蚯蚓溶栓酶对大鼠凝血及纤溶指标的影响

低剂量的溶栓酶用于大鼠能引起纤维蛋白原（Ｆｂｇ）平均下降４５％，凝血酶时间（ＴＴ）由１１．１３秒延长到２２．６３秒（Ｐ＜０．０１），而凝血酶原时间（ＰＴ）及白陶土部分凝血活酶时间（ＫＰＴＴ）无显著性变化（Ｐ＞０．０５）。但高剂量的溶栓酶除能明显降低Ｆｂｇ和延长ＴＴ外，而且可使ＰＴ由１６．８２秒延长到７３．４４秒及ＫＰＴＴ由４６．６３秒延长到１２４．１３秒，并能使Ⅱ、Ⅷ因子降解，起到强的抗凝效果     

蚯蚓纤溶酶分离及部分生化性质的研究

采用亲合层析法对蚯蚓纤溶酶进行初步纯化,并对其生化特性进行鉴定。结果表明：经纯化的蚯蚓溶酶其分子量在20KD－30KD之间,对人血纤维蛋白平板具有良好的溶解作用,并考察了其热稳定性。纤溶酶能激活血栓中的纤溶酶原,从而使血栓溶解,直接作用于血栓表面,使形成血栓的纤维蛋白溶解成小分子,达到抗血栓之目的。     

蚯蚓纤溶酶部分质量标准的研究

采用亲和层析、凝胶层析对蚯蚓粗提液进行分离、纯化,得到蚯蚓纤溶酶纯化样品,并对其活性、含量、纯度等检测方法进行了试验研究,确定HPLC、SDS-PAGE电泳、280nm紫外吸收、琼脂糖-纤维蛋白平板法分别为蚯蚓纤溶酶的纯度、相对分子量、含量及活性的检测方法.同时又对纯化的蚯蚓纤溶酶进行了N-末端的测序,获得了重要的蚯蚓纤溶酶分子生物学的研究资料.     

蚯蚓纤溶酶部分质量标准的研究

采用亲和层析、凝胶层析对蚯蚓粗提液进行分离、纯化，得到蚯蚓纤溶酶纯化样品，并对其活性、含量、纯度等检测方法进行了试验研究，确定HPLC、SDS—PAGE电泳、280nm紫外吸收、琼脂糖-纤维蛋白平板法分别为蚯蚓纤溶酶的纯度、相对分子量、含量及活性的检测方法。同时又对纯化的蚯蚓纤溶酶进行了N-末端的测序，获得了重要的蚯蚓纤溶酶分子生物学的研究资料。     

蚯蚓纤溶酶分离及部分生化性质的研究

采用亲合层析法对蚯蚓纤溶酶进行初步纯化,并对其生化特性进行鉴定.结果表明经纯化的蚯蚓纤溶酶其分子量在20KD-30KD之间,对人血纤维蛋白平板具有良好的溶解作用,并考察了其热稳定性.纤溶酶能激活血栓中的纤溶酶原,从而使血栓溶解,直接作用于血栓表面,使形成血栓的纤维蛋白溶解成小分子,达到抗血栓之目的.     

蚯蚓纤溶酶去糖基化和免疫反应性分析

 目的对去糖基化的蚯蚓纤溶酶进行免疫反应性分析。方法①将变性的蚯蚓纤溶酶全组分与免疫佐剂混合,免疫家兔制得抗血清,酶联免疫吸附剂测定(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)和Western-blotting检测抗血清的效价。②三氟甲基磺酸去除蚯蚓纤溶酶全组分及6.5#,7#单组分的糖链,SDS-PAGE和ConA-HRP亲和印迹检测糖链的去除情况。③ELISA和Western-blotting检测糖链去除前后蚯蚓纤溶酶免疫反应性是否有变化。结果去除糖链后蚯蚓纤溶酶全组分及6.5#,7#单组分的免疫反应性基本没有变化。结论糖链的存在与否对蚯蚓纤溶酶组分免疫反应性的影响不大,提示蚯蚓纤溶酶分子上的寡糖链可能不构成其抗原决定簇。     

