人骨髓间充质干细胞分离方法的比较

目的：探讨人骨髓间充质干细胞原代培养过程中最佳的分离方法。方法：留取暨南大学第一附属医院骨科2004-10／2005-06健康供者的骨髓10份，分别采用羟乙基淀粉沉淀法，淋巴细胞分层液分离法，氯化铵裂解红细胞法，全骨髓法四种方法分离骨髓有核细胞，观察四种方法在细胞出现伸展的时间，原代培养的时间方面的差异，流式细胞仪对培养得到的间充质干细胞进行表面标志检测。结果：①在其他条件相同的情况下，羟乙基淀粉沉淀法10份标本全部培养成功，淋巴细胞分层液分离法10份中有9份得到间充质干细胞，氯化铵裂解红细胞法10份中仅1份得到间充质干细胞，全骨髓培养法10份中有3份得到间充质干细胞。②羟乙基淀粉沉淀法细胞出现伸展和原代培养的时间短于淋巴细胞分层液分离法[羟乙基淀粉沉淀法：（54．0&;#177;3．0）h，（12．4&;#177;1．4）d；淋巴细胞分层液分离法：（74．0&;#177;5．2）h,（14．6&;#177;0．9）d，P〈0．01]。③流式细胞仪检测骨髓间充质干细胞表面表达CD13，CD29，CD44．不表达造血细胞的标志CD45，CD34。结论：经比较羟乙基淀粉沉淀法明显优于其他分离方法，在人骨髓间充质干细胞的培养过程中建议使用此种物理沉降方法分离骨髓有核细胞。     

人骨髓间充质干细胞的分离和体外培养

目的：分离培养人骨髓间充质干细胞，研究其在体外生长增殖的生物特性。方法：冲洗手术弃骨骨髓，获取骨髓闯充质干细胞进行培养，倒置相差显微镜观察细胞生长情况，绘制生长曲线，免疫细胞化学法鉴定细胞表面抗原，进行染色体核型分析。观察冷冻保存细胞复苏后的生长状况。在地塞米松、β-甘油磷酸钠、维生素C的作用下，进行成骨诱导分化。结果：原代和传代培养的细胞呈现梭形外观，具有较强的生长增殖能力；细胞CD44，CD54抗原表达阳性，CD34表达阴性。进行染色体核型分析表明是正常的人二倍体细胞。复苏细胞生物学特性无明显改变。分化细胞表现成骨细胞特性，合成碱性磷酸酶能力增强，矿化结节逐渐出现。结论：建立分离培养人骨髓间充质干细胞和研究其体外培养生物特性的方法，为通过组织工程学方法修复组织损伤奠定基础。     

骨髓间充质干细胞的分离、培养技术研究进展

骨髓间充质干细胞(BMSCs)具有多向分化潜能,可定向分化为外胚层的神经元和神经胶质细胞、中胚层的成骨细胞和脂肪细胞、内胚层的肝细胞等,其具有免疫耐受,易转染及取材方便等特点,符合作为种子细胞的条件,在临床治疗和细胞移植等组织工程运用方面呈现出广泛的前景.然而,迄今为止,BMSCs分离和提纯的技术,尚无统一的模式和标准.各实验室.BMSCs分离方法也大相径庭.如何优化BMSCs分离和提纯技术,尽可能使用较为先进和稳定的统一模式,是备受关注的课题.本文对近年来BMSCs分离和提纯技术作一综述,旨在分析BMSCs的提取、培养和鉴定的优化方法和技术路线,以供BMSCs纯化时参考.     

