神经调节蛋白-1诱导小鼠胚胎干细胞向心肌细胞分化

目的 观察神经调节蛋白-1(NRG-1)诱导小鼠胚胎干细胞(ESCs)向心肌细胞分化及扩增心肌细胞的作用.方法 分别观察ESCs自发及NRG-1诱导情况下心肌细胞分化率;RT-PCR检测心肌早期转录因子GATA-4、Nkx2.5 mRNA及心肌骨架蛋白α-MHC、β-MHC mRNA的表达;细胞免疫组化检测心肌α-actinin蛋白表达;血管活性药物刺激观察心肌细胞的功能反应.结果 NRG-1诱导的心肌细胞分化率显著高于自发的心肌细胞分化率(P<0.05),且诱导生成的心肌细胞对肾上腺素能及胆碱能药物刺激呈现相应的频率反应,刺激前后搏动频率差异均有统计学意义(P<0.05);NRG-1呈剂量依赖性上调GATA-4、Nkx2.5 mRNA的表达,在NRG-1为100 ng/mL时表达水平最高,且两者的相对表达量明显高于自发分化组的相对表达量(P<0.05或P<0.01);NRG-1干预增加心肌细胞骨架蛋白α-MHC、β-MHC mRNA水平且增强α-actinin蛋白表达(P<0.05).结论 外源性NRG-1早期干预能够诱导ESCs向心肌细胞分化并扩增ESCs分化形成的心肌细胞.     

神经调节蛋白-1诱导小鼠胚胎干细胞向心肌细胞分化

目的 观察神经调节蛋白-1(NRG-1)诱导小鼠胚胎干细胞(ESCs)向心肌细胞分化及扩增心肌细胞的作用.方法 分别观察ESCs自发及NRG-1诱导情况下心肌细胞分化率;RT-PCR检测心肌早期转录因子GATA-4、Nkx2.5 mRNA及心肌骨架蛋白α-MHC、β-MHC mRNA的表达;细胞免疫组化检测心肌α-actinin蛋白表达;血管活性药物刺激观察心肌细胞的功能反应.结果 NRG-1诱导的心肌细胞分化率显著高于自发的心肌细胞分化率(P<0.05),且诱导生成的心肌细胞对肾上腺素能及胆碱能药物刺激呈现相应的频率反应,刺激前后搏动频率差异均有统计学意义(P<0.05);NRG-1呈剂量依赖性上调GATA-4、Nkx2.5 mRNA的表达,在NRG-1为100 ng/mL时表达水平最高,且两者的相对表达量明显高于自发分化组的相对表达量(P<0.05或P<0.01);NRG-1干预增加心肌细胞骨架蛋白α-MHC、β-MHC mRNA水平且增强α-actinin蛋白表达(P<0.05).结论 外源性NRG-1早期干预能够诱导ESCs向心肌细胞分化并扩增ESCs分化形成的心肌细胞.     

体外诱导鼠胚胎干细胞向心肌细胞分化的实验研究

目的:探讨小鼠胚胎干细胞(ESCs)在转化生长因子β1(TGFβ1)联合内脏内胚层END2细胞共培养诱导条件下分化为心肌细胞的特征。方法:小鼠胚胎干细胞在小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)饲养层上增殖培养,先将ESCs悬浮培养形成23d的拟胚体(EBs),再将23dEBs种植到含有TGFβ1的24孔板中进行诱导,以及种植到铺有END2细胞饲养层的24孔板中进行诱导,培养液中同时加入TGFβ1。免疫细胞荧光技术检测心肌细胞特异性肌动蛋白(αActin)及肌钙蛋白T(TnT)的表达,透射电镜观察分化心肌细胞的超微结构。流式细胞仪检测EBs集落心肌细胞的平均分化率。结果:TGFβ1诱导组和TGFβ1联合内脏内胚层END2细胞共培养诱导组分别有43%,91%(P<0.05)的拟胚体出现自发节律性收缩,均表达心肌细胞特异性蛋白αActin和TnT,以及观察到心肌样超微结构,但在共培养的条件下,自发节律性收缩区域较大,且细胞形态较单一。两诱导组EBs集落心肌细胞平均分化率分别是35%,74%(P<0.05)。结论:TGFβ1联合内脏内胚层END2细胞共培养对小鼠ESCs向心肌细胞定向分化有协同作用,具有较高的诱导分化率。     

