小鼠IL—3 cDNA转化细胞移植体内表达的初步研究

随着基因治疗技术的发展和多个细胞因子基因的克隆，人们提出了供细胞因子的基因治疗的设想，以期为肿瘤、老年性痴呆、严重的造血功能障碍等这样一类难治疾病的治疗另辟蹊径。为改善放射损伤小鼠受抑制的造血功能，我们采用基因治疗的方法，将小鼠ＩＬ－３基因ｃＤＮＡ与逆转录病毒载体重组，转染包装细胞ＰＡ３１７，用其分泌的含ＩＬ－３ ｃＤＮＡ的复制缺陷逆转录病毒感染、转化ＮＩＨ３Ｔ３细胞，从中筛选可在体外分泌ＩＬ－３     

白细胞介素11基因治疗促进造血的实验研究

白细胞介素１１是一种具有广泛生物学功能的造血生长因子，体内体外实验均显示ＩＬ－１１具有显著的造血促进作用。为了探讨ＩＬ－１１基因治疗应用于造血功能低下疾病的可能性，构建了含人ＩＬ－１１ｃＤＮＡ的逆转录病毒载体，并转染小鼠成纤维系ＮＩＨ－３Ｔ３，经是筛选获得３株表达ＩＬ－１１ 转染细胞亚克隆。     

小鼠IL—3cDNA逆转录病毒载体的榴建有在NIH3TE细胞中的表达

为了探讨放射损伤小鼠ＩＬ－３基因治疗可能性，本文作者将小鼠ＩＬ－３ｃＤＮＡ亚克隆到逆转录病毒载ｐＬＸＳＮ上。将重组的逆转录病毒载体用电穿孔法和磷酸钙共沉淀法转染双向包装细胞系ＰＡ３１７，经新霉素类抗菌Ｇ４１８选择，得到了多个产病毒细胞克隆。用含有复缺陷病毒的产病毒细胞培养上清转化ＮＩＨ３Ｔ３细胞，得到了数个自发分泌ＩＬ－３的克隆。在去掉Ｇ４１８，传代１５代，约２个月后，这些克隆分泌ＩＬ－３的能力没     

IL－3基因疗法对化疗造血损伤的恢复作用

白细胞介素３（ＩＬ－３）是一种具有很强造血调控作用的细胞因子，本实验观察了成纤维细胞介导的ＩＬ－３基因疗法对大剂量环磷酰胺体内注射后造血功能损伤小鼠的恢复作用。结果表明：接受ＩＬ－３基因疗法的实验小鼠外周血白细胞和血小板数量降低程度减弱，回升速度加快，其脾脏和骨髓ＣＦＵ－ＧＭ、ＣＦＵ－Ｅ、ＣＦＵ－ＭＫ、ＣＦＵ－Ｓ水平显著地高于对照小鼠，可见成纤维细胞介导的ＩＬ－３基因疗法可显著地降低大剂量化疗后造血损伤程度，并能显著地促进受损的造血功能尽快恢复，提示若将ＩＬ－３基因疗法与大剂量化疗联合应用将提高肿瘤治疗的效果。     

白细胞介素4基因转移的肿瘤细胞体外生物学特性及体内致瘤性的研究

观察了白细胞介素４（ＩＬ－４）基因转移的肿瘤细胞体内致瘤性的变化。构建了含５００ｂｐ的小鼠ＩＬ－４ｃＤＮＡ的真核表达载体ＢＭＧＮｅｏ－ＩＬ－４．用该表达载体将ＩＬ－４基因转移至小鼠Ｂ１６黑色素瘤细胞，通过Ｇ４１８抗性筛选、有限稀释法及ＩＬ－４活性检测，获得了高分泌ＩＬ－４的黑色素瘤细胞克隆株并经Ｎｏｒｔｈｅｒｎ印迹鉴定，将其接种于小鼠皮下后观察到肿瘤生长缓慢、小鼠存活期延长，表明高分泌ＩＬ－４的细胞克隆株体内致瘤性显著下降。该结果为进一步研究肿瘤的ＩＬ－４基因治疗打下了基础。     

