肿瘤热休克蛋白70-多肽复合物诱导特异性细胞毒T淋巴细胞产生的实验研究

目的　研究肿瘤细胞的热休克蛋白 70多肽复合物 (heatshockprotein 70peptide complexes ,HSP PC70 )诱导活化肿瘤特异性细胞毒T淋巴细胞 (cytotoxicTlymphocytes,CTL)的作用及该CTL的杀瘤效应。方法　利用细胞培养 ,流式细胞技术 ,蛋白质的分离纯化技术 ,电泳技术 ,Western blot检测方法 ,T淋巴细胞的诱导及体外扩增 ,酶标技术等 ,测定肿瘤HSP70 多肽复合物诱导活化小鼠体内CTL产生的作用。结果　HcaF细胞HSP PC70的自然表达率为 6 3.5 % ,热诱导后为 75 .5 % ;HcaF细胞的HSP PC70能够诱导活化肿瘤特异性的CTL ,该CTL在效靶比例为 5 0∶1、2 5∶1、12 .5∶1时于体外对HcaF细胞的杀伤效率分别为 84.2 %± 3.2 %、47.9%± 2 .6 %和 14.8%± 3.0 % ;该CTLCD3、CD8的阳性率分别为 93%± 7% ,92 %± 8% ;将活化的CTL注入荷瘤小鼠体内可见明显的治疗作用 ,注入 10 7CTL 4次后 ,10 0 %的小鼠获长期生存。结论　肿瘤来源的HSP PC70具有强大的免疫原性 ,可活化CD8 T淋巴细胞成为肿瘤特异性的CTL ,该CTL具有较高的体外杀瘤活性和良好的治疗作用。     

肿瘤的热休克蛋白90-肽复合物诱导产生特异性细胞毒性T淋巴细胞的体外研究

目的探讨肿瘤组织来源的热休克蛋白90-肽复合物(HSP90-PC)诱导产生特异性细胞毒性T淋巴细胞(CTL)的作用。方法高压液相色谱法分离纯化肾腺癌患者肿瘤组织HSP90-PC,同时从该患者外周血扩增树突状细胞及T细胞,以提取的HSP90-PC冲击树突状细胞,将致敏的树突状细胞与T细胞混合,流式细胞仪检测特异性CD8^* CTL的增殖情况。结果肿瘤组织来源的HSP90-PC致敏的树突状细胞可显著诱导T细胞增殖生成CD8^* CTL。结论从肿瘤组织中提取的HsP90-PC具有良好的免疫原性,用其致敏的树突状细胞可有效诱导CTL增殖,从而为肿瘤的免疫治疗提供了新的方法和依据。     

热休克蛋白70与肿瘤相关性研究进展

热休克蛋白70(heat shock prote in HSP70)是一组重要的应激蛋白,它在肿瘤,特别是恶性肿瘤中常有高表达,它能与癌基因、抑癌基因产物结合,具有抗肿瘤细胞凋亡作用。目前认为HSP70参与肿瘤免疫应答过程,肿瘤组织中提取的HSP70-肽复合物具有肿瘤特异性免疫原性,可诱导产生特异性抗肿瘤免疫效应,HSP70-肽复合物作为肿瘤疫苗具有很好的临床应用前景。     

热休克蛋白70与肿瘤免疫

热休克蛋白可以与肿瘤抗原多肽结合,形成热休克蛋白-多肽复合物,抗原性由多肽所决定,而热休克蛋白作为分子伴侣,可以增强肿瘤免疫。这种特性可以用于治疗肿瘤。     

热休克蛋白70与肿瘤免疫

近年热休克蛋白70(HSP70)在免疫中的作用日益受到重视。HSP70在肿瘤免疫中充当了多重角色,一方面作为“分子伴侣”参与肿瘤细胞的功能代谢,保护肿瘤细胞免受有害因素的损害;另一方面肿瘤细胞与机体正常细胞生长、代谢、分化的异质性,使HSP70成为与其相结合的肿瘤抗原多肽的靶载体,在参与肿瘤抗原的免疫反应中充当了举足轻重的角色。     

