MDR1启动子/荧光素酶质粒的构建及其在朊蛋白高表达胃癌细胞中的活性检测

目的：构建含MDR1基因启动子的荧光素酶报告基因质粒,并检测其在朊蛋白高表达胃癌细胞系中的活性表达。方法：PCR克隆人MDR1基因启动子片段,通过亚克隆将启动子分别插入到pMD18-T载体和荧光素酶报告基因pGL3-Enhancer载体中,建立含MDR1启动子的荧光素酶报告基因质粒pGL-MDR1,并经测序及酶切确定扩增序列;脂质体基因转染法将pGL-MDR1转染入朊蛋白高表达胃癌细胞系SGC7901-PrP,并测定其荧光素酶活性。结果：PCR克隆出MDR1启动子经DNA测序证实序列正确,pGL-MDR1转染入朊蛋白高表达胃癌细胞系的荧光素酶活性,较转染入pcDNA3.1空载体细胞系相比升高3-5倍。结论：成功构建含MDR1启动子的荧光素酶报告基因质粒;上调朊蛋白表达可激活MDR1的转录活性。     

人Bax启动子荧光素酶报告基因的构建和鉴定

[目的]克隆人Bax基因的启动子,插入荧光素酶报告基因载体中,并在细胞内检测其活性。[方法]采用PCR技术从人HepG2细胞中扩增出Bax启动子,插入荧光素酶报告基因载体pGL3-basic中,经测序确定所扩增的DNA序列,并将其转染入H1299细胞中检测其活性。[结果]测序结果表明扩增的Bax启动子序列正确,双报告基因实验检测荧光素酶活力表明构建的报告基因具有启动子活性。[结论]克隆了Bax启动子,成功构建了人Bax启动子报告基因,为p53家族凋亡通路的功能研究提供了必要的实验材料。     

hTERT启动子调控的融合自杀基因CD:UPRT载体的构建及其应用

目的 构建hTERT启动子调控的融合自杀基因CD:UPRT表达载体,研究其对人胃癌细胞SGC7901的体外靶向性杀伤作用。方法 PCR扩增hTERT核心启动子片段,克隆入荧光素酶报告基因质粒pGL3 Basic,检测hTERT启动子在人胃癌细胞SGC7901和人成纤维细胞HLF中的转录活性。构建hTERT启动子调控的CD:UPRT基因表达载体hTERT CD:UPRT,将其和CMV启动子调控的CD:UPRT基因表达载体pcDNA3.1 CD:UPRT用脂质体转染法分别转染入SGC7901和HLF细胞,筛选稳定表达细胞系,用RT PCR和Western blot方法检测CD基因的表达,用MTT法检测5 FC对转染细胞的杀伤作用。结果 成功克隆hTERT核心启动子;荧光素酶活性检测显示,hTERT启动子在SGC7901细胞中的转录活性为阳性对照的(21.50±2.15)%,而在HLF细胞中仅有背景活性。成功构建hTERT启动子调控的CD:UPRT基因表达载体,转染pcDNA3.1 CD:UPRT的SGC7901和HLF细胞以及转染hTERT CD:UPRT的SGC7901细胞在mRNA和蛋白质水平均可检测到CD基因的表达,且对5 FC敏感;而转染hTERT CD:UPRT的HLF细胞未检测到CD基因的表达,对5 FC不敏感。结论 构建的hTERT启动子调控的融合自杀基因系统CD:UPRT/5 FC能在体外靶向性杀伤SGC7901细胞。     

Puma荧光素酶报告基因的构建和鉴定

目的为研究p53家族调控细胞凋亡的机制,构建并鉴定插入人Puma基因的启动子片段的荧光素酶报告基因载体。方法采用PCR技术从人类HepG2细胞中扩增Puma启动子的含p53反应元件的180bpDNA片段,插入荧光素酶报告基因载体pGL3-basic中。经测序确定所扩增的DNA序列;将其转染人人类肺腺癌141299细胞中,双报告基因实验检测荧光素酶活力。结果测序结果表明扩增的Puma启动子序列正确,活性检测显示构建的报告基因具有启动子活性。结论克隆了含p53反应元件的Puma启动子,成功构建了人类Puma启动子报告基因,为p53家族凋亡通路的功能研究提供了必要的实验材料。     

