Fas/APO-1基因转染食管癌Eca-109细胞及其表达

 目的　通过将Fas/APO 1基因转染食管癌细胞 ,比较转导前后基因及蛋白的表达水平。方法　运用已构建的Fas/APO 1真核表达质粒 ,用脂质体介导法将目的基因导入Eca 10 9细胞 ,筛选克隆细胞以Southernblot ,Northernblot ,Westernblot法检测Fas/APO 1基因的表达。结果　转导株与非转导株均有Fas/APO 1cDNA的表达 ,但转导株在基因及蛋白水平的表达均明显高于非转导株。结论　Fas/APO 1基因在食管癌细胞中处于低表达状态 ;通过基因转导能有效增强其表达。     

反义核酸抑制胃癌细胞Bcl-2表达

本文采用分子克隆技术成功地构建了反义核酸表达载体pDOR-Bcl-2 cDNA.以脂质体介导法将重组反义核酸表达载体转染受体细胞SGC7901,并经C418筛选,从2×10~5细胞中筛选出大约150个抗性克隆,转导率大于1‰,随机挑选2个克隆继续筛选与扩增培养,获得了1株稳定的抗性细胞,从而建立了Bcl-2表达阻断的胃癌细胞株,我们命名为7901anBcl-2 cells.通过Southern印迹法、Northern印迹法、Western印迹法检测显示,转导株与非转导株均有Bcl-2 cDNA的表达,但转导株Bcl-2 mRNA及蛋白的表达明显低于非转导株.说明在胃癌细胞中Bcl-2基因处于高表达状态,通过真核表达载体介导的转染,反义Bcl-2可成功地导入胃癌细胞,并有效地阻断Bcl-2表达.     

抑制STAT3基因表达对人宫颈癌HeLa细胞定植和侵袭的影响

目的 采用RNA干扰(RNAi)技术抑制人宫颈癌HeLa细胞信号转导及转录活化因子3(STAT3)基因的表达,观察其对HeLa细胞定植和侵袭能力的影响.方法 针对STAT3基因设计并合成编码小干扰RNA(siRNA)的寡核苷酸,克隆入pSilencer2.1-U6-neo质粒中,从而构建针对STAT3基因的短发夹状siRNA真核表达质粒,用脂质体法将其转染人人宫颈癌HeLa细胞.利用RT-PCR技术和Western blot方法分别检测STAT3 mRNA和蛋白表达水平;通过软琼脂克隆形成实验和体外侵袭实验检测HeLa细胞的定植和侵袭能力.结果 针对STAT3基因的短发夹状siRNA真核表达质粒成功转染人宫颈癌HeLa细胞;转染成功的HeLa细胞的STAT3基因mRNA及蛋白表达均下降;HeLa细胞在软琼脂中形成的克隆数和穿透Matrigel膜的细胞数均明显减少.结论 针对STAT3基因的短发夹状siRNA真核表达质粒通过下调STAT3基因表达,抑制宫颈癌细胞的定植和侵袭能力.     

RNA干扰技术抑制smad4基因表达对宫颈癌细胞增殖的影响

目的：探讨用RNA干扰技术下调smad4基因表达对宫颈癌细胞增殖的影响。方法：用DNA重组技术将针对人smad4基因不同部位所设计的三对短发夹状RNA（shorthairpinRNA，shRNA）序列克隆到真核表达质粒pGenesil-1中，构建smad4shRNA表达载体pGenesil—smad4一shRNA1、2、3。脂质体介导转染人宫颈癌细胞株HeLa，经G418筛选抑制smad4表达的稳定细胞克隆。MTT法、克隆形成实验、流式细胞术检测抑制smad4基因对宫颈癌细胞增殖的影响。结果：成功构建分别携带三段shRNA及空载体对照的重组质粒pGenesil—smad4-shRNA1、2、3和pGenesil-con，三种shRNA重组质粒中pGenesil—smad4-shRNA2可明显降低细胞内smad4mRNA及smad4蛋白表达，筛选出的HeLa／shRNA2细胞增殖能力明显增强。结论：应用RNA干扰技术能筛选出特异而高效阻断smad4基因表达及功能的shRNA，smad4基因表达下调能明显促进宫颈癌细胞生长。     

反义核酸抑制胃细胞Bcl—2表达

本文采用分子克隆技术成功地构建了反义核酸表达载体ｐＤＯＲ－Ｂｃｌ－２ ｃＤＮＡ。以奚质体介导法将重组反义核酸表达载体转染受体细胞ＳＧＣ７９０１，并Ｇ４１８筛选，从２×１０＾５细胞中筛选出大约１５０个抗性克隆，转导率大于１‰，随机挑选２个克隆继续筛选与扩增培养，获得了１株稳定的抗性细胞，从而建立了Ｂｃｌ－２表达阻断的胃癌细胞株，我们命名为７９０１ａｎＢｃｌ－２ｃｅｌｌｓ。通过Ｓｏｕｔｈｅｒｎ印迹法、     