热休克蛋白70多肽复合物与肿瘤免疫

热休克蛋白（HSP）与肿瘤免疫治疗的关系是近年来肿瘤免疫治疗的热点之一。许多研究结果均证实，从肿瘤组织中提取HSP能诱导机体产生对该肿瘤细胞的免疫应答，达到治疗肿瘤的目的。HSP分子实际上是分子量大小不同的一组蛋白，根据HSP的同源程度及分子量的大小差异，可分为HSP110家族、HSP90家族、HSP70家族、HSP60家族及小HSP家族，其中HSP70在肿瘤免疫中发挥重要的作用。     

热休克蛋白70的免疫学进展

生物细胞在受热和其他理化因素(如缺血、缺氧、重金属离子、氨基酸类似物、病毒感染、DNA损伤等)作用后,发生热休克反应( Heat shock response,HSR) ,抑制一些正常蛋白质的合成,同时启动一类新的蛋白合成基因-热休克蛋白基因,合成热休克蛋白。它是上个世纪70年代由美国学者Tiss     

热休克蛋白70与肿瘤治疗的研究进展

热休克蛋白（heat shock proteins,HSPs）是进化上古老的、生物在不利条件下产生的一种保护机体的蛋白,具有重要的病理、生理功能。在正常时以较低水平表达;在环境温度变化、炎症、发热、微生物感染、肿瘤、放射等情况下均诱导HSPs合成,从而减轻不利条件下导致的损害。近年研究发现,HSP70在肿瘤治疗中充当了多重角色,     

Generation of cytotoxic T lymphocytes specific for B-cell acute lymphoblastic leukemia family-shared peptides derived from immunoglobulin heavy chain framework region

Background Immunoglobulin heavy chain variable region （IgHV） is a well-characterized tumor antigen for B-cell malignancies. It can function as a target for T cell-mediated immune response. Clinical trials of IgHV protein vaccines against lymphoma have demonstrated induction of tumor-specific cytotoxic T lymphocyte （CTL） responses. However, complementary determining regions-based individual vaccines have disadvantages for wide clinical application. Although a recent study demonstrated that immunogenic peptides are derived from framework regions （FR） shared among patients with B-cell lymphoma, how to choose the appropriate peptides for each patient is still unsolved. The aim of this study was to investigate whether immunoglobulin heavy chain FR-derived peptides shared in each IgHV family are potential CTL epitopes presented by B-cell acute lymphoblastic leukemia （B-ALL）. Such CTL epitopes might be beneficial to shifting vaccination strategies against B-ALL from individual specificity to family specificity. Methods Seven IgHV gene families were amplified respectively by PCR and sequenced directly from 71 childhood B-ALL cases. Bioinformatics was applied in analyzing characteristics of sequences available and predicting HLA-A^＊0201-restricted CTL epitopes for each IgHV family. An antigen-specific T cell expansion system was used to generate peptide-specific CTLs. The cytotoxicity of CTLs against B-ALL cells was assessed in the lactate dehydrogenase release assay. Results Complete IgHV rearrangements were identified in all of the 71 B-ALL cases. All of 40 sequences available showed ≥98% homology with the nearest germline IgHV genes, indicating IgHV genes in B-ALL of germline nature. Twelve nonapeptides of high HLA-A^＊0201-binding scores were obtained from 26 productive IgHV protein sequences. Ten （83%） of the peptides were located in FR1 and FR3 shared among the corresponding IgHV family. CTLs specific for the peptide QLVQSGAEV located in FR1 （3-11） shared among the IgHV1 family could be successfully generated from peripheral blood mononuclear cells of two HLA-A^＊0201＋ healthy donors in vitro and were capable of killing HLA-matched B-ALL cell clones belonging to the IgHV1 family. Conclusion Anti-B-ALL CTLs against immunoglobulin heavy chain FR-derived peptides have family-specific cytotoxicity.     

