C基因3′UTR区域存在新发突变c.＊164_＊165insC,该突变可能改变TBX1C3′UTR区域与miRNA结合的空间构象,进而影响miRNA对TBX1C基因表达的调控作用。     

TBX18腺病毒使成鼠骨髓间充质干细胞分化为心肌样细胞的研究

目的研究TBX18腺病毒能否转染成鼠骨髓间充质干细胞(BMSCs),并诱导其向心肌样细胞分化。方法实验于2015年5月—2016年10月在武汉大学心血管病研究所/心血管病湖北省重点实验室进行。全骨髓贴壁法分离培养BMSCs,采用流式细胞仪分析细胞纯度,随机数字表法分为实验组(TBX18组)、空白病毒对照组(GFP组)和空白对照组(B组),用TBX18或GFP重组腺病毒载体分别转染BMSCs,通过实时荧光定量聚合酶链式反应(qRT-PCR)检测α-SMA基因的表达,蛋白质免疫印迹(Western blot)检测α-SMA和cTnI蛋白的表达。结果通过全骨髓贴壁法可分离获得纯度较高的BMSCs(97%～99%)。TBX18组的α-SMA mRNA表达(2. 66±0. 08)明显高于GFP组(1.49±0.09)和B组(1.00±0.00),差异均有统计学意义(t=16. 743、36. 813,P <0. 01); TBX18组α-SMA蛋白的表达(0.66±0.00)明显高于GFP组(0.36±0.08)和B组(0. 17±0.03),差异均有统计学意义(t=6. 751、23.761,P<0.01);cTnI蛋白的表达(0.57±0.12)明显高于GFP组(0.32±0.04)和B组(0.09±0.00),差异均有统计学意义(t=3.298、6.660,P<0.01)。结论 TBX18腺病毒能成功转入骨髓间充质干细胞,并在细胞内稳定表达;TBX18可诱导成鼠骨髓间充质干细胞分化为心肌样细胞。     

HOXB1基因转染对HL-60细胞视黄酸代谢和α-干扰素表达的影响

目的探讨同源盒基因B1(HOXB1)转染对HL-60细胞视黄酸代谢和α-干扰素表达的影响.方法采用脂质体介导的质粒转染、RT-PCR及高效液相色谱(HPLC)分析等方法进行分析检测.结果 2.5×10-7 mol/L全反式视黄酸(ATRA)能抑制HOXB1转染及非转染HL-60细胞的增殖,HOXB1的高表达能明显减弱ATRA对HL-60细胞的增殖抑制作用;HPLC分析显示,转染细胞ATRA的代谢减慢;ATRA处理能诱导HOXB1转染及未转染HL-60细胞IFNα表达,加用外源性IFNα能上调ATRA处理HL-60细胞IFNα基因表达.结论 HOXB1转染使HL-60细胞ATRA代谢受抑,ATRA增殖抑制作用减弱,外源性IFNα能上调HL-60细胞IFNα表达.     

TBX5 基因靶序列单核苷酸多态性 与先天性心脏病的关系

目的 探讨TBX5 基因3'' 非翻译区靶序列SNPs 与先天性心脏病（CHD）遗传易感性的关系, 为CHD 的分子机制研究提供线索。方法 利用HaploView 软件筛选TBX5 基因3'' 非翻译区功能性单核苷酸 多态性（SNP）,并应用高分辨率熔解曲线检测TBX5 基因3'' 非翻译区SNP。采用病例对照研究分析SNP 位 点与CHD 的关联。结果 HaploView 软件筛选出TBX5 基因3'' 非翻译区有意义的标签SNP rs883079,高分 辨率熔解曲线法成功检测该SNP位点（rs883079）的G/G、G/A及A/A 3种基因型。TBX5 基因rs883079（ G>A） 位点等位基因或基因型分布频率比较,差异有统计学意义（P <0.05）;与CHD 易感性关联,A 是CHD 的危 险等位基因,A/A 为CHD 的危险基因型（P <0.05）。结论 TBX5 基因rs883079 位点SNP 与CHD 有关系, rs883079（G>A）携带突变纯合子基因型A/A 个体患CHD 的危险性升高。     

