污蝇杆菌荧光定量PCR快速检测方法建立

目的污蝇杆菌(Wohlfahrtiimonas chitiniclastica bacilli)是近年新发现的条件致病菌,临床上曾引起爆发性脓毒血症,本文拟建立污蝇杆菌荧光定量PCR的快速检测方法。方法根据污蝇杆菌W.chitiniclastica SH04的全基因组DNA序列,采用Primer Express 3.0设计引物和Taqman荧光探针,建立实时荧光定量PCR的快速检测方法,并对该方法的特异性、灵敏度和重复性进行验证。结果污蝇杆菌荧光定量PCR快速检测方法具有良好的特异性,重复性试验的变异系数均2%,灵敏度为19 CFU/反应(20μL反应体系),使用该方法检测6份人为污染的样品,结果均为阳性,6份阴性对照及空白对照均为阴性。结论本研究建立的荧光定量PCR方法可以快速、准确地检测污蝇杆菌。     

嗜肺军团菌荧光定量PCR检测

目的 建立特异、快速、敏感的TaqMan探针荧光定量PCR方法,用于检测嗜肺军团菌mip基因.方法 嗜肺军团菌及其他军团菌DNA模板来自中国疾病预防控制中心呼吸道室,嗜肺军团菌地方株及其他对照株由本中心菌种室供给.利用嗜肺军团菌mip基因保守序列设计引物和TaqMan探针,对其进行筛选,同时对荧光定量PCR反应条件和反应体系进行优化,并对嗜肺军团菌、非嗜肺军团菌及其他细菌进行检测,验证该方法的特异性、敏感性、重复性等.结果 该方法在检测多株嗜肺军团菌时,均出现阳性信号,而对非嗜肺军团菌和其他细菌则未有阳性扩增结果出现.检测灵敏度达10个拷贝/反应,从菌株核酸的提取至检测完成仅需2 h左右,可减少常规PCR操作的污染机会.结论 TaqMan荧光定量PCR方法可定量检测嗜肺军团菌,具有特异性高、快速、敏感等特点,适于外环境污染源状况的调查及应急事件的快速定量检测.     

烈性呼吸道细菌多重荧光PCR检测方法建立

目的 建立多重实时荧光PCR检测炭疽杆菌、鼠疫耶尔森菌及嗜肺军团菌的方法.方法设计分别针对炭疽杆菌、鼠疫耶尔森菌、嗜肺军团菌毒力因子基因和特异性结构基因的引物和荧光双标记探针,优化反应体系,建立2套均可同时检测3种细菌的多重实时荧光PCR方法,以及3种分别针对上述单一细菌的二重实时荧光定量PCR方法.结果构建的多重和二重实时荧光PCR方法,检测敏感性分别达到100模板拷贝每反应和20模板拷贝每反应,并且高浓度模板对低浓度模板的扩增检测干扰不明显,对阳性菌株均100％检出,对常见杆菌检测均为阴性.结论多重实时荧光定量PCR具有可以同时筛查、经济、快速、特异性强、灵敏度好等优点,在炭疽杆菌、鼠疫耶尔森菌、嗜肺军团菌的病原体检测方面有较大应用价值.     

应用TaqMan-BHQ探针实时荧光RT-PCR法定量检测马秋波病毒核酸

〔目的〕建立一种适应口岸马秋波病毒实时荧光定量RT-PCR快速的检测方法。〔方法〕用专业软件设计引物和TaqMan-BHQ探针,以人工合成马秋波病毒S基因的片段作为模板,进行实时荧光定量RT-PCR研究。〔结果〕模板的Ct值与模板稀释浓度的对数存在良好的线性关系,标准曲线为Y=-3.281X+50.975,R2=0.999361,PCR扩增效率为101.0%,其最低检出限为28 copies/μl。〔结论〕应用TaqMan-BHQ1探针的实时荧光RT-PCR检测马秋波病毒核酸,具有耗时短、灵敏度高等特点。     