骨髓间充质干细胞的分离、培养技术研究进展

骨髓间充质干细胞(BMSCs)具有多向分化潜能,可定向分化为外胚层的神经元和神经胶质细胞、中胚层的成骨细胞和脂肪细胞、内胚层的肝细胞等,其具有免疫耐受,易转染及取材方便等特点,符合作为种子细胞的条件,在临床治疗和细胞移植等组织工程运用方面呈现出广泛的前景.然而,迄今为止,BMSCs分离和提纯的技术,尚无统一的模式和标准.各实验室.BMSCs分离方法也大相径庭.如何优化BMSCs分离和提纯技术,尽可能使用较为先进和稳定的统一模式,是备受关注的课题.本文对近年来BMSCs分离和提纯技术作一综述,旨在分析BMSCs的提取、培养和鉴定的优化方法和技术路线,以供BMSCs纯化时参考.     

骨髓间充质干细胞的分离、培养技术研究进展

骨髓间充质干细胞(BMSCs)具有多向分化潜能,可定向分化为外胚层的神经元和神经胶质细胞、中胚层的成骨细胞和脂肪细胞、内胚层的肝细胞等,其具有免疫耐受,易转染及取材方便等特点,符合作为种子细胞的条件,在临床治疗和细胞移植等组织工程运用方面呈现出广泛的前景.然而,迄今为止,BMSCs分离和提纯的技术,尚无统一的模式和标准.各实验室.BMSCs分离方法也大相径庭.如何优化BMSCs分离和提纯技术,尽可能使用较为先进和稳定的统一模式,是备受关注的课题.本文对近年来BMSCs分离和提纯技术作一综述,旨在分析BMSCs的提取、培养和鉴定的优化方法和技术路线,以供BMSCs纯化时参考.     

骨髓间充质干细胞的研究前景

除造血干细胞以外,骨髓中还含有另一类干细胞,被称为间充质干细胞（ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ,ＭＳＣ）在不同的诱导条件下,这类细胞可分化为多种造血以外组织特别是中胚层和神经外胚层来源组织细胞,如成骨细胞、成软骨细胞、脂肪细胞、成肌细胞和星形神经胶质细胞等。骨髓间充质干细胞易于分离和培养扩增,还易于外源基因的导入和表达,有望成为一种新的细胞治疗和基因治疗的靶细胞,在多种造血以外组织的缺     

人骨髓间充质干细胞的贴壁分离与体外培养

目的:验证贴壁方式分离人骨髓间充质干细胞,并进行体外扩增培养的可行性。方法:实验于2006-02/12在解放军济南军区总医院脊髓修复科完成。①实验材料:骨髓来源于解放军济南军区总医院脊髓修复科收治的脊髓完全性损伤患者,对本实验知情同意。基础培养液由含体积分数为0.15胎牛血清和低糖α-MEM配置。②实验方法:无菌条件下髂后上棘穿刺抽取骨髓组织6mL,进行细胞培养,观察细胞生长情况,待细胞融合成片、长满培养瓶底部后,用质量浓度为2.5g/L的胰蛋白酶流过所有细胞表面。倒置显微镜下观察细胞变圆、部分脱壁后,立即加入有血清培养液终止消化。③实验评估:取第3代生长状态良好的细胞,胰蛋白酶消化制成细胞悬液,接种,以细胞数为纵坐标,时间为横坐标,绘制细胞生长曲线。同时每隔2h进行细胞贴壁率检测。结果:①骨髓间充质干细胞的形态学观察:倒置显微镜下,骨髓间充质干细胞接种1d即贴壁,去除悬浮细胞后继续培养3d贴壁细胞开始增殖,伸展为椭圆型、短梭型、多角型及不规则型等。至14d细胞密集在集落中心,基本铺满瓶底,第3～5代细胞呈均匀一致的长梭型,排列成旋涡状或放射状。②骨髓间充质干细胞的生长曲线:细胞传代后3d内处于潜伏期,3d后进入生长期,7d后进入平台期。③骨髓间充质干细胞的贴壁率:随着培养时间的延长,骨髓间充质干细胞贴壁率逐渐升高。传代后2,4,6,8,10,12,14,16,18,20h细胞贴壁率分别为(20.20±0.25)%,(33.00±0.29)%,(46.50±0.32)%,(69.20±0.30)%,(76.60±0.34)%,(86.50±0.27)%,(90.30±0.20)%,(96.10±0.28)%,(98.50±0.12)%,(99.00±0.07)%。结论:贴壁法分离骨髓间充质干细胞操作简便,经体外扩增培养后细胞增殖活性强,传代周期为7d,是比较理想的骨髓间充质干细胞培养方法。     