转录因子TBX18对乳鼠成纤维细胞的重编程作用

目的探讨窦房结促生长转录因子TBX18对乳鼠心脏成纤维细胞的重编程作用。方法构建携带人TBX18基因的重组腺病毒载体(Ad-TBX18)及只带有绿色荧光蛋白的腺病毒载体(Ad-GFP),转染乳鼠心脏成纤维细胞(CFs),分成实验组A(CFs-TBX18)、对照组B(CFs—GFP)和空白对照组C(CFs)。各组细胞培养8 d观察形态学变化并检测HCN4蛋白、Cox43蛋白及Cox45蛋白的表达情况;再检测心肌肌钙蛋白1(cTn1)蛋白的表达量并记录细胞内钙火花的数量;最后检测α-SMA蛋白的表达及Vimentin蛋白的荧光分布。结果成纤维细胞转染Ad—GFPTBX18后其形态学和搏动功能均未向iSANs转化。转染TBX18的成纤维细胞HCN4表达明显增高,Cox43与Cox45蛋白表达下调。钙火花检测结果显示,空白对照组细胞内有钙火花,而实验组和对照组中均未发现钙火花。cTn1蛋白检测结果表明,实验组中无cTn1蛋白表达。免疫荧光检测显示,各组中均有Vimentin蛋白的红色荧光,实验组中α-SMA高表达,而对照组α-SMA表达明显降低。结论 CFs经TBX18转染后可重编程为高表达HCN4蛋白,和低表达COX43、45蛋白表达较低的肌成纤维细胞(MCFs)。     

Cyclin D1在视黄酸诱导胸腺细胞分化中的作用研究

目的：探讨视黄酸类化合物促胸腺细胞分化的分子机制。方法：选择幼年小鼠胸腺细胞为研究对象,采用免疫组化染色、Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ、流式细胞分析等实验方法,观察全反式视黄酸（ＡＴＲＡ）或视黄醇（Ｒｅｔｉｎｏｌ）灌胃给药后对胸腺细胞分化成熟的影响,同时检测周期调控蛋白ｃｙｃｌｉｎＤ１及相应基因表达变化情况。结果：ＡＴＲＡ和Ｒｅｔｉｎｏｌ均可抑制胸腺细胞增殖活性,使胸腺组织中成熟功能Ｔ细胞比例增大;胸     

NF-κB对冠心病患者外周血单核细胞LOX-1 mRNA和蛋白表达的影响

目的探讨核因子-κB（NF-κB）对冠心病患者外周血单核细胞凝集素样氧化低密度脂蛋白受体-1（LOX-1）mRNA表达的影响。方法分离收集冠心病患者外周血单核细胞,分为3组:对照组在不含血清的RPMI-1640中孵育24h;ox-LDL组在不含血清的RPMI-1640中加ox-LDL（40μg/ml）孵育24h;PDTC（NF-κB抑制剂）组:先加PDTC(10^-5mol/L)培育1h之后加ox-LDL（40μg/ml）继续孵育24h,之后收集单核细胞及细胞上清液,采用异硫氰酸胍—酚—氯仿抽提法提取总RNA,扩增目的基因LOX-l,并采用ELISA法测定上清液中sLOX-1蛋白浓度。结果与对照组比较,ox-LDL组单核细胞LOX-1 mRNA表达增加（0.304±0.047vs0.813±0.131,P<0.05）,细胞上清液中sLOX-1蛋白含量（ng/ml）增加（7.277±1.979 vs 16.517±2.064,P<0.05）;PDTC组单核细胞LOX-1 mRNA表达及细胞上清液中sLOX-1蛋白含量均增高（分别为0.502±0.140和11.997±1.757,P<0.05）。与ox-LDL组相比,PDTC组单核细胞LOX-1 mRNA表达减少,细胞上清液中sLOX-1蛋白含量显著减少（P<0.05）。结论 ox-LDL可诱导人单核细胞LOX-1表达增加,NF-κB也参与了ox-LDL对LOX-1表达并有促进作用。     

RNA联合干扰对肝癌细胞CDC20和HPSE表达的影响

目的 探讨RNA联合干扰(RNAico)对肝癌细胞株Hepa1-6中丝裂原调控子20(CDC20)和乙酰肝素酶(HPSE)表达的抑制作用.方法 设计针对小鼠肝癌细胞Hepa1-6 CDC20和HPSE mRNA的小干扰RNA,以阳离子脂质体包埋后转染鼠肝癌细胞Hepa1-6,即RNAico;转染48 h后,采用RT-PCR和Re-a1-Time PCR测定CDC20、HPSE mRNA表达的变化.结果 联合干扰组CDC20和HPSE mRNA表达明显抑制,与其他各组相比,在统计学上有显著性差异(P＜0.05).结论 RNAico可同时显著抑制小鼠肝癌细胞Hepa1-6中CDC20和HPSE mRNA的表达.     