国境口岸猴痘病毒实时荧光PCR检测方法的建立

〔目的〕建立快速、特异的猴痘病毒实时荧光PCR检测方法。〔方法〕制备猴痘病毒阳性样本,设计并合成相应的扩增引物及荧光标记探针,摸索最佳反应条件。〔结果〕本方法对模拟猴痘病毒样本的检测灵敏度达到102拷贝/反应。本方法快速、灵敏,并具有较高的特异性和重复性,可在3h内准确检测出猴痘病毒核酸。〔结论〕本方法适合国境口岸猴痘病毒快速检测,对防止猴痘病毒传入我国,保障我国的国境口岸卫生安全具有重要意义。     

A型肉毒梭菌atx基因TaqMan探针荧光定量PCR检测

目的采用TaqMan探针荧光定量PCR方法对A型肉毒梭菌atx基因进行检测。方法以atx基因为靶基因,设计引物和TaqMan探针,优化反应条件,制作定量标准曲线,进行灵敏度、特异性和重复性验证,建立A型肉毒梭菌TaqMan荧光定量PCR检测方法。结果构建质粒pUC57-△atx,标准曲线在103～107拷贝数之间有较好的线性关系,相关系数为0.997,灵敏度达到22个拷贝数,比普通PCR提高约100倍;能选择性检测A型肉毒梭菌,与其他5种食源性病原菌无交叉反应,结果与普通PCR一致;重复性试验表明,同一浓度的15个平行样品的变异系数为1.0%。结论 A型肉毒梭菌TaqMan探针荧光定量PCR方法具有灵敏度高、特异性强、重复性好等特点,可以快速、准确、定量地检测A型肉毒梭菌。     

WU多瘤病毒实时荧光聚合酶链检测方法的建立与应用

目的 建立快速、准确、特异的检测WU多瘤病毒的实时荧光聚合酶链反应方法.方法 根据TaqMan探针技术荧光定量PCR原理,以WU多瘤病毒VP2基因为靶序列,设计并合成引物和荧光探针;优化PCR反应条件,评价实时荧光PCR方法的特异性、灵敏度、重复性;并对394例临床样本进行检测.结果 成功建立了WU多瘤病毒的荧光定量PCR检测方法;该试验所建立的实时荧光PCR方法可准确、特异的检测WU多瘤病毒;该方法可定量检测1.0×100～1.0×107拷贝范嗣的WU多瘤病毒;检测的批间和批内的变异系数均<5.0%;394例患儿痰标本中共检测出3例人WU多瘤病毒阳性,阳性率为0.76%.结论 所建立的WU多瘤病毒荧光定量PCR法敏感性较高,重复性、特异性良好,适合于临床标本检测及大样本量筛查,可为临床诊断及流行病学研究奠定方法学基础.     

应用MGB探针检测人乙型肝炎病毒的基因型

目的检测血浆或血清样本中人乙型肝炎病毒HBV的基因型,建立了基于MGB探针的实时荧光定量PCR检测体系。方法在HBV基因组型特异性碱基的聚集区域设计荧光定量PCR引物及探针,为保证特征特异性及高分辨率,选择设计MGB探针,然后将PCR扩增的产物纯化后进行基因克隆,克隆成功后提取的质粒制备为阳性质控品,从而建立完整的MGB探针法的荧光定量PCR检测体系,最后对该检测体系进行方法学评价。结果成功建立了基于MGB探针的HBV荧光定量PCR的基因分型检测体系。方法学评价显示,该检测体系的灵敏度达50 IU/mL;重复性好;特异性良好,以多种血浆病毒的核酸样品为模板进行检测时结果全为阴性。结论本研究建立基于MGB探针的HBV荧光定量PCR的基因分型检测方法,可以很好地定性的检测血浆或血清样本及血液制品中的人乙型肝炎病毒HBV的基因型及含量,对于该疾病的临床治疗具有重要的意义。     

实时荧光PCR检测基孔肯雅病毒方法的建立及初步应用

目的 建立基孔肯雅病毒的荧光定量PCR检测方法.方法 针对基孔肯雅病毒的基因序列,设计、合成引物、探针及反应体系,摸索出最佳反应条件,建立TaqMan荧光探针法和SYBR荧光染料法.利用建立的方法对30例基孔肯雅热病标本和10份基孔肯雅病毒保存液进行扩增、检测和结果分析,并与常规RT - PCR方法的检测结果进行比对.结果 实时荧光定量PCR法比常规RT - PCR法快速、灵敏.40份标本TaqMan荧光探针法、SYBR荧光染料法和常规RT - PCR方法的阳性率分别为:17.5％、17.5％、15％.统计分析表明,3种方法差异不具有统计学意义.结论 实时荧光定量PCR方法快速且具有较好的特异性、敏感性、重复性,适用于基孔肯雅病毒的快速检验.     