骨髓间充质干细胞分离培养和定向分化的研究现状

骨髓间充质干细胞是存在于骨髓基质中的非造血系细胞,它们能够分化成中胚层和非巾胚层细胞.骨髓间充质干细胞主要有3种分离方法:贴壁法,梯度离心法和免疫选择法.文章列举了在特定的诱导条件下骨髓间充质干细胞的定向分化种类,讨论了文献报道的各种相关的诱导条件,分析这些人工调控条件后的原理并探寻统一而有效的诱导条件.得出:骨髓间充质干细胞在适当条件下不仅可以分化为同源于中胚层的间质组织细胞,还可以突破胚层界限,分化为非中胚层组织,如脂肪细胞、骨细胞、软骨细胞等.作为组织工程的种子细胞及细胞替代治疗的一种来源,骨髓间充质干细胞被广泛应用于干细胞的研究中.     

大鼠骨髓间充质干细胞体外分离培养与CM-DiI荧光标记

背景：目前,对骨髓间充质干细胞的分离、纯化和扩增还没有统一的、标准化的方法。CM-DiI作为荧光标记物稳定、可靠、标记率高、标记简便。 目的：建立SD大鼠骨髓间充质干细胞体外分离培养及标记的方法。 方法：取2只体质量50-100 g雄性SD大鼠,无菌条件下采集双侧股骨、胫骨骨髓,用全骨髓贴壁分离法和密度梯度离心法培养出原代骨髓间充质干细胞,通过及时、反复传代对细胞进行扩增纯化,在体外用荧光活性染料CM-DiI标记第3代骨髓间充质干细胞后作为供体细胞来源。 结果与结论：用全骨髓贴壁分离法和密度梯度离心法两种方法均能成功体外分离培养骨髓间充质干细胞,经流式细胞仪分析,培养出的细胞CD34阳性率为17.5%,CD44阳性率为97.9%、CD90阳性率为91%,与骨髓间充质干细胞表面抗原一致。但培养出的细胞数量全骨髓贴壁分离法明显多于密度梯度离心法,两种方法培养骨髓间充质干细胞的细胞活力和增殖能力无明显差异。CM-DiI能够成功荧光标记骨髓间充质干细胞, CM-DiI作为荧光标记物稳定、可靠、标记率高、标记简便。     

骨髓间充质干细胞的研究

骨髓间充质干细胞(MSCs)是骨髓中的非造血细胞,构成造血微环境,支持造血,具有向成骨细胞、软骨细胞、成肌/心肌细胞、脂肪细胞、神经元等分化的潜能,表达多种表面标记物,但不具特异性.骨髓、外周血的MSCs是一循环的整体,具有其自身代谢、更新的循环,终末分化可能跨越胚层界限.MSCs应用前景广阔.     

一种改良人骨髓间充质干细胞分离培养的方法

背景：分离培养鼠、兔骨髓间充质干细胞的科研实践较多,而组织工程临床实践人多以同种属种子细胞的科研为基础。目的：建立一种稳定、高效,满足临床和实验审需要的人骨髓问充质干细胞分离培养方法。方法：使用骨穿针于人髂前上棘处抽取骨髓和松质侣’,用15mL培养体系冲洗松质骨并收集冲洗液,采用直接培养法,利用细胞贴壁性能初筛细胞;流式细胞仪枪测细胞表面抗原（CD29、CD34、CD44、CD45、CDl05）,分别进行成骨、成脂肪诱导分化,在诱导过程中进行细胞形态学观察对干细胞进行初步豁定。结果与结论：松质骨冲洗液直接培养法在培养第5天的时候出现细胞集落,细胞稳定表达CD29、CD44、CDl05,不表达CD34、CD45。成骨诱导20d后出现明显钙结节,茜素红染色呈红色结节。成脂诱导7d后脂滴明显形成,油红素O染色见大量脂质沉淀。结果可见采用松质骨冲洗液直接培养法可以从人松质骨中短时间内获得大量间充质干细胞,其具有良好的细胞形态,稳定表达的细胞抗原及成骨、成脂分化能力。     