纤维蛋白酶谱检测蚯蚓纤溶酶组分

 目的建立鉴定蚯蚓纤溶酶粗酶液中活性组分的方法。方法根据蚯蚓纤溶酶能水解纤维蛋白的性质,建立了纤维蛋白-十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(Fibrin-SDS-PAGE),优化了电泳条件,电泳后酶所在部位为透明区带。结果分离胶中纤维蛋白终质量浓度为0.4×10^-3mg·L^-1,电泳后胶板用2.5% TritonX-100复性30min,PBS缓冲液(pH7.2)保温30min,考马斯亮蓝R-250染色,7%醋酸脱色,可以得到清晰的酶谱。结论该方法灵敏度高,用2μg样品,就能准确检测出粗酶液中所有纤溶酶组分。     

一种新型蚯蚓纤溶酶的研究

采用加提取剂的匀浆、盐析、超滤及层析方法从一种环毛蚓中获得一种新型纤溶酶。此酶分子量为22000,为单链蛋白。它不仅有强烈的直接溶解血栓及人纤维蛋白活性,而且还有纤溶酶原激活作用;动物试验表明此酶的毒副作用很小。本方法获得的酶的活性、纯度及得率都很高。     

蚯蚓纤溶酶抗肝癌转移作用的实验研究

目的 探讨蚯蚓纤溶酶(earthworm fibrinolytic enzyme,EFE)对人肝癌细胞转移的影响.方法 建立裸鼠人肝癌高转移原位移植瘤模型,造模后7 d将裸鼠随机分为模型对照组和EFE高、低剂量组,共3组,每组7只,每天分别给予生理盐水和1600,800 uku/kg EFE灌胃,连续30 d.实验结束时完整剥除种植瘤并称重;肉眼直接观察种植瘤的肝内播散及腹腔种植情况,计算肝内播散率及腹腔种植率;通过病理切片观察肺转移肿瘤灶的数目;采用RT-PCR及Western blot方法检测移植瘤中FAK(focus adhesion kinase)及β1-整合素蛋白的表达.结果 与模型对照组相比,EFE低、高剂量组原位种植瘤瘤重减轻(P＜0.05或P＜0.01);种植瘤肝内播散率和腹腔种植率降低,其中,EFE高剂量组与模型对照组比较,具有显著性差异(P＜0.05);肺转移灶数目明显减少,与模型对照组相比,具有显著性差异(P＜0.05或P＜0.01).在原位种植瘤和移植瘤中FAK及β1-整合素在mRNA及蛋白水平的表达方面,EFE高、低剂量组的表达均明显下降,与模型对照组比较具有非常显著性差异(P＜0.01).结论 EFE具有抗肝癌转移的作用,其机理可能与EFE能够抑制FAK及β1-整合素的表达有关.     

中药地龙中溶栓成分研究进展

对近年来国内外地龙中溶栓成分(蚓纤溶酶、蚓激酶、蚓胶原酶)的研究情况进行归纳,介绍了地龙中溶栓成分的性质、分离纯化技术及开发应用状况,并提出了目前研究工作的不足和今后的发展方向。     

地龙的鲜品和干品可溶性蛋白及纤溶酶活性的对比研究

目的:对比研究地龙的鲜品和干品的可溶性蛋白及纤溶酶活性.方法:采用Bradfold方法测定蛋白含量,SDS-PAGE进行蛋白谱带的分析,并采用琼脂糖-纤维蛋白平板法进行纤溶酶活性的测定.结果:以干燥品计,鲜品的蛋白提取率为( 13.89±0.86)％,蛋白含量为(63.14±0.38)％,体外纤溶酶活性为(8 743 ±17) IU·g-1;干品蛋白提取率为(9.82±0.75)％,蛋白含量为(45.16 ±0.12)％,体外纤溶酶活性为(206±14) IU·g-1;SDS-PAGE凝胶电泳结果显示,鲜品共显示12条蛋白谱带,干品的谱带较少,且不清晰.结论:鲜地龙的可溶性蛋白提取率、含量及体外纤溶酶活性均明显高于干品,且蛋白组分有较大的差异.     

