土拉弗朗西斯氏菌PCR—EIA检测技术的研究

目的：建立操作简便、结果客观的微孔板杂交－酶联显色检测土拉弗朗西斯拉菌ＰＣＲ产物的技术。方法；将ＰＣＲ产物或产物的克隆作为捕获探针包被聚乙烯微孔板，ＰＣＲ引物５‘末端生物素标记，扩增后用作探针杂交，通过比较影响微孔板杂交的包被，杂交和显色等因素，建立ＰＣＲ－ＥＩＡ技术。结果：通过比较包被缓冲液发现镁离子及其离子强度是影响ＤＮＡ包被的重要；包被的ＤＮＡ以线型质粒较佳，每孔包被３００ｎｇ左右的ＤＮＡ包     

生物素—亲和素技术的研究进展

生物素 (biotin,B) -亲和素 (avidin,A)技术 (以下简称 BA技术 )是近几年来发展很迅速的一门生物学技术。其原理基于生物素与亲和素的以下特征 :(1)二者具有高度的特异的亲和性。生物素为小分子物质 ,现已能人工合成。亲和素有卵白素 (又称亲和素 )和链霉亲和素。生物素与 (链霉 )亲和素之间的亲和性 ,至少是抗原 (Ag)抗体 (Ab)间的一万倍以上 ,且不易受外界干扰 ,复合物稳定。 (2 )桥联作用。二者均可偶联蛋白质、核酸、多糖和酶等生物活性物质 ,同时还能与固相材料结合 ,通过这些特性可将它们偶联起来。 (3)多级放大作用。一个蛋白质 (…     

复合探针荧光定量PCR检测土拉弗朗西斯菌

目的:建立检测土拉弗朗西斯菌复合探针荧光定量PCR方法。方法:对土拉弗朗西斯菌的FopA基因设计引物和探针,用荧光定量PCR检测,并对特异性、灵敏度和重复性进行评价。结果:本方法对所试验的土拉弗朗西斯菌纯培养物的最低检测浓度为100 CFU/ml,定量的检测变异系数小于5%。在模拟的污染血液样品中的检出限为1×103 CFU/ml。结论:本文建立的复合探针荧光定量PCR方法能高效、敏感、特异地检测土拉弗朗西斯菌。     

生物素—亲和素系统检测食品中黄曲霉毒素B_1的研究

建立了ABC—ELISA检测食品中AFB_1的方法,最小检测值0.01ng/孔,灵敏度比普通ELISA高10倍,检测时间缩短1h。方法灵敏、特异、简便、快速,样品提取液可直接用于测定。对抗体标记生物素的方法、溶剂影响、反应时间等作了较详细的讨论。对3类食品(83份样品)加标回收率为70-100％,变异系数为7.7 17.3％。将本法测得的12个玉米样品中AFB-1值与国家标准检测法测得的值作配对资料的t检验,P>0.05,说明两种方法测得结果间的差异无显著性。     

土拉弗朗西斯菌病的特征与防治

土拉弗朗西斯菌病为一种自然疫源性急性传染病,分布广泛.本文较系统地阐述了土拉弗朗西斯菌病的病原学和流行病学特征、发病机理与病理改变、临床表现与分型、实验室检测技术、临床诊断与治疗和预防控制措施,为我国深入研究与防治提供了参考依据.     

中国土拉弗朗西斯菌holarctica亚种的遗传多样性

目的 研究国内外土拉弗朗西斯菌的遗传进化关系。方法 选择17个单核苷酸多态性、4个插入/缺失和12个可变数目串联重复,采用单核苷酸多态性和插入/缺失、多位点可变数目串联重复分析方法单独和组合起来对39株土拉菌(10株中国土拉菌和29株已公布测序的土拉菌)进行系统进化分析。结果 组合分析显示,3株中国土拉菌和日本的FSC022被分配到B5;剩余3株中国土拉菌和瑞典的FSC200被分配到B1;3株和美国的OSU18被分配到B2;1株和法国的FTNF002-00、德国的F92与美国的OR96246一起被分配到B4。10株中国土拉菌分为4种亚型,研究表明中国土拉菌具有广泛的遗传多样性。结论 本研究针对土拉菌B型建立了一套简易高效的分型方法,并以此为基础得出土拉菌B型的起源可能是亚洲地区。     