复合探针荧光定量PCR检测土拉弗朗西斯菌

目的:建立检测土拉弗朗西斯菌复合探针荧光定量PCR方法。方法:对土拉弗朗西斯菌的FopA基因设计引物和探针,用荧光定量PCR检测,并对特异性、灵敏度和重复性进行评价。结果:本方法对所试验的土拉弗朗西斯菌纯培养物的最低检测浓度为100 CFU/ml,定量的检测变异系数小于5%。在模拟的污染血液样品中的检出限为1×103 CFU/ml。结论:本文建立的复合探针荧光定量PCR方法能高效、敏感、特异地检测土拉弗朗西斯菌。     

实时荧光PCR检测蜡样芽胞杆菌重组质粒标准的构建

[目的]构建蜡样芽胞杆菌16s-23s ITS重组质粒，为实时荧光PCR检测蜡样芽胞杆菌提供质粒标准。[方法]选择蜡样芽胞杆菌16s-23s ITS特异基因作为目的靶序列，设计、合成引物和探针，采用普通PCR扩增特异靶序列，克隆到pGM—T载体后，转化感受态大肠埃希菌DH5α，经蓝白斑筛选，再分别用EcoRI酶切，普通PCR及测序3种方法证实目的片段已成功重组。建立荧光定量PCR检测蜡样芽胞杆菌的标准曲线。[结果]成功构建目的重组质粒，并以此为标准制作荧光定量PCR标准曲线，重组质粒标准具有较大的线性范围（10^2copies／ul～10^8 copies／ul）和灵敏度。[结论]该方法构建的16s-23s ITS基因重组质粒能满足实时荧光定量测定对参考标准的要求，为后续实时荧光PCR快速检测蜡样芽胞杆菌的推广应用提供了条件。     

TaqMan实时荧光定量PCR检测肠道细菌Akkermansia Muciniphila

目的 建立Akkermansia muciniphila(A.muciniphila)TaqMan实时荧光定量PCR检测方法,实现粪便中A.muciniphila的定量检测。方法 根据GenBank公布的A.muciniphila 16S rRNA基因高保守序列,设计合成特异引物和TaqMan探针,构建重组质粒作为标准品,通过反应体系和反应条件的优化,绘制标准曲线,同时将建立的方法用于10份成年人粪便标本的检测。结果 TaqMan实时荧光定量PCR检测A.muciniphila,仅需1.5h,该方法线性好,相关系数R²=0.9991,扩增效率E=94.7%;重复性好,组内和组间变异系数均小于3%;灵敏度可达到5×10³拷贝/μl;特异性良好。10份成年人粪便标本共检出9份为阳性,阳性粪便标本中A.muciniphila平均含量为2.70×108cells/g粪便。结论 本研究建立的TaqMan实时荧光定量PCR能够快速、灵敏、特异地定量检测粪便标本中A.muciniphila。     

实时荧光定量RT-PCR技术在手足口病疫情监测中的应用

[目的]对手足口病患者标本进行病毒核酸检测,探讨实时荧光定量RT-PCR方法在手足口病疫情监测中的意义。[方法]采用实时荧光定量RT-PCR方法对2010年3～8月连云港市采集的307份手足口病患者标本进行肠道病毒核酸检测,并对肠道病毒71型(EV71)、柯萨奇病毒A组16型(CVA16)进行分型。[结果]307份手足口病患者标本中有221份肠道病毒核酸阳性,阳性率71.99%,其中EV71型病毒核酸阳性标本123份,阳性率40.07%,CVA16型病毒核酸阳性标本66份,阳性率21.50%。[结论]实时荧光定量RT-PCR方法耗时短、特异性强、灵敏度高,可作为手足口病疫情监测的诊断方法。     