乳腺癌干细胞的树突状细胞疫苗对细胞毒性T淋巴细胞增殖的影响

目的探讨加载人类乳腺癌干细胞（BSC）的树突状细胞（DC）疫苗对细胞毒性T淋巴细胞（CTL）活化效果的影响。方法从11例乳腺癌患者中分离并评价BSC,探讨BSC作为DC疫苗抗原的适用性,并在体外评估了杀伤BSC的能力。结果BSC表达高水平的干细胞相关分子CD44+、CD24-和CD133+,乳腺癌贴壁细胞表达CD44+、CD24＋和低CD133+。在体内,富集的乳腺癌细胞球表现出比贴壁细胞更强的致瘤能力。使用BSC裂解物的DC疫苗接种引发针对BSC的特异性T细胞应答。DC疫苗接种刺激Th1应答并诱导IFN-γ产生,与活化的CTL数量呈正相关。结论乳腺癌细胞球细胞具有干细胞特性和强致瘤功能,使用BSC抗原的DC接种可引发有效的抗原特异性Th1应答,进一步激活抗原特异性CTL并诱导IFN-γ产生。     

mRNA疫苗冲击树突状细胞诱导抗肿瘤免疫反应的研究

目的：以消化道肿瘤组织mRNA冲击自体DC，诱导特异性免疫应答。方法：20例消化道肿瘤患者外周血分离PBMC(外周血单核细胞)，在IL-4、GM-CSF联合作用下诱导DC，从消化道肿瘤组织中提取mRNA并分别在有脂质体或无脂质体介导下冲击DC，与未经纯化的T细胞混合培养，诱导CTL(细胞毒性T淋巴细胞)。以CTL作为效应细胞，以胃癌细胞系803为靶细胞，LDH释放实验检测杀伤活性。结果：细胞表面标记检测显示诱导前后CD3、CD4、CD14显著下降，CD40、CD86、CD1a、CD83、HLA-DR显著升高，表明IL-4、GM-CSF、联合作用下有效诱导出DC，混合淋巴细胞增殖实验表明该DC具有抗原递呈，刺激淋巴细胞增殖的功能。经脂质体介导的mRNA冲击DC诱导的特异性杀伤反应与未经脂质体介导的mRNA冲击DC诱导的特异性杀伤反应比较，其杀伤率经统计学分析无显著性差异。而二者与单纯经IL-2诱导的未经纯化的T细胞产生的非特异性杀伤比较均有显著性差异。结论：以肿瘤细胞mRNA冲击DC诱导CTL可有效杀伤肿瘤细胞，有可能成为一独特的免疫治疗方法。     

EBV特异性细胞毒淋巴细胞的体外诱导和对鼻咽癌细胞的杀伤活性

目的 探索体外诱导和扩增EBV特异性细胞毒T淋巴细胞(CTL)的方法,探讨其应用于鼻咽癌(NPC)治疗的可能性.方法 用EB病毒转化的B淋巴细胞系为抗原递呈细胞及抗原刺激剂,经照射灭活后刺激自体外周血单个核细胞(PBMC),产生EBV特异性CTL,以抗人CD3抗体OKT-3/同种异体PBMC法扩增.并检测其对NPC细胞的特异性杀伤.结果 在体外有效诱导和扩增了EBV特异性的CTL.扩增前CTL对自体BLCL的杀伤率为76%,对同种异体BLCL的杀伤率为13%,对自体肿瘤细胞的杀伤率为51%,对CNE鼻咽癌细胞的杀伤率为27%.扩增后的杀伤率分别为63%、25%、49%、33%.扩增后CTL对肿瘤杀伤力没有明显下降.结论 EBV特异性CTL能在体外有效地诱导,对NPC细胞有特异性的杀伤力,能在体外大量地扩增,且扩增后对肿瘤的杀伤力没有明显下降,有望成为NPC患者有效的过继免疫治疗方法.     

