恶性疟原虫组氨酸富集蛋白II基因克隆及测序

目的:比较恶性疟原虫不同分离株组氨酸富集蛋白II( HRPII)基因全编码区核苷酸序列。方法: PCR扩增恶性疟原虫海南株(FCC1/HN)和越南株(VN)的HRPII基因全编码区, 其产物经HindIII和Bam HI双酶切,定向克隆入pUC19, 采用Sanger 双脱氧链末端终止法测序。结果:FCC1/HN 株和VN 株HRPII基因均为1 020bp, 无内含子, 两者仅10 个碱基不同。FCC1/HN 株HRPII与VN 株、IMTM22 株和Itg2 株间氨基酸同源性分别为98.8% 、92.2% 和98.7% ; 4 株虫体均有拷贝数不等的丙氨酸-组氨酸-组氨酸(AHH)和丙氨酸-组氨酸-组氨酸-丙氨酸-丙氨酸-天冬氨酸(AHHAAD) 重复序列, 具有相同的信号肽和糖基化位点。4 个分离株HRPII抗原表位相同,位于易曲性较高的5端非AHH 和AHHAAD 重复区。结论: FCC1/HN 株与VN 株的HRPII高度同源,与IMTM22 株和Itg2 株存在序列差异     

恶性疟原虫：组氨酸富集蛋白家族的结构与功能

恶性疟原虫血液期合成许多富含组氨酸的蛋白质，即组氨酸富集蛋白家族，这些蛋白质的基因结构有不少相似之处，但其功能各不相同。本主要就恶性疟原虫组氨酸富集蛋白在疟疾的免疫诊断，促进疟色素形成的机制及ＨＲＰ与疟原虫感染红细胞膜结节之间的关系等研究进展，作一简要综述。     

恶性疟原虫:组氨酸富集蛋白家族的结构与功能

恶性疟原虫无性血液期合成许多富含组氨酸的蛋白质,即组氨酸富集蛋白家族(HRP),这些蛋白质的基因结构有不少相似之处,但其功能各不相同。本文主要就恶性疟原虫组氨酸富集蛋白在疟疾的免疫诊断、促进疟色素形成的机制及HRP与疟原虫感染红细胞膜结节之间的关系等研究进展,作一简要综述。     

恶性疟原虫云南株富含组氨酸蛋白II部分基因的克隆和序列分析

目的：测定恶性疟原虫云南株富含组氨酸蛋白 Ｉ Ｉ部分序列,了解该虫株与其它虫株 Ｈ Ｒ Ｐ Ｉ Ｉ基因序列的差异。方法：采用 Ｐ Ｃ Ｒ 方法特异性扩增 Ｈ Ｒ Ｐ Ｉ Ｉ基因片段,并将该基因片段克隆于 Ｍ １３ 载体,用双脱氧链末端终止法进行测序,应用 Ｐ Ｃ Ｇ Ｅ Ｎ Ｅ软件对不同虫株恶性疟原虫 Ｈ Ｒ Ｐ Ｉ Ｉ进行基因序列分析。结果：我国云南株恶性疟原虫与 ７ Ｇ８ 及 Ｄ１０ 虫株 Ｈ Ｒ Ｐ Ｉ Ｉ基因有不同程度的差异,３ 虫株间 Ｈ Ｒ Ｐ Ｉ Ｉ氨基酸序列同源性为７０．３％ ,核苷酸序列同源性为 ６８．６％ 。结论：云南株与７ Ｇ８ 及 Ｄ１０ 虫株 Ｈ Ｒ Ｐ Ｉ Ｉ基因存在差异。     