豆豉纤溶酶的分离纯化及部分酶学性质研究

 目的 从豆豉中分离出具有强纤溶活性的菌株,从该菌株的发酵液中纯化出纤溶酶并对此纤溶酶的部分酶学性质进行研究。方法 利用硫酸铵盐析、DEAE-Sepharose Fast Flow阴离子交换色谱和Sephadex G-75凝胶过滤色谱等方法进行纯化;利用N-末端氨基酸序列测定及基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)对此酶进行鉴定。结果 从发酵液中获得了纤溶酶单一组分,表观相对分子质量为30×10³。该纤溶酶在50 ℃以下和pH 7.0~9.0之间保持稳定,最适温度为35 ℃;最适pH为8.6。N-末端氨基酸序列及飞行时间质谱测定结果都表明该酶与纳豆激酶氨基酸序列有着极高的相似性。结论 获得了纤溶酶单一组分,为纤溶酶发酵产品的大规模纯化和进一步研制开发新的溶栓药物提供重要理论依据。     

基因重组沙蚕纤溶活性蛋白的克隆、表达和活性检测

 目的从双齿围沙蚕消化道中克隆并表达具有纤维蛋白溶解活性的蛋白。方法提取沙蚕消化道上皮细胞RNA,逆转录获得cDNA。根据丝氨酸蛋白酶家族基因保守序列设计兼并引物,筛选包含丝氨酸蛋白家族保守位点的阳性克隆,进行核苷酸测序。根据该序列利用5′RACE技术进行扩增,将获得的基因片段克隆到pMAL-p2载体中,在大肠杆菌BL21中进行融合表达。表达的融合蛋白经过直链淀粉树脂亲和色谱和DEAE-Sepharose 4B纯化后,纤维蛋白平板法检测其溶栓活性。结果cDNA经5′RACE扩增获得长度为260 bp的基因片段,推测其包含可编码83个氨基酸的完整序列(约9.0×10³);重组pMAL-p2表达出51.0×10³的融合蛋白,经过测定具有明显的溶栓活性。结论从双齿围沙蚕中克隆获得的基因片段表达的融合蛋白具有溶栓活性,有望成为一种新型的纤溶药物。     

地龙抗血栓有效部位的提取方法初探

目的:考察地龙中抗血栓有效部位的提取方法。方法:分别用水和50%、70%、80%乙醇,渗漉,水提取、50%醇沉以及稀HCl和磷酸缓冲液提取物进行体外对兔血凝血酶原时间的影响和抗凝血酶作用试验。结果:从抗凝血试验看,地龙的乙醇渗漉液优于地龙的水提液。结论:以70%乙醇对地龙进行渗漉提取方法简便,适于工业化生产。     

鲜地龙平喘活性蛋白提取工艺研究

目的:确定鲜地龙平喘活性蛋白的最佳提取工艺条件。方法:以哮喘潜伏期为评价指标,通过平喘活性考察影响蛋白活性的因素;以蛋白得率为指标,通过正交试验法考察影响活性蛋白得率的因素,综合以上两个实验结果确定最佳工艺条件。结果:最佳工艺条件是:鲜地龙加2倍体积pH6.8的磷酸盐缓冲液,在低温(4°C)下匀浆并静置抽提3h,4°C离心取上清液,80硫酸铵固体盐析取沉淀。沉淀用20mmol/L、pH值为6.8的磷酸盐缓冲液悬浮,透析除盐,所得蛋白液4°C离心,上清液冷冻干燥得到地龙平喘活性蛋白(Eisenia foetida protein,EP)。结论:该工艺操作简单,稳定,得到的地龙蛋白能保持原有平喘活性。     

沙蚕纤溶酶的一种纯化方法

目的 从双齿围沙蚕体内提取并纯化一种新的纤溶酶。方法 应用硫酸铵沉淀、透析、凝胶柱层析（Sephadex G-100）以及电泳等生化手段对沙蚕纤溶酶进行分离纯化。用平板法测定它降解纤维蛋白的活性。结果 得到纯的沙蚕纤溶酶,测出其等电点为4．5左右,由两条边组成,其相对分子量分别为33000u和14400u。结论 该酶为首次从沙蚕中发现的一种新的纤溶酶。