两种siRNA转染方法对T24/ADM多药耐药性的影响

目的:评价2种转染小干扰RNA(siRNA,small interfering RNA)方法对膀胱癌多药耐药性(MDR)的影响。方法:设计MDR基因的siRNA,用脂质体和电转的方法转染膀胱癌T24/ADM细胞,用RT-PCR分析mRNA的表达,流式细胞仪检测细胞内糖蛋白(P-gp)的表达和阿霉素积累量。结果:siRNA能明显地逆转T24/ADM细胞的多药耐药。电转染的方法抑制基因的效果优于脂质体转染的方法,P-gp表达下调,细胞内阿霉素积累量显著增加(P<0.05)。结论:2种转染方法均能够逆转膀胱癌的多药耐药性,电转染的方法优于化学转染方法。     

外排转运体和代谢酶与黄酮的相互作用及其对黄酮肠吸收影响的研究进展

黄酮类化合物大量存在于植物界中,具有广泛的药理作用,可预防及治疗癌症、心脑血管疾病、骨质疏松等。口服给药后,大量黄酮类化合物存在生物利用度低的现象。国内外诸多学者对其吸收代谢机制进行了研究。研究表明,肠上皮细胞的ATP-依赖性外排转运体如P-糖蛋白(P-gp)、多药耐药相关蛋白-2(MRP2)和乳腺癌耐药蛋白(BCRP)和细胞内的Ⅱ相代谢酶(UGT等)是影响黄酮肠吸收的主要因素。综述近年来外排转运体和代谢酶对黄酮类化合物肠吸收影响的研究概况,包括ATP-依赖性外排转运体与代谢酶的协同作用,黄酮类化合物对二者功能的调节作用等,以期为提高黄酮的生物利用度和临床合理利用提供理论依据。     

人鞘磷脂合酶干扰载体的构建与鉴定

 【摘要】目的 构建沉默人鞘磷脂合酶1 (SMS1)和鞘磷脂合酶2 (SMS2)基因表达的重组干扰载体,为进一步研究人SMS1和SMS2基因与动脉粥样硬化及其他疾病发生的关系提供研究基础。方法 根据基因序列数据库中报道的人SMS1和SMS2基因序列及短发夹RNA (shRNA) 设计原则,设计并合成用于构建人SMS沉默载体的DNA寡核苷酸,应用基因重组技术分别和线性化pSUPER干扰载体连接,构建了pSUPER-SMS1和pSUPER-SMS2重组干扰载体,并用EcoRI和HindIII限制性内切酶同时处理重组载体pSUPER-SMS1和pSUPER-SMS2,随后测序,以鉴定重组干扰载体含有目的序列。同时为检测重组干扰载体对人SMS1和SMS2基因的干扰效率,本研究利用脂质体(Lipofectamine 2000)分别转染肝癌细胞HepG2,于48 h 后分别检测HepG2细胞SMS1和SMS2 mRNA的转录水平与SMS酶活(薄层层析法,TLC)。结果 所筛选到的重组质粒pSUPER-SMS1和pSUPER-SMS2经EcoRⅠ和HindⅢ双酶切后获得了281 bp DNA片段,且测序结果和理论设计的DNA寡核苷酸一致;随后检测转染HepG2细胞后SMS1和SMS2的mRNA表达水平。实验结果显示SMS1和SMS2的表达分别下降了45%和67%(P<0.001,n=3),而TLC法的酶活结果检测显示,SMS1和SMS2干扰后的SMS酶活均有显著下降,分别下降了 56%和63%(P<0.001,n=3)。结论 成功构建了人SMS1以及SMS2基因的沉默载体即pSUPER SMS1和pSUPER SMS2。     