恶性疟原虫组氨酸富集蛋白Ⅱ抗原基因在大肠杆菌中的表达及表达蛋白的活性鉴定研究

目的恶性疟原虫组氨酸富集蛋白Ⅱ（Ｈｉｓｔｉｄｉｎｅ－ｒｉｃｈｐｒｏｔｅｉｎⅡ,ＨＲＰⅡ）是疟原虫红内期生活史过程中从感染红细胞分泌至血浆中的水溶性抗原,是重要的诊断用抗原。本文通过实现恶性疟原虫ＨＲＰⅡ在大肠杆菌中的表达,为研制用于疟疾诊断的抗ＨＲＰⅡ单克隆抗体奠定基础。方法将含有ＨＲＰⅡ抗原基因的重组表达质粒ＨＲＰⅡ／ｐＥＴ８ｃ用钙法转化大肠杆菌ＢＬ２１（ＤＥ３）,重组子经聚合酶链反应（ＰＣＲ）和ＢａｍＨＩ与ＢｇｌⅡ双酶切鉴定。重组子ＨＲＰⅡ／ｐＥＴ８ｃ／ＢＬ２１（ＤＥ３）在２８℃条件下,用１ｍＭＩＰＴＧ诱导表达,ＳＤＳ－ＰＡＧＥ和Ｗｅｓｔｅｒｎ免疫印迹分析表达产物。结果成功构建ＨＲＰⅡ／ｐＥＴ８ｃ重组质粒,在低温条件下经ＩＰＴＧ诱导,ＨＲＰⅡ呈可溶性、非融合性表达,ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析表明表达产物的分子量约３３ｋＤａ,薄层扫描显示表达蛋白占菌体总蛋白的２０．７６％。Ｗｅｓｔｅｒｎ免疫印迹表明,表达产物能被抗ＨＲＰⅡ人工合成九肽单克隆抗体特异识别。结论恶性疟原虫ＨＲＰⅡ在原核表达系统ｐＥＴ８ｃ／ＢＬ２１（ＤＥ３）中获得成功表达,为基因工程大规模制备生产ＨＲＰⅡ抗原奠定基础     

恶性疟原虫云南株富含组氨酸蛋白II部分基因的克隆和序列分析

目的：测定恶性疟原虫云南株富含组氨酸蛋白 Ｉ Ｉ部分序列,了解该虫株与其它虫株 Ｈ Ｒ Ｐ Ｉ Ｉ基因序列的差异。方法：采用 Ｐ Ｃ Ｒ 方法特异性扩增 Ｈ Ｒ Ｐ Ｉ Ｉ基因片段,并将该基因片段克隆于 Ｍ １３ 载体,用双脱氧链末端终止法进行测序,应用 Ｐ Ｃ Ｇ Ｅ Ｎ Ｅ软件对不同虫株恶性疟原虫 Ｈ Ｒ Ｐ Ｉ Ｉ进行基因序列分析。结果：我国云南株恶性疟原虫与 ７ Ｇ８ 及 Ｄ１０ 虫株 Ｈ Ｒ Ｐ Ｉ Ｉ基因有不同程度的差异,３ 虫株间 Ｈ Ｒ Ｐ Ｉ Ｉ氨基酸序列同源性为７０．３％ ,核苷酸序列同源性为 ６８．６％ 。结论：云南株与７ Ｇ８ 及 Ｄ１０ 虫株 Ｈ Ｒ Ｐ Ｉ Ｉ基因存在差异。     

恶性疟原虫:组氨酸富集蛋白基因反义寡脱氧核苷酸体外抗疟作用初步研究

[目的 ]研究反义寡脱氧核苷酸 (oligodeoxyribonucleotides,ODN)对恶性疟原虫组氨酸富集蛋白 (histidine richprotein ,HRP)Ⅱ和HRPⅢ基因表达的阻断作用 ,探讨抗疟新途径。 [方法 ]设计合成恶性疟原虫组氨酸富集蛋白翻译起始区的反义ODN、正义ODN和无义ODN ,研究其对红内期培养恶性疟原虫增殖和成熟的体外抑制作用。[结果 ]当ODN浓度较高时 (高于 1μmol L) ,反义ODN、正义ODN和无义ODN均能抑制恶性疟原虫的增殖和成熟 ,即ODN对疟原虫呈非特异性抑制。当ODN浓度在 0 0 1～ 0 5 μmol L时 ,与无义ODN对照组相比 ,反义ODN能显著抑制体外培养恶性疟原虫的增殖和裂殖体成熟 (P <0 0 1) ;且ODN浓度越高 ,抑制作用也就越强。正义ODN对虫体的抑制作用 ,与无义ODN相比其差异无显著性意义 (P >0 0 5 )。 [结论 ]HRPⅡ和HRPⅢ基因反义ODN可通过阻断基因的表达 ,抑制恶性疟原虫增殖和成熟的作用。     