兔骨髓间充质干细胞体外分离培养条件的优化组合

背景：骨髓间充质干细胞分离培养方法的不同可导致其活性与纯度各异，直接影响组织工程的修复效果。目的：对骨髓间充质干细胞体外分离培养条件进行优化组合，并验证其获取骨髓间充质干细胞的效果。设计、时间及地点：细胞学体外实验，于2007-10／12在山西医科大学第二医院骨科实验室完成。材料：清洁级3月龄新西兰白兔2只，由山西畜牧研究所提供。方法：向含有新鲜骨髓的DMEM培养液中加入等量淋巴细胞分离液，采用密度梯度离心和差速贴壁法分离培养兔骨髓间充质干细胞，每间隔8h将未贴壁细胞转移入新的培养瓶，接种5d后首次换液，细胞融合率达90％时胰酶消化传代，第1、3、5代细胞用于实验。主要观察指标：镜下观察细胞形态及生长状态，绘制细胞生长曲线，测定倍增时间，流式细胞仪检测细胞表面抗原CD44标记率。结果：原代培养的骨髓间充质干细胞呈圆形、梭形、多角形等，48h可见贴壁细胞有伸展现象，呈梭形，多角形，成纤维细胞样展开，细胞核清晰，首次换液后可见细胞透亮并充分展开，14d左右可达90％融合。第1、3、5代骨髓间充质干细胞整体呈S型，1～3d为潜伏期，3d后进入对数生长期，7～8d为平台期，平均倍增时间为24．22h。第2代骨髓间充质干细胞CD44呈阳性表达，标记率为93．0％。结论：采用密度梯度离心联合差速贴擘、离心介质选择淋巴细胞分离液、接种5d首次换液的体外分离培养纯化方法，获得的骨髓间充质干细胞生长状态良好，且纯度较高。     

骨髓间充质干细胞对脑胶质瘤的趋瘤效应

背景:骨髓间充质干细胞在体内、外均具有较强的向胶质瘤趋向性迁移的能力,可作为基因靶向胶质瘤治疗的理想载体。目的:在复习相关文献的基础上,探讨骨髓间充质干细胞向脑胶质瘤定向迁移的机制。方法:由第一作者对CNKI和PUBMED数据库进行检索,英文关键词为"mesenchymal stem cells,bone marrow,glioma",中文检索词为"间充质干细胞,骨髓,胶质瘤"。共检索到51篇相关文献,根据入选标准最终剩余27篇文章进行归纳总结。结果与结论:骨髓间充质干细胞对胶质瘤具有较强的趋化性迁移的能力,这与胶质瘤细胞分泌的某些细胞因子和骨髓间充质干细胞表面相应受体之间的相互作用有关。增强骨髓间充质干细胞表面相关受体的表达有助于增强其趋瘤效应,进而增强抗胶质瘤作用。     

骨髓间充质干细胞对脑胶质瘤的趋瘤效应

背景：骨髓间充质干细胞在体内、外均具有较强的向胶质瘤趋向性迁移的能力,可作为基因靶向胶质瘤治疗的理想载体。目的：在复习相关文献的基础上,探讨骨髓间充质干细胞向脑胶质瘤定向迁移的机制。方法：由第一作者对CNKI和PUBMED数据库进行检索,英文关键词为＂mesenchymal stem cells,bone marrow,glioma＂,中文检索词为＂间充质干细胞,骨髓,胶质瘤＂。共检索到51篇相关文献,根据入选标准最终剩余27篇文章进行归纳总结。结果与结论：骨髓间充质干细胞对胶质瘤具有较强的趋化性迁移的能力,这与胶质瘤细胞分泌的某些细胞因子和骨髓间充质干细胞表面相应受体之间的相互作用有关。增强骨髓间充质干细胞表面相关受体的表达有助于增强其趋瘤效应,进而增强抗胶质瘤作用。     