RNA干扰MRP2表达逆转结肠癌细胞对长春新碱的耐药性

目的 构建MRP2基因的真核表达载体pGenSil-1-MRP2-siRNA,并观察其转染人结肠癌耐长春新碱细胞株HCT-8/V前后MRP2基因和ABCC2蛋白表达变化以及对化疗药物敏感性变化.方法 设计MRP2特异性siRNA的序列,克隆至pGenSil-1质粒中,测序鉴定后,用脂质体将重组质粒转染至HCT-8/V细胞中,用定量RT-PCR和Western blot检测MRP2的表达,MTT实验测定pGenSil-1-MRP2-siRNA和长春新碱对HCT-8/V细胞增殖抑制作用.结果 在结肠癌耐药细胞HCT-8/V中,RNAi明显抑制了MRP2 mRNA及蛋白的表达,在相同浓度化疗药物的作用下,RNA干扰组细胞凋亡比例显著高于对照组(P<0 01),表明细胞耐药性显著下降,对药物敏感性显著增高.结论 成功构建了MRP2的siRNA真核表达载体,并且对结肠癌耐药细胞MRP2的表达有明显抑制作用,取得良好的逆转耐药效果.     

联合应用以MRP和bcl-2为靶标的siRNA对肺癌细胞耐药和凋亡的影响

目的研究联合转染以MRP和bcl-2为靶标的siRNA,肺癌细胞株SW1573和SW1573／R20药物敏感性及凋亡的改变。方法以MRP和bcl-2为靶标的siRNA（均为100μmol／L）分别或联合转入柔红霉素处理的SW1573和SW1573／R20与单纯化疗处理组和未处理组对照。转染后24、48、72h MTT法检测各组生长抑制率,计算IC50值。RT-PCR检测转染12h各组相应靶基因mRNA表达水平,流式细胞仪检测转染48h各组MRP和bcl-2蛋白表达率和细胞凋亡率。结果细胞转染siRNA后,相应靶基因mRNA及蛋白表达明显减低,细胞的凋亡率升高,IC50均较单纯化疗组低,有统计学意义〈0．01）;联合应用两种siRNA后细胞IC50进一步下降,细胞凋亡率显著升高,与各组相比均有统计学差异俨〈0．05）。结论联合以MRP和bcl-2基因为靶标的siRNA,通过降低靶基因蛋白表达,产生协同作用,明显增加耐药和亲本肿瘤细胞药物敏感性和凋亡率。     

siRNA对K562和K562/ADM细胞耐药和凋亡的调节

目的 研究联合转染以MRP和bcl-2基因为靶标的siRNA,对白血病细胞株K562和耐药的K562/ADM细胞药物敏感性和凋亡的影响.方法 体外化学合成以多药耐药相关蛋白(MRP)和bcl-2为靶标的siRNA,分别或联合用脂质体转染人阿霉素处理的K562和K562/ADM以单纯化疗处理组和未处理组为对照.转染后24、48、72 h,MTT法检测各组细胞生长抑制率,计算IC50值.转染24 h后RT-PCR检测各组细胞相应靶基因mRNA表达水平,48 h后流式细胞仪检测细胞MRP和bcl-2蛋白表达率和细胞凋亡率.结果 K562/ADM细胞ADM的IC50为12.81 μg/ml,ADM MRP-siRNA组降为3.74 μg/ml,ADM bcl2-siRNA组降为6.82 μg/ml ADM MRP-siRNA bcl2-siRNA组降至2.51 μg/ml;K562细胞ADM的IC50为6.75 μg/dml,ADM MRP-siRNA组降为3.22 μg/ml,ADM bcl2-siRNA组降为3.56 μg/ml,ADM MRP-siRNA bcl2-siRNA降至1.84 μg/ml,有统计学意义(P<0.01).转染以MRP和bcl-2为靶标的siRNA后,细胞相应靶基因的mRNA及蛋白的表达明显减低,细胞凋亡率显著升高,联合转染两种siRNA,细胞的IC50进一步下降,细胞凋亡率进一步升高,与分别转染组相比有统计学差异(P<0.05);结论联合转染以MRP和bcl-2基因为靶标的siRNA,通过降低靶基因蛋白表达,产生协同作用,明显增加耐药和亲本肿瘤细胞药物敏感性和凋亡率.     