CHIR99021和Wnt3a在小鼠胚胎干细胞向心肌细胞分化中的作用

目的 观察Wnt/β-catenin信号通路激活剂CHIR99021和Wnt3a在小鼠胚胎干细胞(mESCs)向心肌细胞分化中的作用.方法 采用悬浮一步培养法形成拟胚体(EBs),在EBs形成后第2天至第5天分别加入CHIR99021、Wnt3a,命名为CHIR99021组及Wnt3a组,将自动分化的EBs作为对照组.用免疫荧光法检测心肌特异性蛋白肌球蛋白重链(α-MHC)、肌钙蛋白T(cTNT)及膜联蛋白43(CX43)的表达.用qRT-PCR检测中胚层标志基因Brachyury、心肌前体细胞标志基因Nkx2.5、心肌细胞特异性标志基因α-MHC、cTnT和Cx43 mRNA的表达.用Western blot法检测 α-MHC、cTNT和CX43蛋白表达.结果 免疫荧光法提示各组mESCs能够向心肌细胞分化.在CHIR99021和Wnt3a诱导分化过程中,Brachyury在分化第7天达高峰;Nkx2.5、α-MHC、cTnT和Cx43的mRNA表达量随着分化时间的延长而逐渐增加,第15天增加最为明显,且CHIR99021组和Wnt3a组高于对照组;CHIR99021组优于Wnt3a组(P<0.05,P<0.01).Western blot检测结果显示CHIR99021组和Wnt3a组α-MHC、cTNT和CX43蛋白表达量明显高于对照组,CHIR99021组高于Wnt3a组.结论 CHIR99021和Wnt3a在分化早期阶段通过活化Wnt/β-catenin信号通路可促进mESCs心肌细胞分化,且CHIR99021促心肌分化作用优于Wnt3a.     

p α-MHC/EGFP小鼠胚胎干细胞株的构建及其向心肌细胞分化的观察

目的构建含有心肌特异性基因肌球蛋白重链α(α-MHC)调控的增强型绿色荧光蛋白(EGFP)表达的载体并转染到小鼠胚胎干细胞(ESC),建立p α-MHC/EGFP小鼠ESC株,利用该细胞株可识别和纯化分化形成的心肌细胞。方法应用电穿孔技术将pα-MHC/EGFP载体转染到ESC,G418筛选10~12d后收集G418抗性细胞克隆并采用悬滴法体外诱导向心肌分化。通过PCR扩增细胞克隆基因组EGFP片段,并在心肌分化过程中通过荧光显微镜观察EGFP的表达,鉴定pα-MHC/EGFP胚胎干细胞株的建立。细胞免疫组化法检测自发性搏动拟胚体(EB)中EGFP阳性区域心肌肌钙蛋白T的表达。结果G418抗性细胞克隆基因组中能够扩增EGFP片段;在心肌细胞分化过程中,荧光显微镜下能观察到EB局部出现自发性搏动的亮绿色细胞团;细胞免疫组化检测显示,EGFP阳性区域肌钙蛋白T表达阳性。结论成功构建了pα-MHC/EGFP胚胎干细胞株,该细胞株在分化为心肌细胞的同时表达EGFP,便于对心肌细胞进行识别和纯化。     

p α-MHC/EGFP小鼠胚胎干细胞株的构建及其向心肌细胞分化的观察

目的 构建含有心肌特异性基因肌球蛋白重链α(α-MHC)调控的增强型绿色荧光蛋白(EGFP)表达的载体并转染到小鼠胚胎干细胞(ESC),建立p α-MHC/EGFP小鼠ESC株,利用该细胞株可识别和纯化分化形成的心肌细胞. 方法 应用电穿孔技术将p α-MHC/EGFP载体转染到ESC,G418筛选10～12 d后收集G418抗性细胞克隆并采用悬滴法体外诱导向心肌分化.通过PCR扩增细胞克隆基因组EGFP片段,并在心肌分化过程中通过荧光显微镜观察EGFP的表达,鉴定p α-MHC/EGFP胚胎干细胞株的建立.细胞免疫组化法检测自发性搏动拟胚体(EB)中EGFP阳性区域心肌肌钙蛋白T的表达. 结果 G418抗性细胞克隆基因组中能够扩增EGFP片段;在心肌细胞分化过程中,荧光显微镜下能观察到EB局部出现自发性搏动的亮绿色细胞团;细胞免疫组化检测显示,EGFP阳性区域肌钙蛋白T表达阳性. 结论 成功构建了p α-MHC/EGFP胚胎干细胞株,该细胞株在分化为心肌细胞的同时表达EGFP,便于对心肌细胞进行识别和纯化.     