人脂肪酸合成酶FAS启动子的克隆及其在几种肿瘤细胞中的转录活性分析

目的:克隆人脂肪酸合成酶基因FAS启动子的序列,构建重组荧光素酶表达载体pGL3-FAS,并分析其在几种肿瘤细胞中的转录活性,为其作为肿瘤靶向基因治疗的工具提供依据。方法:以人基因组DNA为模板,PCR扩增FAS启动子区680bp活性序列,经测序鉴定正确后,克隆至荧光素酶表达载体pGL3-enhancer中,构建成重组荧光素酶表达载体pGL3-FAS。将pGL3-FAS通过脂质体转染胃癌细胞系SGC-7901、人宫颈癌细胞系Hela、人乳腺癌细胞系SKBR3、人肝癌细胞系HepG2以及NIH3T3成纤维细胞系中,应用荧光素酶检测系统测定荧光素酶活性,通过内参校正得到相对转录活性。结果:成功扩增出大小约为680bp的FAS启动子序列,经测序鉴定与Genebank报道的一致。经酶切鉴定,成功构建重组荧光素酶表达载体pGL3-FAS。瞬时转染pGL3-FAS,发现其在SGC-7901、Hela、SKBR3、HepG2细胞中均具有较强的荧光素酶活性,且荧光素酶活性高于强启动子SV40驱动的pGL3-control载体;而在正常成纤维细胞中,转录活性较低。结论:FAS启动子在肿瘤细胞中具有强转录活性,而在正常细胞中转录活性很低,具有良好的肿瘤靶向性,为肿瘤靶向基因治疗提供理论依据。     

E2F1对 TFDP3 表达的调控及其对前列腺癌PC3细胞凋亡的影响

目的：构建含TFDP3基因启动子和荧光素酶报告基因的重组载体pGL3-TFDP3-promoter,观察E2F1对TFDP3转录及表达的调控作用以及TFDP3对E2F1诱导肿瘤细胞凋亡的影响。方法：以人前列腺癌PC3细胞系基因组DNA为模板,PCR扩增TFDP3启动子序列并克隆入荧光素酶报告基因载体,与E2F1表达载体pCMV-E2F1-HA瞬时单独或共同转染PC3细胞,测定荧光素酶活性以观察E2F1对TFDP3启动子的调控作用,Western blotting检测pCMV-E2F1-HA转染对PC3细胞内TFDP3表达的影响,流式细胞术检测TFDP3与E2F1相互作用对前列腺癌细胞凋亡的影响。结果：成功构建TFDP3基因启动子重组质粒pGL3-TFDP3-promoter,与E2F1表达载体pCMV-E2F1-HA共转染PC3细胞后,TFDP3启动子诱导的荧光素酶活性较单独转染pGL3-TFDP3-promoter显著升高[（1.14±0.06）vs（0.61±0.05）, P<0.05]。转染pCMV-E2F1-HA的PC3细胞的TFDP3蛋白表达是未转染细胞的2.7倍[（0.24±0.03）vs（0.09±0.02）, P<0.05]。pCMV-E2F1-HA转染后PC3细胞凋亡率较未转染组显著上升[（7.10±0.003）% vs（2.66±0.001)%,P<0.05],而pCMV-E2F1-HA与pcDNA3.1-TFDP3共转染后细胞凋亡率较pCMV-E2F1-HA组显著下降[（4.92±0.002）% vs（7.10±0.003）%,P<0.05]。结论：E2F1可增强TFDP3启动子的活性,增加TFDP3蛋白的表达,其可能通过此机制抑制E2F1诱导的前列腺癌细胞凋亡。     