MDR1 siRNA对结肠癌细胞多药耐药性的影响

 [目的]探讨MDR1 siRNA对结肠癌细胞多药耐药性的影响。[方法]设计合成两种针对MDR1 mRNA的siRNA双链分子（#4123 MDR1 siRNA和#4029 MDR1 siRNA）,并转染入COLO 320DM和HT-29结肠癌细胞,观察其对结肠癌细胞MDR1 mRNA和P-gp表达的影响。并分别与5-FU、阿霉素和长春新碱等抗肿瘤药联用,观察结肠癌细胞活力的变化。用阿霉素处理后,观察转染MDR1 siRNA结肠癌细胞的细胞内阿霉素累积浓度的变化。RT-PCR检测细胞MDR1 mRNA的表达,免疫印迹法检测细胞P-gp的表达,MTT法检测细胞活力,流式细胞术检测细胞内阿霉素累积浓度。[结果]#4123 MDR1 siRNA和#4029 MDR1 siRNA均可抑制COLO 320DM结肠癌细胞MDR1 mRNA和P-gp的表达,其最低有效浓度分别为5nmol/L和25nmol/L。同时MDR1 mRNA和P-gp表达的抑制伴随着抗肿瘤药（5-FU、阿霉素和长春新碱）对COLO 320DM结肠癌细胞毒性的增强和细胞内阿霉素累积浓度的增加。而在对照HT-29结肠癌细胞却观察不到此效应。[结论]MDR1 siRNAs能特异逆转结肠癌细胞的多药耐药性,为MDR1/P-gp依赖的多药耐药性结肠癌的治疗提供了一条新的途径。     

MDR1 siRNA对结肠癌细胞多药耐药性的影响

[目的]探讨MDR1 siRNA对结肠癌细胞多药耐药性的影响。[方法]设计合成两种针对MDR1 mRNA的siRNA双链分子（#4123 MDR1 siRNA和#4029 MDR1 siRNA）,并转染入COLO 320DM和HT-29结肠癌细胞,观察其对结肠癌细胞MDR1 mRNA和P-gp表达的影响。并分别与5-FU、阿霉素和长春新碱等抗肿瘤药联用,观察结肠癌细胞活力的变化。用阿霉素处理后,观察转染MDR1 siRNA结肠癌细胞的细胞内阿霉素累积浓度的变化。RT-PCR检测细胞MDR1 mRNA的表达,免疫印迹法检测细胞P-gp的表达,MTT法检测细胞活力,流式细胞术检测细胞内阿霉素累积浓度。[结果]#4123 MDR1 siRNA和#4029 MDR1 siRNA均可抑制COLO 320DM结肠癌细胞MDR1 mRNA和P-gp的表达,其最低有效浓度分别为5nmol/L和25nmol/L。同时MDR1 mRNA和P-gp表达的抑制伴随着抗肿瘤药（5-FU、阿霉素和长春新碱）对COLO 320DM结肠癌细胞毒性的增强和细胞内阿霉素累积浓度的增加。而在对照HT-29结肠癌细胞却观察不到此效应。[结论]MDR1 siRNAs能特异逆转结肠癌细胞的多药耐药性,为MDR1/P-gp依赖的多药耐药性结肠癌的治疗提供了一条新的途径。     

药物转运蛋白对灯盏花素小肠吸收的影响

目的:研究药物转运蛋白P-糖蛋白(P-gp)和多药耐药相关蛋白(MRP2)对灯盏花素小肠吸收的影响。方法:HPLC法测定大鼠肠液中灯盏花素的浓度,以大鼠在体单向灌流实验(SPIP)研究药物的小肠吸收,计算不含抑制剂药物组和含抑制剂药物组的小肠表观渗透系数(Papp)。结果:含P-gp抑制剂药物组与原药组相比,Papp没有显著变化;含MRP2抑制剂药物组与原药组相比,Papp显著增加。结论:P-gp对灯盏花素的小肠吸收基本没有影响,而MRP2可将吸收的灯盏花素从肠上皮细胞内又转运回肠腔,从而降低灯盏花素的吸收。     