VEGF-C在宫颈癌抗凋亡分子机制中的研究

目的:探讨脂质体介导VEGF-C基因转染人宫颈癌HeLa细胞及其对宫颈癌抗凋亡分子机制的研究.方法:前期构建的真核表达载体pcDNA3.1(+)/VEGF-C,用脂质体介导转染人宫颈癌HeLa细胞,并加压筛选获得转染成功的细胞株,经半定量RT-PCR检测转染后VEGF-C表达水平,ELISA检测培养上清中VEGF-C的表达.对转染成功的细胞检测NF-κB、bcl-2基因的表达.结果:在mRNA水平,转染组VEGF-C明显高于空载体组和未转染组;ELISA检测转染组(678.73±38.92ng/mL),也明显高于空载体组(129.52±50.73ng/ml),和未转染组(123.05±55.83ng/mL),成功构建了高表达VEGF-C的宫颈癌细胞株HeLa/S1;在HeLa/S1组NF-κB的表达(2.06±0.09 vs 1.35±0.02 vs 1.38±0.02P<0.05),bcl-2的表达(2.02±0.67 vs 0.41±0.06 vs 0.37±0.06 P<0.05)明显高于空载体组和未转染组.结论:脂质体介导VEGF-C基因转染人宫颈癌HeLa可显著增加VEGF-C表达,推测高表达的VEGF-C可激活NF-κB,使抗凋亡基因bcl-2高表达,从而促进肿瘤细胞的生长.     

survivin启动子调控siRNA真核表达载体的构建及对HeLa细胞中stathmin基因的干涉作用

目的:探讨survivin基因启动子调控的siRNA真核表达载体对HeLa细胞中stathmin基因表达的肿瘤特异性封闭作用。方法:合成针对人stathmin基因的siRNA cDNA寡核苷酸链退火形成双链,连接入经BamHI和HindIII双酶切后的pSilencer4.1-CMV neo真核表达载体。PCR扩增suvivin基因启动子并测序,用EcoRI和BamHI分别双酶切,连接至经相同内切酶消化的载体,获得survivin启动子调控的siRNA真核表达载体,酶切及测序鉴定。脂质体法转染重组质粒入HeLa细胞,G418筛选。RT-PCR扩增stathmin基因,检测其对stathmin基因表达的干涉效果;流式细胞仪分析转染后HeLa细胞增殖周期的改变。结果:经酶切及测序鉴定,成功构建重组质粒;RT-PCR结果显示所构建的干涉载体可有效封闭stathmin基因表达;流式细胞仪分析结果显示,Hale细胞在stathmin siRNA作用下G2/M期细胞的比例明显增加。结论:survivin基因启动子调控的siRNA真核表达载体可有效地封闭HeLa细胞中stathmin基因表达并使HeLa细胞阻断于G2/M期,为以stathmin基因为靶点的恶性肿瘤生物治疗奠定了理论基础。     

肿瘤相关基因SNC90 cDNA真核细胞表达型重组质粒的构建及其转染研究 *

目的:构建肿瘤相关基因SNC90哺乳动物细胞表达型载体并进行转染研究.方法:肿瘤相关基因SNC90cDNA片断亚克隆至哺乳动物细胞表达型质粒pREP9中,并运用脂质体和电穿孔法将重组质粒pREP9-SN90转入3株人大肠癌细胞中,用G418筛选抗性细胞克隆.结果:重组体pREP9-SN90对SW1116,COLO205和SW620肠癌细胞株克隆形成均有一定的抑制作用,抑制率分别为72.2%,74.2%和59.7%.结论:这提示肿瘤相关基因SNC90对肠癌细胞生长起负性调节作用.     

p16基因对鼻咽癌细胞系CNE-2增殖凋亡的影响

目的 研究ｐ１６基因对人鼻咽癌细胞系ＣＮＥ－２细胞增殖、凋亡的影响。方法 采用脂质体介导的基因转染方法,将野生型ｐ１６基因、空载体转入该基因突变的ＣＮＥ－２细胞中,同时设置不加任何质粒的ＣＮＥ－２细胞作为对照。结果 脂质体转染、Ｇ４１８筛选所获得的抗性克隆,经免疫组化检测证实转入ｐ１６基因的ＣＮＥ－２细胞有ｐ１６蛋白表达,细胞生长速度明显减慢;ＦＣＭ检测显示,细胞周期主要阻滞在Ｇ１期,Ｓ期细胞明显     