hTERT启动子的克隆及在MCF7乳腺癌细胞中的特异转录活性

背景与目的：利用肿瘤特异性启动子增强肿瘤细胞中治疗基因的转录选择性是达到基因治疗靶向性的有效途径。人端粒酶催化亚基（hTERT）在大部分肿瘤细胞中呈特异性高表达，有可能成为肿瘤特异性启动子。本文扩增了hTERT基因启动子并分别克隆于报告基因重组质粒pEGFP-1和pGL3-Basic，检测并证实hTERT启动子在乳腺癌细胞MCF7中的特异转录活性。方法：采用套式PCR法扩增hTERT启动子，将其分别克隆到含报告基因增强绿色荧光蛋白（EGFP）的重组质粒pEGFP-1和含Luciferase的重组质粒pGL3-Basic，经脂质体分别转染人乳腺正常上皮细胞系HBL100和乳腺癌细胞MCF7，荧光显微镜观察EGFP的表达情况，并测定两种细胞中荧光素酶转录表达差异。结果：与正常细胞HBL100相比，hTERT启动子在MCF7细胞呈现强的绿色荧光表达；荧光素酶活性检测与其一致，hTERT启动子在MCF7乳腺癌细胞的荧光素酶相对活性RLU／U值（33784）约相当于HBL100细胞中（2400）的15倍。结论：hTERT启动子在乳腺癌MCF7细胞中具有很强的特异性，为进一步开发肿瘤的特异性基因治疗奠定实验基础。     

survivin启动子的克隆及在HeLa细胞中的特异生物活性

目的: 构建带有survivin启动子的pGL3Basic真核表达载体，探讨survivin启动子在HeLa细胞中的特异表达活性。 方法: 采用PCR技术扩增survivin启动子，插入pGL3Basic载体，构建携带survivin启动子的pGL3Basic真核表达载体（pGL3Basic/ Surp）。纯化pGL3Basic/ Surp质粒，用脂质体法转染HeLa细胞和正常血管内皮细胞ECV304，48 h后收集转染细胞与荧光素酶底物反应，检测荧光素酶活性。 结果: 成功克隆1 kb survivin基因启动子，并构建了携带有survivin基因启动子的pGL3Basic真核表达载体，转染后的Hela细胞荧光素酶活性为2074.2±78.5，而ECV304荧光素酶活性为9.7±1.1。 结论： 成功克隆的survivin启动子在HeLa细胞中表现出较高的肿瘤特异性活性，为进一步开发肿瘤的靶向基因治疗奠定了基础     

CXCR4和Survivin启动子的克隆及其在乳腺癌细胞系的转录特异性分析

目的:评估CXCR4和Survivin启动子在乳腺癌细胞系中的特异转录活性.方法:采用PCR方法扩增CXCR4和Survivin启动子序列,将其分别克隆到舍有报告基因增强绿色荧光蛋白(EGFP)的质粒载体pEGFP-1和含有荧光素酶(LUC)的质粒载体pGL3-Basic,经脂质体分别转染乳腺癌细胞系(MCF-7MDA-MB-231和T-47D)和乳腺上皮细胞(HBL-100).荧光显微镜下观察EGFP的表达情况,并测定2个启动子在乳腺癌细胞中的荧光素酶活性.结果:CXCR4和Sur-vivin启动子在3种乳腺癌细胞中均表现特异的转录活性.CXCR4启动子在MDA-MB-231中的活性高于Survivin启动子(P=0.004);而在MCF-7细胞中活性低于Survivin启动子(P=0.006),两者在T-47D细胞中的启动子活性相当,P=0.615.结论:CXCR4和Survivin启动子在乳腺癌细胞中具有强的特异转录活性,且在不同乳腺癌细胞类型表现的转录特异性有一定差异.     