MT1X siRNA对肺癌A549/DDP细胞顺铂敏感性的影响

目的探讨金属硫蛋白1X（MT1X）在肺癌耐药细胞株（A549／DDP）顺铂耐药中的作用。方法通过化学合成针对MT1X的siRNA段抑制其在A549／DDP中的表达,实时定量聚合酶链反应（PCR）及WB检测干扰效果,M1Tr及平板克隆形成实验检测干扰前后细胞对顺铂的药物敏感性变化;流式细胞术检测细胞周期和细胞凋亡情况。结果针对MT1X的siRNA片段能在RNA及蛋白水平有效抑制其在A549／DDP中的表达;与对照组相比,MT1X表达被抑制后,肿瘤细胞对顺铂的敏感性明显升高;增殖被抑制,平板克隆形成率明显降低（P〈O．05）,细胞凋亡率显著增高（P〈0．05）。结论针对MT1X的siRNA片段可部分逆转肺癌细胞（A549／DDP）对顺铂的耐受,为提高肺癌的化疗效率提供了一种新方法。     

靛玉红肠吸收转运机制的研究

目的:探讨靛玉红肠吸收转运机制。方法:采用缚管翻转肠囊模型,以维拉帕米为P-糖蛋白抑制剂,丙磺舒为多药耐药相关蛋白(MRP)抑制剂,2,4-二硝基苯酚(DNP)为能量抑制剂,考察加入抑制剂前后药物在空肠和回肠部位的转运量的变化。结果:靛玉红在空肠和回肠部位的转运量无显著性差异(P>0.05);加入抑制剂前后在空肠和回肠部位的转运量亦无显著性差异(P>0.05);通过吸收动力学的研究,发现靛玉红的吸收符合一级吸收模型,Ka为0.015 min-1,且单位时间吸收药量与浓度成正比,符合Fick′s扩散原理。结论:靛玉红的小肠吸收为典型的被动扩散吸收机制。     

HEK293、COS7、7721、HepG2和PC12细胞内神经鞘磷脂合成酶活性比较

目的:分析比较HEK293、COS7、7721、HepG2和PC12的细胞内神经鞘磷脂合成酶(SMS)的活性。方法:收集处于对数生长期的HEK293、COS7、7721、HepG2和PC12细胞,每种细胞的细胞浓度相同;5种细胞均建立2个酶促反应体系,反应时间分别是2 h和3.5 h;薄层层析和灰度扫描分析比较SMS活性强弱。结果:HEK293细胞内的SMS活性较强。结论:建立了有效检测不同来源细胞SMS活性比较的方法,发现HEK293细胞具有较强的SMS活性,可以更好的用于神经鞘磷脂代谢的研究。     

慢性肝损伤对大鼠脑内P-GP及MRP2功能和表达的影响

研究硫代乙酰胺（TAA）诱导的慢性肝损伤（CLF）对大鼠脑内P-糖蛋白（P-GP）和多药耐药蛋白2（MRP2）的功能和表达的影响。大鼠腹腔注射TAA(200 mg/kg),每周两次,连续给药12周诱导慢性肝损伤模型。最后1次给药后24 h,静脉注射P-GP底物罗丹明123（Rho 123）和长春新碱（VCR）,以及MRP2底物溴磺酞钠（BSP）,S-(2,4二硝基苯基)-谷胱甘肽（DNP-SG）,测定大脑皮层、海马和血浆中底物浓度,计算其脑组织/血浆浓度比;用Western blot测定脑内P-GP和MRP2的蛋白表达。结果显示CLF显著升高Rho123和VCR的脑组织/血浆浓度比,显著降低BSP和DNP-SG脑组织/血浆浓度比。Western blot结果表明CLF显著下调脑内P-GP的蛋白水平,显著上调脑内MRP2的蛋白水平。实验结果表明,慢性肝损伤下调大鼠脑内P-GP的功能和表达,上调MRP2的功能和表达。     