抑制LIF/Stat3信号通路促进小鼠胚胎干细胞向心肌细胞分化

目的 研究LIF/Stat3信号通路对小鼠胚胎干细胞(mESCs)分化成心肌细胞的影响.方法 利用mESCs形成拟胚体(EBs)进行心肌分化.在野生型mESCs形成EBs的过程中加入Janus激酶(JAK)抑制剂以抑制LIF/Stat3信号通路(JAKi组).而在融合表达雌激素受体(ER)和Stat3的Stat3ER细胞株进行分化过程中添加4-羟基他莫西酚(4HT)以激活LIF/Stat3信号通路 (4HT组).用qRT-PCR检测心脏特异转录因子NKX25、α-肌球蛋白重链(α-MHC)和连接蛋白43(Cx43)以及mESCs自我更新基因oct4、nanog和Stat3下游基因socs3的表达水平.用Western blot检测和免疫荧光染色法验证α-MHC和Cx43的相对表达.结果 免疫荧光结果显示在自发搏动的EBs中出现α-MHC和Cx43的荧光,表明心肌细胞分化成功.随着分化时间的延长,NKX2.5、α-MHC和Cx43的mRNA表达量逐渐增加,至第15天时最为明显,且JAKi组高于对照组(P<0.01);对照组高于4HT组(P<0.01).而nanog、oct4随着分化时间的延长逐渐降低,且JAKi组低于对照组(P<0.05),而4HT组高于其对照组(P<0.05).Socs3的表达量在JAKi组一直较低且低于对照组,在4HT组表达较高且高于对照组(P<0.01).Western blot检测结果显示第15天的Cx43和α-MHC蛋白表达量JAKi组明显高于对照组(P<0.05),4HT组低于其对照组(P<0.05).结论 抑制LIF/Stat3信号通路促进小鼠胚胎干细胞分化成心肌细胞;激活LIF/Stat3信号通路抑制小鼠胚胎干细胞的心肌细胞分化.     

人诱导多能干细胞向血管内皮细胞分化方法的建立

目的:建立一种新的促进人诱导多能干细胞(iPSc)向血管内皮细胞(VEC)分化的方法.方法:将未分化的人iPSc制备成拟胚体(EBs),分为常氧组(A组)、常氧加血管内皮生长因子(VEGF)组(B组)、常氧加甲基乙二酰氨基乙酸(DMOG)组(C组)、缺氧组(D组)、缺氧加VEGF组(E组)及缺氧加DMOG组(F组),分别给予相应处理;观察各组iPS-EBs分化的VEC形态结构,应用逆转录PCR(RT-PCR)法检测VEC特异基因CD31、CD34、VE-cad、KDR、vWF的表达,免疫荧光细胞法检测以mRNA表达最强组的VEC特异基因在细胞定位情况判断VEC分化情况.结果:RT-PCR结果显示未经诱导iPSc不表达任何VEC相关基因,A组EBs细胞仅表达微弱的VE-cad和KDR;经条件诱导后iPS-EBs细胞表达CD31、CD34、VE-cad、KDR、vWF,C组表达最强,与其他各组比较差异有统计学意义(P＜0.05);免疫荧光结果显示C组中CD31、CD34为膜表达,KDR、vWF为胞浆表达.结论:常氧状态下加入DMOG培养能成功促进人iPSc向VEC分化.     

环孢霉素A诱导胚胎干细胞向心肌细胞分化

目的：观察环孢霉素A（CSA）对小鼠胚胎干细胞（ESCs）向心肌细胞分化的影响。方法：分别观察ESCs自发和CSA诱导情况下心肌细胞分化率,细胞免疫组化检测心肌细胞标志物的表达。结果：CSA诱导的心肌细胞分化率明显高于自发的心肌细胞分化率,且诱导生成的心肌细胞具备心肌细胞特有的特征。结论：CSA能够诱导ESCs向心肌细胞分化并扩增ESCs分化形成的心肌细胞。     

脐血CD34+细胞向内皮细胞定向诱导分化的实验研究

目的探讨人脐血CD34 细胞体外分离、纯化、诱导扩增和分化为内皮细胞的可行性,并检测其表型。方法采集新鲜脐血经抗凝处理及无菌包装,Ficoll密度梯度离心法得单个核细胞,磁珠分选方法(MACS)分离出CD34 单个核细胞,M-199培养基中诱导分化,细胞形态学观察CD34 和CD34-细胞生长情况,流式细胞仪检测内皮细胞CD31表型,免疫组化验证蛋白水平表达。结果细胞形态学观察发现,刚分离的CD34 和CD34-单个核细胞呈圆形,形态小。CD34 细胞培养3d后有明显集落形成,7d后呈梭行细胞,出现典型线样排列结构。经诱导培养后,内皮细胞表型CD31阳性率为(70.03±10.27)%。免疫组化染色证实了内皮特异性成分ecNOS和flk-1/KDR蛋白水平的表达。而CD34-细胞单独培养,少部分细胞贴壁,呈现出不规则形态。结论MACS法分离脐血CD34 细胞,体外诱导扩增和分化后贴壁细胞具有内皮细胞形态,通过流式细胞仪和免疫组化验证了贴壁细胞中大部分细胞具有内皮系标志物表达。     