悬浮芯片法与生物素-亲和素ELISA法检测炭疽杆菌芽孢比较研究

〔目的〕建立快速、敏感、特异、高通量、同时检测多种病原体的技术方法。〔方法〕建立基于双抗体夹心免疫学检测的编码微球悬浮芯片和生物素-亲和素ELISA方法,比较2种方法对炭疽芽孢杆菌定量检测以及直接从＂白色粉末＂样品中检测的能力。〔结果〕悬浮芯片对炭疽杆菌芽孢检测具有很好的敏感性和特异性,最低检出限为4.2×103cfu/ml,动态范围为103-107cfu/ml;生物素-亲和素ELISA最低可以检测到1.4×104 cfu/ml,线性范围为104-107cfu/ml。〔结论〕悬浮芯片方法检测炭疽杆菌芽孢比ELISA方法具有更高的灵敏度和更宽的动态检测范围,在病原菌的早期识别、快速诊断、应对生物恐怖威胁、控制传染病爆发中具有广阔的应用前景。     

HCV抗原ABS-ELISA检测方法的建立及初步评价

目的 建立新的HCV抗原生物素-亲和素-酶联免疫检测方法(ABS-ELISA).方法 将生物素-亲和素系统与酶联免疫技术相结合,建立用于丙型肝炎病毒抗原检测的方法,分析检测方法的灵敏度、特异度、稳定性及精确度等主要技术指标,并对应用效果进行评价.结果 建立的检测方法,对40余种肠道病毒样品均无交叉反应,在第二代HCV-RNA国家标准品的10份阴性标准品中,未检出HCV-Ag阳性样品,在10份HCV-RNA阳性标准品中,检出6份HCV-Ag阳性的样品,表现出良好的特异性；检测试剂CV平均值为6.28％,精密性好；在90份HCV抗体阳性样品中检测出HCV-RNA样品67份(74.44％),检出HCV游离抗原阳性样品30份(33.33％)、HCV总抗原阳性样品68份(75.56％),HCV游离抗原与HCV-RNA两个指标检出率差异有统计学意义(x2=22.443,P＜0.01),但HCV总抗原与HCV-RNA检测结果之间差异无统计学意义(x2=0.037,P＞0.05)；以HCV-RNA检测试剂为金标准,所建立的ABS-HCV抗原检测试剂总抗原检测结果的一致性、灵敏度、特异度、阳性预测值及阴性预测值分别为98.03％、80.60％、98.93％、79.41％、99.00％.结论 新建立的HCV抗原ABS-ELISA检测方法特异性好,其灵敏度与荧光定量PCR相近.     

一种简便快速的血清HBsAg检测方法:标记抗生物素——生物素斑点酶联免疫吸附试验(LAB-Dot ELISA)

应用标记抗生物素一生物素斑点酶联免疫吸附试验检测了190例血清HBsAg,检出HBsAg最低浓度可达0.01μg/ml,较反向间接血凝法(RPHA)敏感8~16倍,具有一定的特异性及重复性。本方法简便经济,需时仅3小时,并可在点样后室温贮存一月以上再检测,携带方便,特别适于流行病学调查。     

差分脉冲和方波伏安法研究亲和素-生物素固载ssDNA的生物传感器

目的:建立一种新型的DNA检测技术,能快速、灵敏的识别目的DNA。方法:生物素标记的ssDNA通过生物素-亲和素体系固载到Pt电极上,制作了DNA传感器,[Co(phen)3]3+作指示剂,用差分脉冲伏安法(DPV)和方波伏安法(SWV)对此传感器进行研究。结果:在pH 6.8~7.0,[Co(phen)3]3+浓度80μmol/L条件下,杂交前后指示剂峰电流的差值与溶液中互补DNA的浓度有良好的线性关系,DPV法测量起始子的线性范围是8.0×10-9~2.8×10-8mol/L,终止子的线性范围是7.2×10-9~7.2×10-8mol/L;SWV法测量起始子的线性范围是8.5×10-9~3.5×10-8mol/L,终止子的线性范围是7.2×10-9~9.0×10-8mol/L。两种检测方法均能很好的识别样品中的DNA片断。结论:该方法测量灵敏度高,能很好地识别转基因食品中的特异DNA序列。     