肿瘤抗原MUC4 HLA-A*0201限制性CTL表位的体外免疫效应研究

目的:探讨肿瘤抗原MUC4 HLA-A*0201限制性细胞毒性T淋巴细胞(CTL)表位肽负载树突状细胞诱导CTL的体外免疫效应.方法:从外周血单个核细胞(PBMC)中诱导树突状细胞(DC).用之前表位预测法预测并合成的五种肽分子分别脉冲成熟的DC,并刺激HLA-A*0201 健康人自体CD8 T细胞成为CTL.用酶联免疫斑点法(ELISPOT),检测CTLIFN-γ的分泌.同时用乳酸脱氢酶(LDH)释放法检测其对靶细胞的杀伤作用.结果:人PBMC可在多种细胞因子的作用下被诱导称为DC.肽P01204诱导的CTL,在不同的效靶比可特异性杀伤P01204脉冲的T2细胞[5∶1时为(9.03±0.24)%,10∶1时为(19.62±0.44)%,20∶1时为(27.93±2.22)%]和MUC4 、HLA-A2 的HCT-116细胞[5∶1时为(7.26±0.18)%,10∶1时为(16.83±0.40)%,20∶1时为(25.23±1.35)%],均高于阴性对照组(P＜0.05),能够产生IFN-γ的细胞数(130.33±6.58)明显高于阴性对照组(P＜0.05).结论:肿瘤相关抗原MUC4的HLA-A*0201限制性CTL表位P01204,能诱导入外周血单核细胞的CTL反应,该活化的CTL能分泌免疫活性物质诱导特异性靶细胞的凋亡.     

LMPs特异性T淋巴细胞对鼻咽癌细胞的杀伤作用

目的:研究树突状细胞负载EB病毒潜伏膜蛋白(latent membrane proteins,LMPs)介导生成的LMPs特异性细胞毒性T淋巴细胞(cytotoxic T lymphocyte,CTL)LMPs-CTL的生物学特性,观察其对LMPs阳性鼻咽癌细胞SUNE的杀伤作用?方法:用淋巴细胞分离液分离人外周血单核细胞,采用贴壁分离及白细胞介素(interleukin,IL)-4?粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(granulocyte-macrophage colony stimulating factor,GM-CSF)等细胞因子诱导成熟树突状细胞(dendritic cell,DC),通过DC细胞负载LMPs多肽抗原并递呈给同源T淋巴细胞,制备LMPs-CTL?CCK8法检测LMPs-CTL对SUNE细胞的杀伤作用;ELISA和羟基荧光素二醋酸盐琥珀酰亚胺脂(carboxy fluoroscein succinimidyl ester,CFSE)染色法检测LMPs-CTL分泌IFN-γ及其增殖?结果:LMPs-CTL对SUNE细胞的杀伤率在12 h和24 h分别为(43.47 ± 1.93) %和(77.15 ± 3.18) %,显著高于对照组的(11.45 ± 3.06) % 和(24.27 ± 13.20)%(P < 0.05)?SUNE细胞刺激后,LMPs-CTL增殖能力较对照组有明显增强,IFN-γ分泌量达到(613.40 ± 121.77) pg/ml,显著高于对照组(86.90 ± 3.70) pg/ml(P < 0.05)?结论:通过DC细胞负载LMPs混合多肽可诱导生成LMPs-CTL,对LMPs阳性鼻咽癌细胞有较强的杀伤作用?     