逆转录病毒介导的IL－2和TNF－α融合基因在卵巢癌细胞中的表达及其对肿瘤细胞生长的影响

ＩＬ－４和ＴＮＦ－α是引人注目的抗肿瘤活性因子，两者在抗肿瘤及免疫调节方面具有协同作用。我们利用逆转录病毒载体Ｘｄ１构建了插入ＩＬ－２和ＴＮＦ－α融合基因的重组逆转录病毒载体ＸｄＦ，融合基因包括编码ＩＬ－２前导肽和ＩＬ－２和ＴＮＦ－α成熟肽的序列。重组载体用Ｌｉｐｏｆｅｃｔｉｎ方法引入病毒包装细胞ＰＡ３１７，挑选Ｇ４１８抗性克隆，用ＮＩＨ３Ｔ３细胞测定病毒滴度，获得一滴度为１×１０￣４ＣＦＵ／ｍｌ的高滴度克隆。超速离心浓缩这一重组病毒上清，转导人卵巢癌细胞系ＳＫＯＶ３，经Ｇ４１８筛选获得抗性克隆。ＰＣＲ可从融合基因转导的细胞ＤＮＡ中扩增出１．１ｋｂ的融合基因片断，证明目的基因完整的整合在细胞的基因组ＤＮＡ中，测其上清中的ＩＬ－２和ＴＮＦ－α活性结果显示：ＩＬ－２的活性为８－１５Ｕ／１０￣６ｃｅｌｌｓ／２４ｈ，ＴＮＦ－α的活性为１５０－４００Ｕ／１０￣６ｃｅｌｌｓ／２４ｈ。这一结果表明逆转录病毒介导的融合基因可以在卵巢癌细胞中获得有效表达，表达的融合基因产物在体内和体外部对肿瘤细胞的生长具有抑制作用。     

IL—3基因疗法对化疗造血损伤的恢复作用

白细胞介素３（ＩＬ－３）是一种具有很强造血调控作用的细胞因子。本实验观察了成纤维细胞介导的ＩＬ－３基因疗法对大剂量环磷酰胺体内注射后造血功能损伤小鼠的恢复作用。结果表明：接爱ＩＬ－３基因疗法的实验小鼠外周血白细胞和血小板数量降低程度减弱，回升速度加快，其脾脏和骨髓ＣＦＵ－ＧＭ、ＣＦＵ－Ｅ、ＣＦＵ－ＭＫ、ＣＦＵ－Ｓ水平显著地高于对照小鼠，可见成纤维细胞介导的ＩＬ－３基因疗法可显著地降低大剂量化疗后造     

逆转录病毒介导的β－珠蛋白基因在小鼠骨髓单核细胞的表达

从小鼠Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ股骨分离得到骨髓单核细胞（ｂｏｎｅｍａｒｒｏｗｍｏｎｏｎｕｃｌｅａｒｃｅｌｌｓ，ＢＭＭＣ），并在体外建立了ＢＭＭＣ细胞培养体系。将携带有人β－珠蛋白基因及其增强子的逆转录病毒载体（Ｎ２ＡβＥ３６）经ＤＮＡ磷酸钙共沉淀转染单向性包装细胞系（ψ－２）收集抗Ｇ４１８阳性ψ－２细胞克隆的病毒上清，感染体外培养的ＢＭＭＣ，同时加入白介素－３（Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ－３，ＩＬ－３）、白介素－６（Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ－６，ＩＬ－６）、红细胞生成素（ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｉｅｔｉｎ，Ｅｐｏ）等造血调节因子以促进造血细胞的增殖及提高基因转移的效率。经Ｓｏｕｔｈｅｒｎｂｌｏｔ和Ｎｏｒｔｈｅｒｎ－ｂｌｏｔ分析证实在小鼠ＢＭＭＣ中具有β－珠蛋白基因的整合与表达。     

脂质体介导的IL－2基因疗法的建立及其免疫增强作用

用反相蒸发技术制备出包裹有ＩＬ－２ＤＮＡ的脂质体，将其直接注射至小鼠腹腔中，经１０ｄ后发现，腹腔细胞体外培养的上清中含有较高水平的ＩＬ－２，腹腔巨噬细胞杀伤肿瘤细胞的活性明显增强，脾细胞体外增殖、脾细胞ＮＫ活性及体外诱导的ＬＡＫ活性均明显高于对照组；同时经脂质体转染ＩＬ－２基因的脾脏细胞具有较高的内源性ＬＡＫ活性。这表明，脂质体能将目的基因经腹腔途径直接转染体内细胞，表达出基因产物──ＩＬ－２。这种靶细胞表达的基因产物可作用于体内免疫系统，调节机体的免疫功能。本文结果为细胞因子的基因治疗的研究提供了一种简便有效的方法。     