旋转式荧光定量PCR在临床应用中的价值

目的：探讨旋转式荧光定量PCR仪在检测临床标本中的应用价值。方法：通过旋转荧光定量-PCR技术鉴定1132株临床分离株,进行结核分枝杆菌的菌种鉴定和定量分析,同时进行抗酸染色和培养法。结果：总阳性检出率为48.64%,其中菌阳检出率为96.56%（253/262）,阴性符合率为77.85%（369/474）,菌种鉴定特异性实验符合率为100%。结论：旋转氏荧光定量PCR仪改进后更加快速、敏感,与其配套使用的试剂特异性强,是在检测结核分枝杆菌复合群的同时,又能进行非结核分枝杆菌鉴定辅助诊断的好方法。     

建立染料法荧光定量PCR检测恙虫病东方体

目的建立染料法荧光定量PCR检测恙虫病东方体。方法根据恙虫病东方体56kD外膜蛋白基因序列设计特异性引物,建立染料法(SYBR green I)实时荧光定量PCR,评估其灵敏性及特异性;并对恙虫病东方体鸡胚培养物、东方体感染小白鼠脏器标本以及恙虫病病人血样等多种样本进行检测。结果建立的荧光定量PCR标准曲线的循环阈值(Ct)与模板拷贝数呈良好的线性关系(r2=0.99),灵敏性评估显示20μl体系单PCR反应管靶基因大于28个拷贝即可被有效检测,最低检出浓度为2拷贝/μl,比普通PCR检测方法提高1~2个数量级,并且具有较好的重复性;建立的SYBR I染料法具有良好的特异性,与立氏立克次体R株等其他5种立克次体,以及被检测的其他几种病原菌DNA模板均不发生特异性扩增;用建立的染料法对东方体鸡胚培养物、东方体感染动物脏器,以及采集的现场恙虫病病人血样共59份标本进行检测,其中57份检出阳性。用该定量PCR检测恙虫病东方体实验感染小鼠的血、脾脏、肾脏、肝脏标本,结果脾脏中东方体检出量最多,肝脏和肾脏次之,血中的恙虫病东方体量较低。结论本研究建立荧光定量PCR方法均具有很高的特异性和敏感性,适合各种样本中东方体的快速检测,可用于实验室的快速诊断。     

泰泽氏菌TaqManMGB探针荧光定量PCR方法的—立及应用

目的 建立泰泽氏菌的TaqMan小沟结合物(MGB)探针荧光定量PCR检测方法.方法 针对泰泽氏菌16S rRNA基因的保守区设计特异性引物和探针,建立MGB探针荧光定量PCR方法,并验证该方法的特异性、敏感性和稳定性.对2008-2011年采集的1156份临床样本进行检测,同时进行普通PCR检测作为对照.结果 泰泽氏菌TaqMan MGB探针荧光定量PCR方法具有高度特异性,与肝螺杆菌、幽门螺杆菌、空肠弯曲菌、侵肺巴斯德氏菌、大肠埃希菌、铜绿假单胞菌之间无交叉反应,检测灵敏度达2.2 copy/μl.标准曲线显示各浓度范围内具有良好线性关系,相关系数为0.999,斜率为-3.204,PCR效率为100％.对1156份临床样本进行检测,荧光定量PCR检出101份泰泽氏菌阳性样本,而普通PCR则仅检出44份.荧光定量PCR方法从临床样本中检出泰泽氏菌DNA仅需2h.结论 TaqMan MGB探针荧光定量PCR方法具有特异、灵敏和稳定性,适于泰泽氏菌的快速检测.     