恶性疟原虫HRP—Ⅲ基因的克隆及序列分析

目的 克隆并测定恶性疟原虫海南（FCC1／HN）株HRP－Ⅲ基因序列,比较FCC1／HN株与国外分离株HRP－Ⅲ基因序列的差异。方法 根据HRP－Ⅲ基因已知序列设计合成一对引物,应用PCR技术从FCC1／HN株基因组DNA中扩增HRP－Ⅲ基因。通过定向克隆,构建真核表达重组质粒pcDNA3-HRP－Ⅲ。阳性克隆的重组质粒经酶切及PCR鉴定后,用双脱氧链末端终止法进行基因序列测定。应用分子生物学软件进行不同分离株HRP－Ⅲ基因序列的同源性比较。结果 PCR扩增得到特异的FCC1／HN株HRP－Ⅲ基因序列。酶切及PCR鉴定获得了正确的pcDNA3-HRP－Ⅲ重组质粒。测序表明,恶性疟原虫FCC1／HN株HRP－Ⅲ基因全长802bp包含一个内含子,编码224个氨基酸,序列分析表明,我国恶性疟原虫FCC1／HN株与国外的Itg2,FC27及IMTM22株HRP－Ⅲ基因序列有较高的同源性。结论 成功克隆恶性疟原虫FCC1／HN株HRP－Ⅲ基因。序列测定及同源性分离表明,FCC1／HN株与其它分离株的HRP－Ⅲ基因序列有高度的同源性。     

基于恶性疟原虫富含组氨酸蛋白2抗原诊断方法的研究进展

恶性疟原虫是引起人类疟疾的主要病原体之一,采用基于恶性疟原虫富含组氨酸蛋白2(Plasmodiumfalciparum histidine-rich-protein 2,PfHRP2)抗原的快速诊断试剂(rapid diagnostic test,RDT)进行诊断是诊断恶性疟原虫感染的特异性方法,但表达该抗原的pfhup2基因呈现明显的多态性,甚至表达缺失,导致试剂的灵敏度降低,其临床实用性受到质疑.该文对pfhrp2基因多态性研究及基于PfHRP2抗原的恶性疟原虫诊断试剂评价进行综述,为恶性疟原虫的流行病学研究和临床诊断试剂的选择提供依据.     

恶性疟原虫富组氨酸蛋白2的原核表达、纯化及表达产物的鉴定

目的 为将恶性疟原虫的富组氨酸蛋白２（ＨＲＰ２）应用于疟疾诊断和疫苗研究,本文原核表达、纯化及鉴定了恶性疟原虫的ＨＲＰ２。方法 将ＨＲＰ２基因片段克隆入原核表达载体ｐＧＥＸ－４Ｔ－１／ＨＲＰ２;诱导ｐＧＥＸ－４Ｔ－１／ＨＲＰ２转化的ＢＬ２１菌,纯化表达产物并免疫ＢＡＬＢ／Ｃ小鼠;以免疫色谱法鉴定表达产物,以免疫小鼠血清对受染红细胞（ＩＲＢＣ）进行Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ分析。结果 成功构建了ｐＧＥ     

恶性疟原虫富组氨酸蛋白-2基因诱导的免疫应答研究

[目的 ]探讨编码恶性疟原虫富组氨酸蛋白 2 (HRP Ⅱ )C端基因的真核表达重组质粒诱导小鼠的体液和细胞免疫效果。 [方法 ]将起始码和终止码引入HRP ⅡC端基因片段两端 ,经测序鉴定读框 ,将包含起始码和终止码的HRP Ⅱ基因片段克隆入真核表达质粒pcDNA3 1( )中 ,进行酶切鉴定。用重组真核表达质粒pcDNA3 1( ) /HRP Ⅱ 经肌肉免疫小鼠 3次 ,每次间隔 3wk。第 3次免疫后 2wk ,取小鼠血清和脾细胞 ,分别用ELISA测定HRP Ⅱ抗体水平和用脾细胞增殖实验测定细胞免疫反应。 [结果 ]序列测定结果表明 ,HRP ⅡC端基因片段被准确地引入起始码和终止码 ;酶切鉴定表明包含起始码和终止码的HRP ⅡC端基因片段成功地克隆入pcDNA3 1( ) ,形成pcDNA3 1( ) /HRP Ⅱ 。在pcDNA3 1( ) /HRP Ⅱ 免疫鼠血清中可检测出高水平的HRP Ⅱ抗体 ,用原核表达的HRP Ⅱ蛋白刺激免疫脾细胞 ,可检测出明显的细胞增殖反应。 [结论 ]编码HRP Ⅱ的真核表达重组质粒可诱导小鼠产生明显的体液和细胞免疫反应。其有可能作为恶性疟原虫红内期复合DNA疫苗的候选基因     