白细胞介素3基因疗法和白细胞介素6基因疗法的联合造血调控作用

研究了成纤维细胞介导的ＩＬ－３基因疗法，ＩＬ－６基因疗法以两者联合后对造血系统的影响。结果发现，单用ＩＬ－基因疗法的小鼠白细胞总数，中性粒细胞，骨髓ＣＦＵ－ＧＭ，ＣＦＵ－ＭＫ等显著上升，但血小板上升程度经，单用ＩＬ－６基因疗法的小鼠血小板，中性粒细胞，骨髓ＣＦＵ－ＧＭ，ＣＦＵ－ＭＫ上晚为显著。     

逆转录病毒介导的小鼠IL-23基因在小鼠结肠癌细胞中的表达及其抗肿瘤活性

目的：获得表达小鼠IL-23(mIL-23)基因的小鼠结肠癌细胞株。方法：应用逆转录病毒载体，将mIL-23基因导入小鼠结肠癌细胞株Colon26，经G418筛选后获得表达mIL-23的阳性细胞克隆(Colon26／IL-23)。用PCR和RT—PCR检测目的基因的表达，用ELISA法检测mIL-23的产生及mIL-23诱导的小鼠脾细胞IFN-γ的产生，用MTT比色法检测Colon26／IL-23细胞和Colon26细胞的体外增殖，将Colon26／IL-23细胞接种于BALB／c小鼠的右侧背部皮下，观察其致瘤性结果：建立了可表达mIL-23基因的小鼠结肠癌细胞株。分泌至培养上清中的IL-23，可诱导小鼠脾细胞产生IFN-γ在体外Colon26／IL-23细胞的生长与Colon26细胞无明显不同，但其在体内的致瘤性下降，具有抗瘤作用。结论：Colon6／IL-23细胞可分泌IL-23并证明其具有抗瘤活性。     

小鼠白细胞介素-18的cDNA克隆及在真核细胞中初步表达的研究

目的 克隆小鼠白细胞介素－１８（ＩＬ－１８）编码区的ｃＤＮＡ,并实现在真核细胞中的表达。方法 用小鼠白细胞介素 －１８（ｍＩＬ－１８）的ｃＤＮＡ核苷酸序列,设计、合成基因序列特异性引物,应用逆转录多聚酶链反应ＲＴ－ＰＣＲ,以植物血凝（ＰＨＡ）和细胞脂多糖（ＬＰＳ）刺激的小鼠非粘附性脾细胞的ｍＲＮＡ为模板,扩增获得全长ｍＩＬ－１８,转染小鼠成纤维细胞系ＳＶＴ２,并进行ＩＬ－１８生物学活性的检测。结果     

糖基化磷脂酰肌醇修饰的小鼠IL-21瘤苗抗肿瘤效应及其机制初探

目的 构建糖基化磷脂酰肌醇(glycosyl phosphafidylinositol,GPI)修饰的小鼠IL-21瘤苗,并对此瘤苗的抗肿瘤效应及其机制作初步探讨.方法 通过重叠PCR方法获得IL-21-GPI融合基因并将其插入空载体pcDNA3.1.将鉴定过的重组载体以脂质体法转染B16F10细胞制成瘤苗,细胞间接免疫荧光法及流式细胞仪检测转染瘤细胞膜表面IL-21的表达,通过对小鼠脾细胞的增殖作用鉴定表达的IL-21的生物学活性.将瘤苗接种小鼠后,通过观察小鼠肿瘤体积和生存率分析瘤苗的抗瘤性,并检测了瘤苗免疫鼠的细胞免疫活性.结果 正确构建了pcDNA3.1/IL-21-GPI重组载体,膜表达的IL-21有良好的生物学活性,制备的瘤苗能发挥抗肿瘤效应,其机制与免疫鼠细胞免疫活性增强有关.结论 成功构建了具有抗肿瘤活性的GPI修饰的IL-21瘤苗,为其进一步抗肿瘤免疫治疗研究奠定了基础.     