Aquaporin-1 mRNA在人非小细胞肺癌组织中的表达和意义

目的:探讨 Aquaporin-1(AQPI)mRNA在人非小细胞肺癌组织中的表达和意义.方法:以相应患者手术切除的正常肺组织为对照,采用半定量 RT-PCR 技术检测人非小细胞肺癌(17例鳞癌和18例腺癌)组织中 AQP1 mRNA 的表达水平.结果:人肺腺癌组织中 AQP1 mRNA 表达水平为0.419±0.135,高于正常肺组织中的表达水平(0.250±0.124),二者之间差异有统计学意义 (P<0.05);人肺鳞癌组织中 AQP1 mRNA 表达水平为0.341±0.099,与正常肺组织中 AQP1 mRNA 表达水平(0.264±0.114)之间无统计学差异(P>0.05).结论:AQP1 mRNA在人肺腺癌组织中表达增加,提示AQP1可能与人肺腺癌的发生和发展有关系.     

磷脂酶C-γ1在小鼠胚胎组织表达的免疫细胞化学研究

目的 研究磷脂酶C-γ1在小鼠胚胎各组织的表达及规律。方法 制备小鼠胚胎标本，进行石蜡包埋并切片，采用免疫细胞化学方法检测磷脂酶C-γ1的表达。结果 各种胚胎组织中软骨、骨骼肌、心肌、肾脏集合小管、结缔组织、脑等均有不同程度的表达。结论 磷脂酶C-γ1相关的信号通路对于小鼠胚胎细胞（软骨、骨骼肌、肾脏集合小管、结缔组织、脑神经元等）的发育可能具有重要的生物学意义。     

核心结合因子α1在成牙本质细胞样细胞MDPC-23中的表达

目的：观察核心结合因子α1（cbfα1）在成牙本质细胞样细胞MDPC-23中的表达情况，为进一步研究cbfα1在牙胚发育，尤其是成牙本质细胞分化过程中的作用奠定基础。方法：通过瞬时转染、免疫荧光染色、Western blot等方法，研究转染或BMP-2刺激时，cbfα1在MDPC-23细胞中的表达情况。结果：在普通MDPC-23细胞中未发现cbfα1的表达；转染pcDNA3．cbfα148h后，cbfα1表达量最高；加入骨形态发生蛋白-2（BMP-2）刺激，可诱导内源性cbfα1的表达，但表达量小于pcDNA3-cbfα1组；而pcDNA3-cbfα1组和BMP-2＋pcDNA3-cbfα1组的cbfα1表达量差异无显著性意义（P〉0．05）。结论：转染pcDNA3-cbfα148h后，cbfα1表达量最高，可作为今后研究的观测点。     

维甲酸受体在小鼠胚胎造血发育中的表达

目的 检测小鼠胚胎造血发育中维甲酸(retinoic acid,RA)受体(RA receptors,RARs)不同亚型RAR-α、RAR-β、RAR-γ及其合成酶视黄醛脱氢酶1(retinal dehydrogenase 1,Raldh1)和Raldh2的转录水平,探讨RARs不同亚型及其合成酶在胚胎造血发育中的作用.方法 获取孕鼠胎龄9.5 d(embryonic day 9.5,E9.5)卵黄囊(yolk sac,YS),E10.5、E11.5主动脉-性腺-中肾(aorta-gonad-mesonephros,AGM)区,E13.5、E14.5、E17.5胎肝(fetal liver,FL)和成年小鼠骨髓(bone marrow,BM),运用实时荧光定量PCR检测各组织中RAR-α、RAR、RAR-γ、Raldh1和Raldh2的转录水平.结果 与其他不同阶段造血组织比较,在E9.5 YS、E11.5 AGM区和BM中,RAR-α、RAR-β、RAR-γ及Raldh1、Raldh2均高表达(P＜0.01).E11.5 AGM区RAR-α、RAR-β、RAR-γ及Raldh1、Raldh2表达水平高于E10.5 AGM区(P＜0.01).而E13.5～E17.5 FL间的RAR-β、RAR-γ及Raldh1、Raldh2表达水平差异无统计学意义.结论 YS、AGM区和BM中RAR-α、RAR-β、RAR-γ及其合成酶Raldh1和Raldh2表达趋势与已有研究中相应造血组织来源的红系造血祖细胞改变相一致,反映了RA与小鼠个体发育中YS、AGM区和BM的造血形成密切相关,而RA对FL的造血形成作用可能并不显著.     