恶性疟原虫中国海南株裂殖子表面蛋白1 基因的序列分析

目的:测定恶性疟原虫中国海南分离株MSP1 基因的全序列,并进行多态性分析。方法:来自海南省保亭县2 例恶性疟患者的血样(分别滴在滤纸上)直接制备基因组DNA 后,用MSP1 基因特异的5 对寡核苷酸引物在体外扩增目的基因,用ABIPRISMTM末端标记循环测序试剂盒进行直接测序,并将测序结果与已知的等位基因型进行比较分析。结果:获得了2 个恶性疟原虫中国分离株MSP1 基因的全序列,与已知的MSP1 等位基因型进行序列比较,证实其属于MAD20 型。推导其氨基酸序列除了第2 区、第4 区和第8 区以外,其余序列完全一致。其中HN2 的第4 区含K1 型序列。结论:两株恶性疟原虫海南株的MSP1 基因属于MAD20 型,与MAD20 等位基因比较,其推导的氨基酸序列存在一些小差异。本文首次提供了恶性疟原虫中国(海南)分离株MSP1 基因多态性的依据     

恶性疟原虫有性期特异抗原Pfs48/45基因的克隆与部分序列分析

目的：构建恶性疟原虫海南FCC1／HN分离株有性期特异抗原Pfs48／45，为研制恶性疟原虫传播阻断疫苗提供抗原。方法：根据Pfs48／45基因编码区序列设计引物，用PCR扩增DNA，并进行序列分析，双酶切后，定向克隆入pcDNA3载体，转化大肠杆菌TG1，随机取出氨苄青霉素抗性菌落进行PCR扩增，用碱裂解法抽提阳性的重组子DNA，双酶切鉴定。结果：特异扩增了编码Pfs48／45全基因序列（1363bp）；用5端寡核苷酸引物测定了450个碱基，结果表明FCC1／HN分离株Pfs48／455端基因序列与NF54株相应基因基本一致，仅在第307（T→C）和372（T→C）位碱基存在置换；第372位碱基置换产生新的酶切位点TaqI，进一步用TaqI消化PCR扩增产物，产生两个大小分别为984bp和379bp的酶切片段，测序和酶切结果均证实扩增的目的基因确为fs48/45 基因; 将纯化的目的基因片段正向插入pcDNA 3 质粒的BamHI 和EcoRI 位点。结论: 我国海南FCC1/ HN 分离株Pfs48/45 抗原基因序列与NF54 株相应基因高度同源; 成功构建重组质粒pcDNA 3-Pfs48/45     

云南省恶性疟原虫对氯喹、氨酚喹、哌喹、甲氟喹、奎宁敏感性的体外测定

目的：了解云南省恶性疟原虫对氯喹、氨酚喹、哌喹、甲氟喹及奎宁的敏感性。方法：采用Ｒｉｅｃｋｍａｎｎ体外微量法测定采自云南省瑞丽１１个县、市的恶性疟原虫对以上药物的敏感性。结果：云南省南部、东南部及西部恶性疟原虫对氯喹抗性率分别为９６．７％、７８．９％及９５．７％,ＩＤ５０依次为１２５ｎｍｏｌ／Ｌ、１３６ｎｍｏｌ／Ｌ、及１７６ｎｍｏｌ／Ｌ;对氯酚喹的抗性率分别为１００％、８５．３％及８８．９％,ＩＤ５０依次为５２ｎｍｏｌ／Ｌ、５４ｎｍｏｌ／Ｌ及７２ｎｍｏｌ／Ｌ;对奎宁均为敏感,ＩＤ５０依次为４８０ｎｍｏｌ／Ｌ、３５２ｎｍｏｌ／Ｌ及６０８ｎｍｏｌ／Ｌ。南部及东南部原虫对哌喹的抗性率分别为６８及８８ｎｍｏｌ／Ｌ;结论：云南省恶性疟原虫对４－氨基喹啉类药物普遍产生抗性,其抗性程度来自滇西及其相连的缅甸感染的疟原虫明显高于滇东南;对奎宁及甲氟喹敏感。氯喹、氨酚喹及哌喹目前已不适应于云南恶性疟的治疗     