Preliminary study on mouse interleukin-21 application in tumor gene therapy

lnterleukin-21(IL-21)is a recently characterized T cell-derived cytokine with a significant homology to IL-2,IL-4 and IL-15.To determine whether IL-21 has broad immunoregulatory activity and can stimulate durableantitumour responses,we constructed mouse IL-21(mIL-21) recombinant plasmid and evaluated its antitumorefficacy.Mouse IL-21 cDNA was amplified from Con A-activated mouse T cells by RT-PCR.RecombinantpcDNA3.1/mIL-21 was constructed and transfected into Sp2/0 cells.Mouse IL-21 expression was analyzed byWestern blotting and its activities were detected by ~3H-TdR incorporation and MTT assay.The recombinantpcDNA3.1/mIL-21 was injected s.c.into tumor lump.Tumor size,weight,the activities of CTLs,NK cells andLAK cells and serum IFN-γ,level were measured for evaluating mIL-21 mediated antitumor responses.Theresults indicated that mIL-21 was correctly expressed in Sp2/0 cells and it can improve the proliferation of Tcells and B cells,and enhance NK cytotoxic activity in vitro.The activities of CTL and NK cells,and serumIFN-γlevel were significantly improved,furthermore the tumor growth was obviously suppressed inpcDNA3.1/mIL-21 treated mice.However,the LAK activity did not alter significantly.Taken together,thisstudy suggests that the injection with recombinant plasmid containing mIL-21 is a potential approach fortumor gene therapy.Cellular & Molecular Immunology.2004;1(6):461-466.     

小鼠IL-3 cDNA逆转录病毒载体的构建及在NIH3T3细胞中的表达

为了探讨放射损伤小鼠IL-3基因治疗可能性,本文作者将小鼠IL-3cDNA亚克隆到逆转录病毒载体pLXSN上。将重组的逆转录病毒载体用电穿孔法和磷酸钙共沉淀法转染双向包装细胞系PA317,经新霉素类抗菌素G418选择,得到了多个产病毒细胞克隆。用含有复制缺陷病毒的产病毒细胞培养上清转化NIH3T3细胞,得到了数个自发分泌IL-3的克隆。在去掉G418,传代15代,约2个月后,这些克隆分泌IL-3的能力没有明显的变化。     

小鼠白细胞介素23基因在毕赤酵母中的诱导表达及初步活性研究

目的:克隆小鼠白细胞介素23(mice interlecukin-23,mIL-23)基因,构建高效稳定的毕赤酵母表达菌株,并对得到的蛋白进行生物活性的初步测定。方法:采用聚合酶链式反应(PCR)技术从pcDNA3-mIL-23上分别扩增获得IL-23的两亚基p19和p40,并通过重叠PCR(over-lap PCR)技术获得含有连接子的p1940,构建pPICZαA-IL-23重组质粒;采用甲醇诱导毕赤酵母表达重组蛋白,MTT方法检测诱导表达蛋白的促淋巴细胞增殖情况。结果:SDS-PAGE分析显示在诱导24小时和36小时后的上清及24～96小时的沉淀中均可以检测到约70 kD的诱导条带。Western blot印迹法证实了重组蛋白为特异性蛋白。上清和沉淀中表达的重组蛋白IL-23能促进外周血单个核细胞的增殖,OD570 nm分别达到(0.235±0.029)和(0.216±0.035),而未刺激的对照组只有(0.135±0.008)和(0.164±0.017)。结论:成功构建出mIL-23的酵母表达载体,诱导产生的蛋白可以明显地促进外周血单个核细胞的增殖。     

mIL-21基因治疗小鼠肿瘤及其机制的初步研究

建立小鼠Sp2/0皮下肿瘤模型,以我们构建并鉴定过的真核表达质粒peDNA3.1/mIL-21在瘤体内直接注射,考察mIL-21基因治疗对小鼠Sp2/0肿瘤的疗效。结果显示pcDNA3.1/mIL-21质粒治疗对小鼠皮下Sp2/0肿瘤有一定的生长抑制作用,CTL和NK细胞毒活性明显增强,IFN-γ分泌升高显著,但抗体无明显升高。表明mIL-21基因治疗的抗肿瘤效应,可能和细胞免疫功能增强有关。     