EBNA1阳性肿瘤细胞株的建立

目的：建立表达Epstein-Barr(EB)病毒核抗原-l(EBNA1)的肿瘤细胞株，用于EB病毒相关肿瘤的研究。方法：将1200bp的EBNA1基因片段插入真核细胞表达载体pcDNA3中，使用脂质体介导pcDNA3／EBNA1质粒进入人鼻咽癌CNE2细胞和人宫颈癌Hela细胞，通过G418进行阳性克隆的筛选，PCR、RT-PCR进行鉴定。结果：成功建立EBNA1基因阳性的鼻咽癌和宫颈癌肿瘤细胞株，经PCR、RT-PCR检测证明两种转基因细胞株稳定表达EBNA1。结论：EBNA1阳性肿瘤细胞株的建立，为体外进行EB病毒相关肿瘤的研究提供细胞模型：     

TSLC1基因真核表达载体的构建及在HepG2细胞中的表达

Objective： To construct the eukaryotic expression vector for human TSLC1 gene, and to express TSLC1 in HepG2 cells for investigating its effect on HepG2 cell growth. Methods： Full length of TSLC1 cDNA was amplified from RNA of normal human liver by RT-PCR, and cloned into pCI-neo expression vector. The recombinant plasmid pCI-TSLC1 was identified with restriction enzyme and sequenced, and then was stably transfected into HepG2 cells with lipofectamine 2000. The positive clones were examined by western-blotting and immunofluorescence, cell growth was analyzed with MTT assay. Results： The eukaryotic expression vector pCI-TSLC1 was successfully constructed and the stable cell line highly expressing TSLC1 protein was obtained. The growth of TSLCl-transfected cells was significantly suppressed in vitro. Conclusion： The HepG2 stable cell line could highly express TSLC1 protein, which provided a basis for further exploring the roles of TSLC1 in hepatocellular carcinoma.     

抑制ATM表达对60Co照射下宫颈癌细胞损伤修复机制的影响

目的：探讨抑制毛细血管扩张-共济失调突变基因（ataxia-telangiectasia mutated，ATM）表达对人宫颈癌细胞株HeLa在^60Co照射下细胞损伤修复机制的影响。方法：电穿孔法将人ATM基因siRNA的重组真核表达质粒pSup．ATM转染宫颈癌HeLa细胞；G418筛选建立稳定转染株；RT-PCR、Western-blot、免疫荧光法检测ATM基因表达的抑制情况；Western-blot法检测^60Co照射前后各组细胞ATM、p53Ser15磷酸化、CHK2Thr 68磷酸化、p53、CHK2蛋白的表达水平；流式细胞术检测^60Co照射后各组的细胞周期变化。结果：ATM基因在HeLa^ATM细胞中表达明显低于在HeLa、HeLa^ms细胞中的表达水平，成功地建立了ATM低表达的宫颈癌细胞模型。HeLa^ATM细胞在^60Co照射后p53^Ser15磷酸化、CHK2^Thr68磷酸化、p53蛋白表达均显著降低，细胞周期呈现为G2期延长，G1／G2倒置。结论：抑制ATM基因表达可显著抑制宫颈癌细胞对^60Co辐射损伤的修复。这一机制可能与HeLa^ATM细胞中ATM蛋白表达缺失，ATM依赖性的细胞损伤修复通路受阻有关。     

Functional analysis of bladder cancer-related protein gene: a putative cervical cancer tumor suppressor gene in cervical carcinoma.

Our previous study has suggested thatthe bladder cancer-associated protein gene (BLCAP) was among the differentially expressed genes in cervical cancer. We confirm here that BLCAP is expressed in all noncancerous cervical tissues (10/10), but it is greatly lost in primary cervical cancer tissue (31/39). In order to further investigate the functional roles of BLCAP, we stably transfected BLCAP cDNA into HeLa cells. The HeLa cells expressing BLCAP show reduced cell growth and clone genicity compared to the vector-transfected cognate cells. BLCAP expression in HeLa cells leads to growth arrest and significantly enhanced apoptosis in vitro and reduced tumor formation in vivo. Thus, BLCAP might be a potential tumor suppressor gene in cervical carcinoma.     