聚合酶链反应和平板计数检测土拉弗氏菌气溶胶稳定性的比较

为了提高检测生物气溶胶的特异性和敏感性，分别用平板计数和聚合酶链反应（ＰＣＲ）对土拉弗氏菌气溶胶的稳定性进行了研究。结果表明ＰＣＲ对细菌数目的估计高于平板计数结果，并且ＰＣＲ在采样后的３ｈ就可以得出定性结果，而土拉弗氏菌平板计数则需要３～７天。     

建立固相酶联免疫吸附试验技术诊断社区糖尿病患者人巨细胞病毒活动性感染

目的建立检测人巨细胞病毒(HCMV)抗原特异性IgM的抗体捕捉酶联免疫吸附试验(Capture-ELISA),并分析糖尿病患者HCMV活动性感染状态。方法利用抗人IgM(μ链特异性)抗体包被固相载体,作为捕捉抗体吸附待检血清中的IgM,经过洗涤除去血清中IgG及其他成分,再加入特异性抗原与捕捉到的相应IgM抗体结合,然后加入酶标抗体和底物显色进行测定;同时,应用建立的酶联免疫捕获法诊断糖尿病患者HCMV近期感染状态,并与常用的间接酶联免疫吸附试验(In-ELISA)及RT-PCR进行比较。结果 Capture-ELISA的特异性及敏感性均高于间接法,且不受RF因子的影响。结论 Capture-ELISA操作简单、快速,且具有较高的特异性和灵敏度,是检测IgM抗体理想的方法之一。     

毒死蜱单克隆抗体的制备及ELISA检测方法研究

[目的]制备毒死蜱单克隆抗体,为建立毒死蜱残留检测方法奠定基础。[方法]以毒死蜱原药与3-巯基丙酸为起始原料,合成半抗原并对其进行结构鉴定。利用该半抗原与牛血清蛋白（BSA）和卵清蛋白（OVA）偶联制备毒死蜱人工免疫抗原和包被抗原,再取已免疫的经过筛选的Balb／c小鼠脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞SP2／0融合,用间接ELISA和间接竞争ELISA方法对2株细胞进行鉴定,并测定与其他农药的交叉反应率。[结果]获得两株稳定分泌毒死蜱单克隆抗体的细胞株,其检测范围为0．04～0．42mg／L,半数抑制浓度为0．135mg／L,最低检测限为0．03mg／L,与杀螟硫磷、对硫磷和马拉硫磷几乎没有交叉反应。[结论]成功制备两株分泌毒死蜱抗体的单克隆细胞株,初步建立了毒死蜱间接ELISA检测方法。     

海水和贝类中软骨藻酸的酶联免疫吸附分析方法研究

目的建立间接竞争酶联免疫吸附分析(ELISA)方法测定海水样品和海洋贝类中赤潮毒素记忆缺失性贝毒主要成分软骨藻酸(DA)。方法采用碳二亚胺法,将半抗原DA分别与载体蛋白卵清蛋白(OVA)和牛血清白蛋白(BSA)偶联,得到包被抗原和免疫抗原。以DA-BSA做为免疫抗原,免疫BALB/c小鼠,制备多克隆抗体,建立间接竞争ELISA方法分析检测海水样品和海洋贝类中的软骨藻酸。结果最低检出限为10.0ng/ml(对于贝相当于4μg/g);海水样品回收率为83.2%～124.7%,批内变异系数在4.7%～5.9%之间;贝类样品回收率为85.9%～99.9%,批内变异系数2.4%～7.1%之间。结论建立的ELISA方法检测海洋贝类中DA可以满足国际规定的安全限值。     

b型流感嗜血杆菌多糖竞争ELISA检测方法的建立

目的 建立竞争酶联免疫吸附分析法(Enzyme-Linked Immunosorbent Assay,ELISA),测定b型流感嗜血杆菌多糖(PRP)浓度方法以b型流感嗜血杆菌多糖-酪胺(Ty)为包被抗原,待测多糖为竞争抗原,与优化的抗b型流感嗜血杆菌多糖抗体反应,建立标准曲线,并验证该方法的准确性和精密度.结果 优化后的b型流感嗜血杆菌多糖-酪胺包被浓度为1∶400倍稀释,抗多糖血清稀释度为1∶40K.检测线性范围6.25μg/ml～100μg/ml,最低检测限为3.13μg/ml,回归方程为B/B0=-34.328[PRP]+105.03,线性相关系数为R2 =0.995.批内精密度为3.4％～6.5％,批间精密度为8.48％,测定培养基中b型流感嗜血杆菌多糖的回收率为95.7％.结论 本研究建立的b型流感嗜血杆菌多糖竞争ELISA方法准确性和精密性均较好,可以特异性地检测b型流感嗜血杆菌多糖浓度.     