通过维持微环境IL－2水平抑制肿瘤形成

为研究肿瘤微环境中ＩＬ－２对肿瘤生长的抑制效应，用转基因方法，将携带ｍＩＬ－２ｃＤＮＡ基因的牛乳头瘤病毒载体（ＢＣＭＧ）转染小鼠Ｂ１６瘤细胞，获稳定持久分泌ｍＩＬ－２的Ｂ１６细胞株（ｍＩＬ－２＋Ｂ１６）。动物实验结果显示：ｍＩＬ－２＋Ｂ１６细胞的致瘤性明显下降，但体外生长率与其亲代Ｂ１６细胞相比较无区别。用ｍＩＬ－２＋Ｂ１６细胞诱导的小鼠腹腔渗出细胞（ＰＥＣ）对ＹＡＣ－１靶细胞和Ｂ１６靶细胞的体外杀伤能力比对照组ＰＥＣ（Ｂ１６诱导的ＰＥＣ）高一倍以上（Ｐ＜０．０１）。表明提高微环境中的ＩＬ－２水平能提高抗肿瘤免疫细胞对肿瘤细胞的杀伤能力，从而抑制肿瘤的形成。     

通过维持微环境IL－2水平抑制肿瘤形成

为研究肿瘤微环境中ＩＬ－２对肿瘤生长的抑制效应，用转基因方法，将携带ｍＩＬ－２ｃＤＮＡ基因的牛乳头瘤病毒载体（ＢＣＭＧ）转染小鼠Ｂ１６瘤细胞，获稳定持久分泌ｍＩＬ－２的Ｂ１６细胞株（ｍＩＬ－２＋Ｂ１６）。动物实验结果显示：ｍＩＬ－２＋Ｂ１６细胞的致瘤性明显下降，但体外生长率与其亲代Ｂ１６细胞相比较无区别。用ｍＩＬ－２＋Ｂ１６细胞诱导的小鼠腹腔渗出细胞（ＰＥＣ）对ＹＡＣ－１靶细胞和Ｂ１６靶细胞的体外杀伤能力比对照组ＰＥＣ（Ｂ１６诱导的ＰＥＣ）高一倍以上（Ｐ＜０．０１）。表明提高微环境中的ＩＬ－２水平能提高抗肿瘤免疫细胞对肿瘤细胞的杀伤能力，从而抑制肿瘤的形成。     

Immunogene therapy of murine fibrosarcoma using IL-15 gene with high translation efficiency.

We have recently found that translational efficiency is up-regulated by an alternative exon in IL-15 mRNA in mice. In a malignancy model using BALB/c mice and syngeneic Meth A fibrosarcoma (Meth A), we successfully applied immunological gene therapy with IL-15 protein using alternative IL-15 cDNA with high translational efficiency. Two expression vectors carrying the murine IL-15 gene were constructed for use in tumor immunotherapy, one utilizing IL-15 cDNA with alternative exon 5 and the second utilizing IL-15 cDNA with normal exon 5. The first vector induced the production of a large amount of IL-15 protein in Meth A cells, whereas tumor cells transfected by the second vector produced only a marginal level of IL-15 protein. Although cell growth of both transfectants in vitro remained unchanged, inoculation of clones transfected with normal IL-15 cDNA resulted in progressive tumor growth, while clones transfected with alternative IL-15 cDNA led to the rejection of the tumor. The clone producing high levels of IL-15 grew progressively in nude mice and mice treated with anti-CD4 monoclonal antibodies (mAb), whereas the growth of the transfectants was retarded in anti-CD8 mAb- or anti-asialo GM1 antibody-treated mice. Cured mice were shown to have generated immunity against a subsequent challenge with the wild type of Meth A but not against Meth 1 tumor cells, another type of fibrosarcoma derived from BALB/c mice. Thus, tumor therapy based on IL-15 gene transfection was effective against Meth A tumor cells, suggesting a possible application to human neoplasms.