川芎含药血清对小鼠胚胎干细胞增殖和分化的影响

【目的】观察川芎含药血清对小鼠胚胎干细胞(ES细胞)增殖及分化的影响。【方法】川芎含药血清与ES细胞共培养,采用CCK-8法检测细胞活性,逆转录—聚合酶链反应(RT-PCR)法检测心肌细胞特异基因肌球蛋白重链(β-MHC)m RNA的表达水平。【结果】与大鼠血清组和胎牛血清组比较,川芎含药血清组的ES细胞活性差异无统计学意义(P0.05),川芎含药血清组心肌细胞特异基因β-MHC表达水平显著升高,差异有统计学意义(P0.05)。【结论】川芎含药血清对ES细胞向心肌细胞分化有促进作用。     

类胚体中残留未分化胚胎干细胞的初步研究

目的 探讨类胚体中残留未分化胚胎干细胞（ESC）的特性。方法 小鼠R1和Oct-4-GFP转基因ESC细胞株,体外类胚体分化20 d后消化打散,重新给予ESC常规培养液培养。观察类胚体中残留未分化细胞形态;流式细胞仪和免疫荧光染色检测和观察残留细胞表面标志物及体外再次分化能力。将残留细胞扩增后注射入裸鼠背部皮下和大腿肌肉内,6周后注射部位取材进行大体和组织学检查。结果 分化20 d的类胚体中存在残留未分化ESC,生长形态呈克隆样,表达SSEA1、CD31、CD9和Oct-4等未分化ESC标志;细胞能反复传代,并可在体外再次分化和残留。残留细胞注射部位形成畸胎瘤,瘤体组织中存在成熟的内胚层、中胚层和外胚层组织。结论 胚胎干细胞分化为类胚体后仍存在残留未分化全能ESC,残留细胞在体内、外可再次分化,并能在体外分化中再次残留。     

同源盒基因Nkx2-5促进5-氮胞苷诱导的单层P19细胞表达心肌标志物

目的:探讨同源盒基因Nkx2-5基因在5-氮胞苷(5-aza)诱导单层生长的P19细胞向心肌细胞分化中的作用。方法:以稳定表达Nkx2-5的P19细胞为实验组,P19细胞为对照组。两组细胞均单层培养并以5-aza(1μmol/L)诱导,倒置显微镜下观察细胞的生长状态;在诱导后4、8、12、16 d,以RT-PCR检测转录因子GATA-4、α-肌球蛋白重链(α-MHC)和心房利钠多肽(ANP)基因的表达。结果:对照组经5-aza诱导后ANP没有表达;GATA-4在8、12、16 d有表达;α-MHC在12、16 d有表达。实验组5-aza诱导后,GATA-4在诱导4、8、12、16 d有表达;α-MHC和ANP都是在5-aza诱导后的8、12和16 d表达。两组结果比较显示实验组GATA-4和α-MHC基因的表达时间提前;两组除α-MHC在12 d的表达无差异外,其他取材时间点实验组两个基因的表达量与对照组相比均增高,差异有统计学意义(P<0.05,P<0.01)。结论:Nkx2-5促进5-aza诱导的单层生长的P19细胞向心肌分化。     

G-CSF体外诱导新生小鼠心肌干细胞分化的研究

目的了解新生小鼠心肌干细胞（cardiac stem cells，CSCs）在体外的分化潜能，为重建缺血及坏死心肌的临床应用提供依据。方法采用组织块贴壁法体外培养小鼠CSCs，以免疫磁珠细胞分离（MACS）系统纯化原代细胞。纯化所得细胞分别予4个浓度的粒细胞集落刺激因子（G—CSF）进行诱导，应用流式细胞术（FCM）、免疫荧光染色（IFS）鉴定细胞表刊，RT—PCR检测心肌转录因子GATA-4与心肌结构基因B—MHC的表达。结果由组织块培养所得的原代细胞经FCM、IFS检测证实其部分表达Sca-1和CD45。采用MACS成功得到高纯度的细胞，行FCM、IFS鉴定其表型为Sca-1＋／CD45-，RT—PCR检测显示其表达GATA-4，不表达β-MHC。纯化的细胞予诱导后培养3周，整个培养过程未见单个或成团细胞的自发搏动。诱导后3周各组细胞再次经FCM检测见Sca-1的表达均比诱导前减弱，RT—PCR检测见诱导后的细胞仍然不表达B—MHC。结论应用MACS后成功得到高纯度的表型为Sca-1＋／CD45-的CSCs；CSCs Sca-1的表达量可能随培养时间的延长而下降；G—CSF未能将CSCs诱导分化为心肌细胞。     