Caspase-3在维A酸致小鼠胚胎神经管畸形中的表达及意义

目的:探讨Caspase-3在维A酸(RA)致小鼠胚胎神经管畸形发生过程中的表达及意义。方法:40只未经产昆明种小鼠随机分为实验组和对照组各4小组,每小组5只。分别在花生油及RA处理18、42、66、90 h后剖腹取胎、剥离头部神经管,Western-bloting法检测Caspase-3的表达变化。结果:Caspase-3在正常胚胎神经管组织中的表达存在时间依赖性。对照组Caspase-3在花生油灌服后18 h表达升高,42 h和66 h时表达最强,之后表达逐渐降低。实验组Caspase-3在RA处理后42 h表达水平显著低于对照组(P0.01),66 h和90 h时表达水平均显著高于对照组(P0.01)。结论:RA改变了昆明种小鼠胚胎神经管中Caspase-3的正常时间表达模式,这种异常的基因表达模式可能参与了RA诱导的神经管畸形发生。     

乌司他丁对体外循环时心肌组织黏附分子及P选择素表达的影响

目的:观察乌司他丁对体外循环前后P-选择素及细胞间黏附分子-1mRNA的表达的影响。方法:40例行体外循环心内直视手术的先天性心脏病患儿,治疗组20例,预充液中加入乌司他丁1万IU/kg;对照组20例,应用常规预充液。于体外循环前后各取右心耳组织,采用RT-PCR方法检测心肌组织中P-选择素、ICAM-1 mRNA的表达水平。结果:两组P-选择素、ICAM-1mRNA表达量术后均较术前增高(P<0.01);术后对照组中其升高幅度明显高于治疗组(P<0.01)。结论:体外循环心肌组织黏附分子P-选择素及ICAM-1mRNA表达增加。乌司他丁可以通过抑制这些黏附分子的表达,从而减轻炎症反应。     

bcl-2及cyclinD1 mRNA在膀胱移行细胞癌中的表达

目的 检测bcl-2及cyclinD1 mRNA在膀胱移行细胞癌中的表达.方法 应用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)的方法检测40例膀胱移行细胞癌组织和10例正常膀胱组织中bcl-2、cyclinD1 mRNA的表达情况.结果 40例膀胱移行细胞癌组织中bcl-2、cyclinD1 mRNA的表达分别为0.650±0.018、0.660±0.022,与其在正常膀胱组织中的表达0.250±0.035、0.320±0.028相比,差异均有统计学意义(P＜0.05).Bcl-2 mRNA在临床分期Tα～T2a中的表达(0.720±0.011)显著高于T2b～T4(0.59±0.017),P＜0.05;cyclinD1 mRNA在Tα～T2a的表达量(0.590±0.021)显著低于T2b～T4(0.750±0.021),P＜0.05.相关分析示相关系数为r=-0.34,P=0.031.结论 bcl-2、cyclinD1 mRNA在膀胱移行细胞癌中过度表达与肿瘤的发生、发展密切相关;可用于膀胱移行细胞癌的诊断和评价预后;在膀胱移行细胞癌的发展及评价预后中,bcl-2、cyclinD1 mRNA呈现出负相关趋势. Abstract： Objective To investigate the expression and clinical significance of bcl-2 and cyclinD1 mRNA in bladder transitional cell carcinoma(TCCB). Methods The expression of bcl-2 and cyclinD1 mRNA were detected by RT-PCR in 40 patients with TCCB and 10 normal bladder tissues. Results The expressional level of bcl-2 and cyclinD1 mRNA in 40 TCCB tissues(0.650±0.018,0.660±0.022) were significantly higher than that level in normal tissues(0.250±0.035,0.320±0.028) (P<0.05). The expression of bcl-2 mRNA in the TCCB tissues of clinical stage Tα-T2a was higher than the expression in stage T2b-T4(P<0.05). But cyclinD1 mRNA in the TCCB tissues of clinical stage T2b-T4 was higher than the expression in stage Tα-T2a(P<0.05),and cyclinD1 mRNA and bcl-2 had correlation(P<0.05). Conclusions RT-PCR assay is reliable and sensitive for detecting bcl-2 and cyclinD1 mRNA in carcinoma specimens from TCCB. The high expression of bcl-2 and cyclinD1 mRNA were correlated to the malignancy.     

The expression of TRPA1 mRNA in the rat brain

Objective： To investigate the distribution of TRPA1 （one kind of the TRP-like ion channel family） channel in the hippocampus and cerebral cortex of rat. Methods： RT-PCR was used to amplify the fragment of TRPA1 in the DRG （dorsal root ganglion）, hippocampus and cerebral cortex of adult SD rat. In situ hybridization staining was used to show the distribution of TRPA1 mRNA in the hippocampus and cerebral cortex of adult rat brain. Results： Both RT-PCR and in situ hybridization staining showed that TRPA1 mRNA was expressed in hippocampus and cerebral cortex of the adult rat brain. Conclusion： Our results suggest that there is expression of TRPA1 mRNA both in the hippocampus and cerebral cortex of the adult rat brain.