HPV18 E6E7 反义荧光真核表达载体的构建及其在宫颈癌HeLa 细胞中的表达

 目的 构建HPV18型E6E7反义荧光真核表达载体,并观察其对宫颈癌HeLa细胞中HPV18 E6和E7基因表达的影响,探索反义技术用于治疗临床HPV感染及宫颈癌的可能性。方法 以HPV18型全基因质粒为模板,PCR法扩增HPV18型E6E7区716bp片段,利用基因重组技术将目的片段反向插入荧光真核表达载体pEGFP-C1,EcoR I酶切并测序鉴定;采用脂转法将重组质粒pEGFP-HPV18 E6E7as（EGFP-18AS）转染宫颈癌HeLa细胞株,通过RT-PCR及western blot检测细胞中E6、E7 mRNA和蛋白的表达。结果 成功构建HPV18E6E7反义荧光真核表达载体EGFP-18AS,经脂质体转染HeLa细胞,48h后在荧光倒置显微镜下可见明显的绿色荧光,且细胞中E6、E7 mRNA及蛋白表达水平均明显下调。结论 反义荧光真核表达载体可以有效的抑制HPV18E6、E7癌基因的表达,为治疗HPV感染和宫颈癌提供了一种新的方法。     

NP9基因的克隆及对细胞周期素D1转录活性的影响

背景与目的：NP9基因是我们在鼻咽癌中克隆到的一个新的表达下调的基因(GenBank登录号：BF718797),为了进一步研究该基因的功能,我们构建了人NP9基因编码区序列的真核表达质粒,并研究其表达对细胞周期素D1(cyclinD D1)的影响。方法：通过核苷酸同源序列比较(BlastN)得到NP9 EST的同源cDNA,RT-PCR扩增其编码区序列并构建真核表达重组质粒pRe／CMV2-NP9,脂质体转染后G418筛选出稳定、高效转录NP9基因的细胞克隆;再通过脂质体转染cyclinD D1 promoter Luc和NF-kB—Luc质粒到稳定表达NP9基因的细胞克隆,测定荧光素酶的活性以确定NP9基因对cyclinD D1和NF-kB转录活性的影响;同时亚克隆：NP9基因编码序列到载体pEGFP—C1中,脂质体转染细胞以确定NP9蛋白在细胞中的定位。结果：融合的绿色荧光蛋白出现于细胞核。G418抗性克隆中,RT-PCR扩增证实部分克隆表达NP9基因,且强弱不同。表达NP9基因的细胞克隆在瞬间转染cyclinD D1 promoter Luc和NF-kB-Luc 48h后,荧光素酶的活性较其对照组分别下降46％和63％。结论：NP9蛋白在细胞核内表达;NP9基因通过抑制核转录因子NF-kB的转录活性下调cyclinD D1的表达。     

cyclin G2表达载体的构建及其对人胃癌细胞生长的作用

目的:构建包含人cyclinG2基因的真核表达载体,并探讨其对人胃癌细胞体外生长的作用。方法:从POE4细胞总RNA反转录产物中扩增出cyc-linG2cDNA,亚克隆至双顺反子真核表达载体pIRESneo中获得pIRES-G2重组质粒,基因转染SGC-7901细胞,G418筛选阳性克隆,免疫蛋白印迹杂交方法检测cyclinG2蛋白表达情况,平板克隆形成能力和四甲基噻唑蓝(MTT)比色法对转染后细胞的增殖活性进行分析。结果:成功构建包含cyclinG2基因真核重组表达载体pIRES-G2;转染pIRES-G2的SGC-7901细胞克隆的增殖活性明显下降。结论:cyclinG2基因转染后SGC-7901细胞体外增殖能力下降。     

Down-regulation of the insulin-like growth factor I receptor by antisense RNA can reverse the transformed phenotype of human cervical cancer cell lines

The insulin-like growth factor I receptor (IGF-IR) plays an essential role in the establishment and maintenance of transformed phenotype, and interference with the IGF-IR pathway by antisense or dominant-negative mutants causes reversal of the transformed phenotype in many rodent and human tumor cell lines. We stably transfected an IGF-IR antisense mRNA expression plasmid into human papillomavirus (HPV)-negative C33a cell line, HPV-16-positive SiHa cell line, and HPV-18-positive HeLa S3 cell line to determine whether the IGF-IR could be a target for cervical cancer cells, especially in the presence of HPV. Approximately 30-80% down-regulation of IGF-IR expression was observed by Western blot in antisense transfected clones. There was a little inhibition in monolayer growth in all cell lines. In C33a cells, wild-type and sense clones formed 92-146 colonies in soft agar after 3 weeks; antisense clones formed <12 colonies. In SiHa cells, wild-type and sense clones formed approximately 60 colonies after 5 weeks; antisense clones formed 0-3 colonies. In HeLa S3 cells, wild-type and sense clones formed 218-291 colonies in soft agar after 2 weeks; antisense clones formed 14-160 colonies. There was a good correlation between IGF-IR down-regulation level and inhibition of transformation in soft agar. Tumorigenesis in nude mice was strongly inhibited in HeLa S3 and SiHa clones transfected with the antisense. These results indicate that down-regulation of IGF-IR by antisense RNA can reverse the transformed phenotype of human cervical cancer cells, even when harboring malignant type HPVs.