人DC与黑色素瘤细胞融合疫苗体外诱导特异性抗肿瘤CTL

目的：探讨HLA-A2-的黑色素瘤细胞与HLA-A2＋的树突状细胞（DC）融合后体外诱导Me-lan-A特异性细胞毒性T淋巴细胞（CTL）的作用及交叉抗原递呈的能力。方法：用PEG法将黑色素瘤细胞与DC融合,在含GM-CSF的RPMI1640完全培养基条件下继续培养24～48h,然后将融合细胞与Me-lan-A特异性T细胞共同培养,用细胞内细胞素染色法检测其诱导CTL的活性,流式细胞术分析T细胞的活化率。结果：从异体外周血分离的单核细胞在GM-CSF及IL-4条件下培养6d后,未成熟的DC能表达一定的CD80,CD83,CD86,HLA-DR和HLA-ABC等共刺激分子,而经TNF-浕,PGE-2及CD40L诱导成熟的DC,则这些分子的表达进一步上调。融合细胞体外活化Melan-A特异性T细胞的效率为16.72%&#177;4.26%,阴性对照为0.21%&#177;1.84%,阳性对照为28.60%&#177;5.67%。融合细胞活化的CTL能有效地溶解HLA-A2的黑色素瘤细胞。结论：HLA-A2-的黑色素瘤细胞与HLA-A2＋阳性的DC融合肿瘤疫苗,能在体外有效地交叉递呈MHC-I限制性肿瘤抗原,并诱导Melan-A特异性的CTL和有效地杀伤黑色素肿瘤细胞。     

肿瘤exosome诱导的细胞毒性T细胞的特异性杀伤作用

目的:检测癌细胞来源的外排小体exosome在体外刺激细胞毒性T细胞(CTL)特异性杀伤癌细胞的能力。方法:从外周静脉血中分离和培养树突细胞(DC),分离纯化舌鳞癌Tca-8113细胞培养上清液中的exosome,并将exosome负载至DC上,诱导T淋巴细胞活化为细胞毒性T细胞(CTL),把CTL加入到靶细胞(Tca-8113和95-D)培养体系中,18h后利用MTT比色法测定CTL对靶细胞的杀伤活性。结果:从外周静脉血中分离的单核细胞,经粒细胞-单细胞集落刺激因子(GM-CSF)和白细胞介素4(IL-4)的培养可分化为DC,经exosome冲击后,诱导的CTL对Tca-8113细胞具有显著的杀伤作用,在效靶比为20:1时,18h平均杀伤率为(43.60±5.66)%(P<0.01),但对95-D细胞无明显杀伤作用,杀伤率为(29.7±8.78)%(P>0.05)。结论:肿瘤细胞分泌的exosome,负载到DC上后,可以活化T细胞,使之成为抗原特异性的CTL,并具有特异性的杀伤肿瘤细胞的功能。     

MAGE-A3抗原肽负载树突状细胞诱导乳腺癌患者免疫应答的研究

目的研究MAGE-A3抗原肽负载对乳腺癌患者树突状细胞(DC)的功能的影响,探讨其是否可以在体外诱导特异性细胞毒性T淋巴细胞(CTL)应答.方法体外培养HLA-A2乳腺癌患者外周血来源的DC,并经孵育携带MAGE-A3抗原肽,用以刺激CTL,用3H-TdR渗入法检测抗原肽负载前后DC刺激同种淋巴细胞增殖能力(MLR),并用乳酸脱氢酶(LDH)释放法检测CTL对靶细胞的杀伤效应.结果DC:T为1:10时,单纯DC组刺激能力显著高于抗原肽负载组DC(DC-P)(P＜0.05),但当DC:T低于1:20时后DC-P组刺激能力显著强于单纯DC组(P＜0.05).DC-P组和单纯DC组所激发的CTL对细胞株MCF-7,Sk-Br-3,MDA-MB-435s的杀伤活性有显著性差异,而对细胞株Raji无显著性差异,DC-P组对细胞株MCF-7,Sk-Br-3,MDA-MB-435s的杀伤活性明显高于对细胞株Raji的杀伤活性.结论负载MAGE-A3抗原肽的DC在体外可以诱导乳腺癌患者特异性的CTL免疫应答,为临床以DC为基础的过继免疫治疗的应用提供理论基础.