t（6；11）染色体易位肾细胞癌中Alpha基因片段的克隆及启动子活性分析

  目的   构建包含不同Alpha基因片段的重组报告质粒和Alpha1-TFEB融合基因表达质粒，并评价Alpha基因启动子活性。   方法   利用软件对Alpha基因进行启动子预测；采用PCR技术扩增出5种不同长度的Alpha基因片段和正常TFEB基因启动子序列pTFEB，构建含Alpha基因片段和pTFEB的重组报告质粒；采用脂质体转染法将其分别转染至人胚肾293T细胞；通过荧光素酶活性检测确定Alpha基因的启动子活性。同时构建含Alpha1-TFEB融合基因表达质粒，转染293T细胞后，采用Western blot法检测转染前后TFEB蛋白的表达水平。   结果   成功构建含不同Alpha基因片段和pTFEB的重组报告质粒。与pGL3-Basic质粒转染组进行比较，Alpha1、Alpha2、Alpha3、Alpha4、Alpha5质粒转染组的荧光素酶活性显著增高（P＜0.01）；与正常TFEB基因启动子进行比较，Alpha1、Alpha2、Alpha5的荧光素酶活性明显增高（P＜0.01）；与pGL3-Enhancer质粒转染组进行比较，pGL3-Enhancer-Alpha1-TFEB表达质粒组TFEB蛋白的表达明显升高。   结论   t（6；11）染色体易位肾细胞癌中Alpha基因具有启动子活性，可促进TFEB表达，Alpha5片段最强活性区域位于643~693位碱基序列。      

人类生存蛋白启动子的克隆及其在淋巴瘤细胞中的转录活性研究

  目的　克隆人类生存蛋白（Survivin）核心启动子,研究Survivin启动子在人类淋巴瘤细胞Ramos和健康人肝脏细胞Chang Liver中的转录活性。方法　以人类肠基因组DNA为模板,PCR扩增Survivin启动子987 bp片段,将其通过酶切位点连入pGL3-Basic载体构建pGL3-Survivin荧光素酶报告基因载体,通过脂质体转染法转染Ramos和Chang Liver 细胞,通过检测荧光素酶表达水平,比较Survivin启动子在这两种细胞中的转录活性。结果　成功克隆出987 bp的Survivin启动子;双酶切、PCR检测和DNA测序证实pGL3-Survivin载体构建成功;荧光素酶活性检查显示：Survivin启动子在Ramos细胞中的转录活性为阳性对照CMV启动子活性的4.5 %,明显高于在Chang Liver细胞中的0.19 %,在淋巴瘤细胞中具有较高特异性,且在淋巴瘤细胞中的活性明显高于阴性对照pGL3-Basic的0.086 %。结论　Survivin启动子在淋巴瘤细胞中具有较高的特异性,可以作为淋巴瘤细胞基因转染的肿瘤特异性启动子使用。     

转录因子STAT5A启动子荧光素酶报告基因质粒的构建及鉴定

目的： 利用分子克隆的方法构建转录因子STAT5A启动子荧光素酶报告基因质粒并鉴定其效应。方法： 以乳腺癌MCF7细胞基因组DNA为模板,采用PCR方法扩增STAT5A基因的启动子序列,并将其克隆至荧光素酶报告基因质粒pGL3-Enhancer中,经过菌液扩增、酶切、测序等方法获得目的质粒,并通过双荧光报告基因实验进一步验证其功能。结果： 构建的STAT5A启动子荧光素酶报告基因质粒pGL3-STAT5A-pro-luc-E序列正确,且具有转录活性。在双荧光报告基因实验中发现重组载体pGL3-STAT5A-pro-luc-E荧光素酶的相对活性约为阴性对照pGL3-Enhancer的8倍（P<0.01）,而pGL3-STAT5A-pro-N-luc-E荧光素酶的相对活性约是阴性对照pGL3-Enhancer的6倍（P<0.01）。结论： 本项目成功构建了转录因子STAT5A启动子荧光素酶报告基因质粒,为进一步研究STAT信号转导及转录激活蛋白信号通路提供了重要的研究工具。     

Enhancement of gene expression under hypoxic conditions using fragments of the human vascular endothelial growth factor and the erythropoietin genes