恶性疟原虫FCC1／HN株特异基因片段的克隆及部分序列分析

本研究通过分离、培养恶性疟原虫ＦＣＣ１／ＨＮ分离株，提取、纯化其基因组ＤＮＡ，用ＢａｍＨ１部分酶切，并克隆ｐＵＣ１８载体，转化受体菌株大肠杆菌ＪＭ１０３，用基因组ＤＮＡ探针筛选转化子，对杂交信号最强的克隆片段ｐＨＦ１作部分序列分析，在国内首次明确恶性疟原虫ＦＣＣ１／ＨＮ特异ＤＮＡ部分序列。ｐＨＦ１克隆片段约１．２ｋｂ，两端分别测定了３２８和２７１个碱基。Ｇ＋Ｃ含量为２６．８％，并有较多的酶切位点，便于作亚克隆，该序列还可用作ＤＮＡ探针或ＰＣＲ扩增模板有较大实用价值。     

海南省恶性疟原虫裂殖子表面蛋白2基因的分型研究及序列分析

目的对恶性疟原虫海南株的MSP2基因进行分型和多态性分析. 方法采用套式PCR法特异扩增MSP2基因的中间可变区(第3区),对41株恶性疟原虫分离株进行基因分型,并对部分目的基因片段进行直接测序. 结果 41份血样中有39份共扩增得到55个目的基因片段,以3D7型为主(28份血样,36个基因片段),两种等位基因家族混合感染的情况极少见.序列分析结果表明,海南省恶性疟原虫虫株的MSP2中间重复序列区变异程度大. 结论海南省恶性疟原虫的MSP2以3D7等位基因家族为主,且存在显著的多态性.     

3种恶性疟原虫红内期抗原基因的测序和序列分析

目的　测定我国恶性疟原虫海南株 (FCC1/ HN)谷氨酸富集蛋白 (GARP)、丝氨酸重复抗原 (SERA)和裂殖子表面蛋白 1(MSA1)基因序列 ,并进行序列分析。　方法　采用 PCR技术从恶性疟原虫 FCC1/ HN株基因组 DNA中扩增 GARP、SERA和 MSA1基因片段 ,分别插入到测序载体上进行测序。应用 DNAstar软件辅助分析 3种抗原基因的结构及 3种抗原在不同恶性疟原虫株间的分化情况。　结果　恶性疟原虫 FCC1/ HN株 GARP基因全长 2 2 6 3bp,编码6 82个氨基酸残基 ,谷氨酸占 2 3.6 1% ,包含 5个典型的氨基酸重复序列 ;SERA基因全长 344 8bp,编码 995个氨基酸残基 ,丝氨酸含量为 10 .6 5 % ,包含 1个连续 32个丝氨酸 (S)残基的序列 ;MSA1基因全长 5 0 85 bp,编码 16 94个氨基酸残基 ,MSA1的氨基酸序列符合 MAD2 0型特征。恶性疟原虫 FCC1/ HN株与 3D7、FC2 7株 GARP的序列差异主要集中于 C-末端 ;FCC1/ HN株与 FCR3、3D7、FCBR、Hondulas- 1株 SERA的序列差异主要集中于 N-端。FCC1/ HN株与MAD2 0、3D7、HN1、HN2、FC2 7、RO- 71、RO- 33、CAMP和 Palo- alto株 MSA1的同源性高 ,K1和 WEL L COME株 MSA1的同源性高 ,各分离株 MSA1的序列差异主要处于第 2至 16分区。　结论　了解了恶性疟原虫 FCC1/ HN株 GARP、SERA和 MSA1的     

恶性疟原虫环子孢子蛋白基因在大肠杆菌中的表达

用ＰＣＲ方法特异性扩增恶性疟原虫云南株（ＰＦＤ－３／ＹＮ）环子孢子蛋白基因片段,经基因序列测定后克隆于ｐＷＲ４５０－１融合蛋白表达载体,并转化大肠杆菌ＴＧ１、ＪＭ１０３及ＪＭ１０９。在不同菌体浓度及不同剂量ＩＰＴＧ诱导下检测ＣＳＰ融合蛋白的表达,结果显示仅ｐＷＲ－ＣＳＰ／ＴＧ１工程菌在菌体浓度ＯＤ５９０值达０．７～０．８时,加入终浓度１ｍｍｏｌ／ＬＩＰＴＧ进行诱导,可表达一８８ｋＤａ的融合蛋白。ｄｏｔ－ＥＬＩＳＡ和Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ分析表明ＣＳ蛋白表达产物能被抗ＣＳ蛋白重复区单克隆抗体所识别