b型流感嗜血杆菌多糖竞争ELISA检测方法的建立

目的建立竞争酶联免疫吸附分析法（Enzyme-Linked Immunosorbent Assay,ELISA）,测定b型流感嗜血杆菌多糖（PRP）浓度。方法以b型流感嗜血杆菌多糖-酪胺（Ty）为包被抗原,待测多糖为竞争抗原,与优化的抗b型流感嗜血杆菌多糖抗体反应,建立标准曲线,并验证该方法的准确性和精密度。结果优化后的b型流感嗜血杆菌多糖-酪胺包被浓度为1∶400倍稀释,抗多糖血清稀释度为1∶40 K。检测线性范围6.25μg/ml~100μg/ml,最低检测限为3.13μg/ml,回归方程为B/B0=-34.328[PRP]＋105.03,线性相关系数为R2=0.995。批内精密度为3.4%~6.5%,批间精密度为8.48%,测定培养基中b型流感嗜血杆菌多糖的回收率为95.7%。结论本研究建立的b型流感嗜血杆菌多糖竞争ELISA方法准确性和精密性均较好,可以特异性地检测b型流感嗜血杆菌多糖浓度。     

汉坦病毒N蛋白的重组表达及其用于IgM直接捕捉ELISA的建立和应用

目的克隆并表达汉坦病毒（HV）Z10株（HV—Z10）N蛋白（NP）编码基因，建立基于辣根过氧化酶（HRP）标记重组NP（rNP）的rNP—IgM直接捕捉ELISA，检测肾综合征出血热（HFRS）患者血清并评价其检测效果。方法PCR扩增HV—Z10株NP编码基因，基因工程方法构建NP编码基因原核表达系统pET28a—Z10N—E．coli BL21DE3。SDS-PAGE了解rNP表达情况，离子交换法和Ni—NTA亲和层析法提纯rNP。Western blot检测rNP的特异性免疫反应性。建立HRP标记rNP—IgM直接捕捉ELISA检测HFRS患者血清样品，并与常规HV—IgM间接捕捉ELISA进行比较。结果pET28a—Z10N—E．coli BL21DE3高效表达rNP。提纯rNPSDS-PAGE显示单一蛋白条带，HV-IgG能有效识别rNP并与之结合。94．73％（90／95）HFRS患者血清样品rNP—IgM直接捕捉ELISA检测结果阳性，HV—IgM间接捕捉ELISA阳性率为92．63％（88／95）。两种IgM捕捉ELISAs检测的HFRS患者血清样品A450值分布及对多份不同稀释度血清检测的A450，均值变化均相似。结论成功构建了HV—Z10株NP编码基因高效原核表达系统。所建立的rNP—IgM直接捕捉ELISA可作为HFRS简便、安全、敏感、特异的血清学诊断新方法。     

ELISA法与2种GICA法检测丙型肝炎病毒抗体结果分析

目的分析探讨ELISA法(酶联免疫吸附试验)和GICA法(胶体金免疫层析试验)两种试纸条检测抗-HCV阳性标本的结果符合率及GICA法检出率较低所产生的原因,以对检测方法和试剂作出正确的选择。方法采用ELISA法和GICA法两种试纸条对134份抗-HCV阳性标本进行检测,并将所测结果进行比较。结果 ELISA、GICA法(英科)、GICA法(爱德)阳性率分别为96.3%、93.3%、76.9%,以ELISA法为标准做统计,GICA法(英科)检测结果差异无统计学意义(P0.05),GICA法(爱德)检测结果差异有统计学意义(P0.01),两种试纸检测的灵敏度及符合率分别为GICA法(英科)为96.9%、97.0%,GICA法(爱德)为79.8%、80.6%,两种试纸条的特异性均为100%。结论 (1)GICA法灵敏度和符合率均较ELISA法低,而不同厂家生产的GICA法试纸条其敏感度与准确度也存在着较大的差异,检测抗-HCV阳性标本时存在一定的漏检,CICA法仅能作为筛查试验或辅助ELISA法复检阳性标本。(2)在考虑单次成本及阳性检出率的前提下,ELISA法仍为抗-HCV检测的首选方法。