HER-2 siRNA对卵巢癌细胞顺铂耐药性的影响

目的:观察表皮生长因子受体2(HER-2)siRNA转染SKOV-3细胞抑制HER-2表达后对卵巢癌细胞耐药性的影响.方法:体外转录合成HER-2序列特异性双链RNA(dsRNA),转染SKOV-3细胞株中,RT-PCR方法检测转染前后HER-2基因的mRNA的表达,MTT法检测顺铂对转染前后卵巢癌细胞的生长抑制率.结果:HER-2siRNA转染72 h后,对SKOV-3细胞HER-2 mRNA表达明显抑制.在不同浓度顺铂(0.05～50μg/ml)的作用下,转染HER-2 siRNA与转染非特异性siRNA、空白对照组相比,差异有十分显著性意义(P＜0.01).细胞对顺铂的敏感性约提高10倍.结论:体外转录合成的siRNA能有效抑制SKOV-3细胞中HER-2的表达,提高细胞对顺铂的敏感性,RNA干扰技术为卵巢癌的治疗提供了一种新策略.     

局部植入利福平(RFP)缓释剂对P糖蛋白(P-gp)活性及激素性股骨头坏死的影响

 目的  观察局部植入利福平(rifampicin,RFP)缓释剂对P糖蛋白(P-glycoprotein,P-gp)活性及激素性股骨头坏死的影响。方法  建立激素性股骨头坏死的动物模型,取32只成年雌性兔,随机平均分为4组:3个对照组(空白/口服给药/肌肉注射)和局部缓释组(试验组)。其中局部缓释组于左侧股骨上段植入RFP缓释剂,右侧相同位置植入空白颗粒作为对照。4周后检测外周血、骨髓内单核细胞P-gp活性,肝内细胞色素P450 (cytochrom P450,CYP450)含量,比较骨代谢血清学指标、组织学形态(HE、Masson染色)、股骨头坏死率。结果  局部缓释组左侧骨髓内P-gp活性高于右侧(P<0.05)。口服、肌注组外周血P-gp活性和肝细胞色素P4503A含量高于局部缓释组(P<0.05)。HE染色示:局部缓释组左侧股骨头比右侧骨小梁增宽,脂肪细胞减少,骨坏死率降低(P<0.05);口服、肌注组股骨头骨质流失及脂肪化受到抑制。Massons染色示:口服、肌注及局部缓释组左侧股骨头骨质成熟胶原较多,矿化完全。结论  局部植入RFP对外周P-gp及肝内CYP450无明显影响,可增强骨内P-gp活性,降低激素性骨坏死发生率。     

浸润性乳腺癌组织中P-糖蛋白以及肺耐药蛋白和多药耐药相关蛋白表达的临床意义

目的探讨浸润性乳腺癌组织中P-糖蛋白（P—gp）、肺耐药蛋白（LRP）和多药耐药相关蛋白（MRP）表达的临床意义。方法应用流式细胞术（FCM）定量分析68例原发浸润性乳腺癌患者癌组织、相应癌旁组织中上述蛋白的表达。结果浸润性乳腺癌组织P-gp、LRP和MRP表达的相对荧光强度（RFI）以中位数（M）表示分别为0．58、0．51和0．56,而相应癌旁组织分别为0．26、0．33和0．30,癌组织耐药相关蛋白表达与相应癌旁组织比较差异有统计学意义（P〈0．05）。3种耐药相关蛋白的表达与患者的年龄、肿瘤大小、病理类型、临床分期和雌、孕激素受体均无相关性（P〉0．05）。有淋巴结转移组患者P—gp和MRP的表达分别为0．61和0．69,无淋巴结转移组患者分别为0．54和0．45,两者比较差异无统计学意义（P〉0．05）。但LRP表达在有淋巴结转移组患者（M=1．49）显著高于无淋巴结转移组患者（M=0．50,P〈0．05）。相关分析显示,乳腺癌组织LRP与MRP表达间存在正相关性（P〈0．05）。结论3种耐药相关蛋白在浸润性乳腺癌组织中表达的临床意义存在差别。LRP表达与淋巴结转移状况有关且与MRP表达呈正相关,可作为预测乳腺癌预后的指标。     