细菌16S rRNA在诊断非中性粒细胞性腹水自发性细菌性腹膜炎中的应用

目的 评价荧光定量PCR检测腹水细菌16S rRNA基因在诊断非中性粒细胞性腹水自发性细菌性腹膜炎患者中的临床应用价值.方法 用细菌16S rRNA基因荧光定量PCR法检测64例非中性粒细胞性腹水疑似自发性细菌性腹膜炎患者及6例慢性肝病伴非感染性腹水患者腹水中的细菌DNA,同时与腹水细菌培养结果进行对比.结果 细菌16S rRNA荧光定量PCR最低可检测到10个拷贝的DNA复制,检测细菌的阳性率明显高于细菌培养的阳性率,分别为15.63%和3.13%,两组差异有统计学意义(x2=5.52,P＜0.05).6例非感染性腹水荧光定量PCR及细菌培养均阴性.结论 腹水细菌16S rRNA荧光定量PCR检测细菌的特异性强、敏感性高,在诊断非中性粒细胞性腹水自发性细菌性腹膜炎患者中具有重要的临床应用价值.     

荧光定量PCR和FISH技术诊断肺结核的价值比较

目的比较荧光定量PCR和FISH技术对肺结核诊断的敏感性和特异性。方法共收集300例明确诊断为肺结核的患者作为阳性对照组,以及收集300例健康志愿者(明确排除肺结核患者)做为阴性对照组。收集800例新收临床疑似肺结核患者做为研究组。收集该800例患者的肺活检标本以及同期的痰液标本,其中痰液进行涂片、结核杆菌分离培养以及结核杆菌DNA荧光定量PCR检测和FISH检测。比较荧光定量PCR和FISH技术对肺结核诊断阳性符合率和阴性符合率。结果 1FISH技术检测结核杆菌阳性符合率为99.3%;荧光定量PCR检测结核杆菌阳性符合率为97.3%。两者阳性符合率存在统计学差别(p=0.015)。2FISH技术检测结核杆菌阴性符合率为98.2%,荧光定量PCR技术检测结核杆菌阴性符合率为96.9%。两者阴性符合率存在统计学差别(p=0.007)。结论与荧光定量PCR比较,FISH对肺结核诊断具有较高的阳性符合率和阴性符合率。     

环介导等温扩增法快速检测手足口病病原体

目的：建立逆转录（RT）-环介导等温扩增方法（LAMP）,以快速检测手足口病最重要的两种病原体：肠道病毒71型（EV71）和柯萨奇病毒A组16型（CA16）。方法：收集手足口病患儿咽拭子标本93份,针对EV71和CA16病毒的VP1基因特异性序列8个区域各设计6条LAMP引物,分别于63℃（EV71）、65℃（CA16A）扩增1 h,日光下观察结果,与实时荧光定量PCR比较检测特异性和敏感性。结果：EV71、CA16的LAMP最低检测限均为500拷贝/管,与对照病毒无交叉反应。93份标本中,RT-PCR方法检测显示EV71阳性44例,CA16阳性36例;RT-LAMP方法检测显示EV71阳性46例,CA16阳性36例,两种方法间比较差异均无统计学意义（P〉0.05）。结论：应用RT-LAMP检测手足口病病原体EV71、CA16快速、灵敏、经济、特异性高,适合在基层医疗机构推广应用。     

TaqMan-MGB探针法快速检测脑膜炎奈瑟菌的研究

目的建立TaqMan-MGB探针荧光定量PCR快速检测脑膜炎奈瑟菌（Nm）方法,为流脑的诊断提供更加灵敏、特异、可标准化、自动化的检测方法;评价TaqMan-MGB探针荧光定量PCR法在健康人群带菌调查中的应用价值。方法根据Nm ctrA基因的3端保守序列设计合成引物和TaqMan-MGB探针,建立快速检测脑膜炎奈瑟菌的荧光定量PCR方法,并对反应条件进行优化。结果TaqMan-MGB探针荧光定量PCR检测脑膜炎奈瑟菌的灵敏度为102cfu/ml,TaqMan-MGB探针法检测900份健康人群咽拭子标本,阳性34例,检出率3.8%,高于培养法（1.2%）。结论该方法特异性强、灵敏度高,能实现脑膜炎奈瑟菌的快速检测,适用于健康带菌检查并可作为临床常规诊断方法的补充,有利于流脑的早诊断、早治疗。