细胞外基质的程序性应用促进胚胎干细胞的神经分化

目的 探讨细胞外基质(ECM)在胚胎干细胞(ESCs)诱导分化中特定时期的作用.方法 将ESCs悬浮培养形成胚胎小体(Embryonic bodies,EBs),用高浓度维甲酸(RA)诱导,再将EBs接种在GL、FN、LPO基质上进行分化,利用免疫荧光方法 比较这些基质对神经分化的影响;进一步检测LPO对神经突起生长的影响.结果 高浓度RA启动并加速了nestin阳性的神经前体细胞的分化;FN对ESCs的神经分化具有剂量依赖性的促进作用,可提高神经元的分化率;LPO基质能够促进神经细胞的突起生长,进一步诱导神经细胞的成熟.结论 不同基质在分化的特定阶段起到了不同作用,在诱导神经前体分化阶段应用FN以及在诱导神经细胞分化阶段应用LPO的联合作用对ESCs向神经细胞分化作用最显著.     

小鼠胚胎干细胞分化为心肌细胞的体外实验

目的：探索提高胚胎干细胞（ESC）体外诱导分化为心肌细胞的实验方法.方法：采用悬滴—悬浮—贴壁三步法（悬滴三步法）和悬浮—贴壁两步法（悬浮两步法）,按诱导剂的不同分为Ⅰ组：丹参＋5-氮杂胞苷（5-aza）组;Ⅱ组：丹参＋维甲酸（RA）组;Ⅲ组：5-aza组;Ⅳ组：丹参组;Ⅴ组：RA组;Ⅵ组：阴性对照组6组进行诱导培养,比较在2种培养方法下各组心肌细胞的分化率.结果：Ⅰ,Ⅲ,Ⅳ,Ⅴ,Ⅵ组采用悬滴三步法培养的心肌细胞分化率分别为（77.78±5.09）%,（66.67±8.82）%,（51.11±1.92）%,（44.44±5.09）%,（23.33±3.34）%;采用悬浮两步法培养的心肌细胞分化率分别为（42.22±6.94）%,（36.67±8.82）%,（25.55±10.71）%,（17.78±5.09）%,（10.00±2.84）%.各组心肌细胞分化率悬滴三步法较悬浮两步法高,差异具有统计学意义（P〈0.05）.采用悬滴三步法培养Ⅰ组心肌细胞分化率最高可达78%,与其它各组相比较差异具有统计学意义（P〈0.05）.结论：悬滴三步法联合采用中药丹参与5-aza为诱导剂,可为体外ESC分化为心肌细胞的实验方法提供理论依据.     

类胚体中残留细胞分化全能性维持与外源性白血病抑制分化因子的关系

目的 研究小鼠胚胎干细胞体外类胚体分化后残留未分化细胞的分化能力,探讨其分化全能性维持与外源性白血病抑制分化因子（LIF）的关系。方法 小鼠R1胚胎干细胞体外经20 d的类胚体诱导分化后,胰酶消化为单细胞悬液,在不含LIF的DMEM培养液中贴壁培养。扩增后的细胞用流式细胞仪分析未分化及分化表面标志（CD9、SSEA1和Flk-1）的表达情况。分别于再次类胚体诱导分化前后,RT-PCR检测Oct-4、Nanog、Rex1、FGF5、Nestin、Brachyury、Flk-1和GATA6表达。将扩增后的残留细胞注射至裸鼠皮下,检测畸胎瘤形成能力。Oct-4/GFP 转基因小鼠胚胎干细胞在半固体培养基上作单细胞分化,20 d后统计分化残留率。结果 在不含LIF的DMEM培养液中的残留细胞呈克隆样生长,表达未分化胚胎干细胞标志CD9、SSEA1、Oct-4、Nanog和Rex1。残留细胞体外可再次诱导分化,表达3个胚层的分化标志。残留细胞裸鼠皮下注射6周后形成畸胎瘤。单细胞分化实验表明,常规培养的小鼠胚胎干细胞中约14%的细胞具有分化残留能力。结论 残留胚胎干细胞全能性维持不依赖外源性白血病抑制分化因子;常规培养的胚胎干细胞仅部分具有残留能力。