多药耐药相关蛋白-2在乳腺癌组织中的表达及与预后关系

目的:研究多药耐药相关蛋白-2(Multidrug resistance-associated protein2,MRP2)在乳腺癌组织中的表达,评估其在乳腺癌预后中的作用。方法:采用免疫组织化学方法(I mmuno Histo Chemistry,I HC)检测47例手术切除的乳腺癌组织中MRP2的表达,并分析其与临床、病理特征的关系及对预后的影响。结果:MRP2在乳腺癌组织中的阳性表达率为85.1%(40/47),其中高表达者25例(53.2%);MRP2表达与月经状况、肿瘤大小、腋淋巴结转移、组织分级和激素受体状况均无关(P>0.05);Kaplan-Meier生存分析结果表明MRP2表达与无病生存期和总生存期均无关(P>0.05);COX多因素分析显示只有肿瘤大小和腋淋巴结转移和无病生存期和总生存期明显相关(P<0.05)。结论:MRP2在乳腺癌组织中具有一定的表达水平,但与乳腺癌患者预后无关。     

Effects of arsenic trioxide on drug transporting molecules in multidrug resistance malignant neoplasma MR2 cell line

INTRODUCTIONIn recent ye ars, some studies have introducedAs2O3 into the treatment of acute promyelocyticleukemia (APL) with the complete clinical remission(CR) rate of 52.3￣93.7%[1,2]. Studies in vitro haveconfirmed that As2O3 can induce apoptosis of retinoicacid-resistant APL cell line[3]. As2O3 has been also ap-plied in the treatment for refractory primary hepaticcancer [4] with satisfactory result [5]. The drug resis-tance of tumor is correlated with the drug transport-ing molec…     

洛贝林逆转人乳腺癌细胞MCF-7/ADM耐药作用及其机制

目的：探讨哌啶生物碱洛贝林对人乳腺癌多药耐药细胞株MCF-7/ADM耐药的逆转作用及其分子机制。方法：利用MTT比色法测定不同浓度洛贝林对人乳腺癌细胞株MCF-7/ADM的阿霉素（ADM）和氟尿嘧啶（Fu）的耐药逆转指数。多功能酶标仪测定洛贝林干预对细胞内罗丹明123荧光强度以反映其对细胞多药耐药蛋白P-gp活性的影响。同时用流式细胞术检测洛贝林对MCF-7/ADM细胞内罗丹明123积聚浓度的影响,从功能学的角度观察洛贝林的耐药逆转作用及其机制。结果：洛贝林(10 μmol/L)干预下,多药耐药细胞株MCF-7/ADM对化疗药的敏感性增加,ADM对耐药细胞株的IC50由（44.81±0.43)mg/L降至（16.72±0.75）mg/L,逆转指数为2.68;Fu对耐药细胞株的IC50由（53.12±1.60）mg/L降至（38.90±1.43）mg/L,逆转指数为1.37。洛贝林对细胞的罗丹明123外排有显著的浓度依赖性抑制作用。洛贝林（20 μmol/L）的多药耐药逆转有效率为经典耐药逆转剂维拉帕米（20 μmol/L）的71.6%,但毒副作用显著降低。结论：洛贝林对乳腺癌多药耐药细胞株MCF-7/ADM的耐药性具有逆转作用,其机制主要为抑制细胞多药耐药蛋白P-gp的活性     

靶向端粒酶调节相关基因TRAP siRNA表达载体的构建

目的构建靶向端粒酶调节相关基因TRAP的siRNA表达载体。方法根据siRNA设计原则,设计并化学合成2段编码短发夹RNA序列、靶向端粒酶调节相关基因TRAP的寡核苷酸,各64个碱基,退火,克隆到线性化的pSilencerTM21u6neo质粒U6启动子下游重组构建RNAi质粒。结果重组质粒pSilencerTM21u6neoTRAP经过插入片段基因序列分析,结果表明64个碱基成功插入到预定位子,并且序列完全一致。结论成功构建靶向TRAP基因的siRNA表达载体,为进一步研究TRAP在调控hTERT的表达、降低端粒酶活性和肿瘤的基因治疗方面的作用做了基础。