Purpose: Selective gene expression in response to tumor hypoxia may provide new avenues, not only for radiotherapy and chemotherapy, but also for gene therapy. In this study, we have assessed the extent of hypoxia responsiveness of various DNA constructs by the luciferase assay to help design vectors suitable for cancer therapy.Materials and Methods: Reporter plasmids were constructed with fragments of the human vascular endothelial growth factor (VEGF) and the erythropoietin (Epo) genes encompassing the putative hypoxia-responsive elements (HRE) and the pGL3 promoter vector. Test plasmids and the control pRL-CMV plasmid were cotransfected into tumor cells by the calcium phosphate method. After 6 h hypoxic treatment, the reporter assay was performed.Results: The construct pGL3/VEGF containing the 385 bp fragment of the 5’ flanking region in human VEGF gene showed significant increases in luciferase activity in response to hypoxia. The hypoxic/aerobic ratios were about 3–4, and 8–12 for murine and human tumor cells, respectively. Despite the very high degree of conservation among the HREs of mammalian VEGF genes, murine cells showed lower responsiveness than human cells. We next tested the construct pGL3/Epo containing the 150 bp fragment of the 3’ flanking region in the Epo gene. Luciferase activity of pGL3/Epo was increased with hypoxia only in human cell lines. The insertion of 5 copies of the 35-bp fragments derived from the VEGF HREs and 32 bp of the E1b minimal promoter resulted in maximal enhancement of hypoxia responsiveness.Conclusions: The constructs with VEGF or Epo fragments containing HRE may be useful for inducing specific gene expression in hypoxic cells. Especially, the application of multiple copies of the HREs and an E1b minimal promoter appears to have the advantage of great improvement in hypoxia responsiveness.     

PC-1基因在肿瘤组织中的表达及其启动子区的克隆和活性分析

背景与目的：PC－1是在骨转移和雄激素非依赖的前列腺癌细胞株C4－2中高表达的新基因。本文拟研究PC－1基因在多种人肿瘤组织和正常组织中的表达水平,并对该基因的启动子区进行克隆及活性分析。方法：以PC－1基因特异性DNA序列为探针与10对肿瘤和正常组织的总RNA进行杂交;以C4－2细胞基因组DNA为模板,PCR扩增PC－1基因翻译起始位点上游DNA序列。PCR产物定向克隆到含荧光素酶报告基因的载体pGL3-Basic上,将重组质粒瞬时转染C4－2细胞,荧光素酶定量分析检测启动子活性。结果：多肿瘤组织中PC－1基因的表达水平明显高于相应的正常组织中的表达;翻译起始位点上游340bp的片段没有启动子活性,而ATG前1099bp、1337bp,1579bp,1831bp和4939bp长度的片段都表现出启动子的功能活性。结论：PC－1基因在人前列腺癌以及多种肿瘤组织中被特异激活,表明该基因的功能可能和肿瘤的发生有关;研究的初步结果表明4939bp长度的启动子活性最强,以1831bp和4939bp之间可能含有转录增强子元件。     

人端粒酶催化亚单位(hTERT)启动子的克隆及其在人肺癌细胞中转录活性的研究

目的克隆人端粒酶催化亚单位(hTERT)的启动子，并检测它在多种人肺癌细胞株和人胚肺成纤维细胞株中的转录活性，为肺癌靶向性基因治疗的研究奠定基础。方法以人胚肾293细胞基因组DNA为模板，应用PCR方法克隆hTERT 5’端上游旁侧序列长约1．1kh的启动子片段，经DNA测序无误后克隆人荧光素酶报告质粒pGL3-Basic的荧光素酶基因上游，构建pGL3-hTER Tp重组质粒，用脂质体法瞬时转染人肺癌细胞株A549、SPC-A-1、LTEPa-2、NCI—H446、YTMLC、GLC-82、A2，以及人胚肺成纤维细胞株MRC5，转染48h后检测hTERT启动子在各细胞株中的转录活性。结果琼脂糖凝胶电泳显示PCR克隆的hTERT启动子片段长约1.1kb。DNA测序结果与GenBank中hTERT启动子DNA序列完全一致，其5’端和3’端分别位于hTERT基因转录起始位点上游1126bp和43bp，片段长度为1084bp。采用双酶切和PCR两种方法鉴定pGL3-hTERTp重组质粒，均显示构建成功。瞬时转染及荧光素酶活性检测实验显示，hTERT启动子在所检测的肺癌细胞株中均有高低不同的转录活性，而在MRC-5细胞株中无转录活性。结论该实验克隆的1084bp大小的hTERT启动子在多种肺癌细胞株中均有转录活性，在人胚肺成纤维细胞中无转录活性。hTERT启动子有可能作为调控元件用于肿瘤靶向性基因治疗。