大鼠骨髓和脂肪来源间充质干细胞的成骨特性比较

背景:尽管骨髓来源和脂肪来源的间充质干细胞均具有向骨和软骨分化潜能,但终究带有各自来源组织的特点,那么是否意味着两者在非基因影响下成骨特性存在一定差异呢?目的:比较大鼠骨髓和脂肪来源的间充质干细胞在体外成骨分化中的特性区别。设计、时间及地点:细胞学体外对照观察,于2007-07/2008-03在中国科学院昆明动物研究所国家级重点实验室完成。材料:6周龄和18周龄SD大鼠各2只,分别用于制备骨髓间充质干细胞和脂肪间充质干细胞。方法:选取第3代骨髓间充质干细胞和脂肪间充质干细胞,按5×107L-1接种后各分为2组:诱导组加入含10-8mol/L地塞米松、10mol/Lβ-甘油磷酸、50mg/L维生素C的成骨诱导培养基1.5mL,未诱导组不加入成骨诱导培养基。主要观察指标:碱性磷酸酶染色与茜素红染色结果,碱性磷酸酶和骨钙素定量分析结果。结果:成骨诱导7,14d,经诱导的骨髓基质干细胞和脂肪间充质干细胞呈碱性磷酸酶阳性,有钙结节形成,未诱导组呈阴性。成骨诱导3,7,10d,未诱导组间比较碱性磷酸酶及骨钙素含量均基本相似(P>0.05);与未诱导组比较,脂肪间充质干细胞诱导组碱性磷酸酶及骨钙素含量均明显升高(P<0.05),骨髓间充质干细胞诱导组升高幅度更为显著(P<0.001)。结论:大鼠骨髓来源间充质干细胞体外成骨性能强于脂肪来源间充质干细胞,在骨组织工程种子细胞的选用中应优先考虑前者。     

静脉输注骨髓间充质干细胞的归巢路径

背景:间充质干细胞被认为是最有希望用于治疗多种疾病的一种非造血组织的多能干细胞,但是其靶向组织器官归巢率偏低,影响了其作为干细胞疗法的效果。目的:通过对国内外相关文献的综合分析,探讨静脉输注骨髓间充质干细胞的归巢现象。方法:利用计算机检索清华同方数据库、万方数据库、Pubmed数据库,检索英文关键词为"Bone marrow mesenchymal stemcells,homing",中文关键词为"骨髓间充质干细胞,归巢",主要筛选出近10年内最具代表性的文献资料。经查阅、整理出33篇可支持本综述的文献。结果与结论:研究发现,静脉输注的骨髓间充质干细胞与血管壁接触并穿过内皮细胞从而归巢至多个脏器,特别是损伤、炎症及肿瘤部位。文章从静脉输注骨髓间充质干细胞的归巢特点,输注回输骨髓间充质干细胞迁移与归巢的可能机制等方面进行了相关论述。归巢的机制与参与调控的信号分子及其受体,如趋化因子、生长因子和黏附分子等有关。     

骨髓间充质干细胞对缺氧微环境的耐受性

背景:在需要进行干细胞治疗的缺血性心脏病移植的微环境中,长期存在着缺血缺氧环境,骨髓间充质干细胞移植到心肌后能否适应?目的:观察骨髓间充质干细胞对缺氧的耐受性.设计、时间及地点:对比观察实验,2005-03/2006-03在北京大学医学部心血管研究所完成.材料:成年雄性SD大鼠10只,体质量150g左右,SPF级.方法:采用密度梯度法分离培养大鼠骨髓间充质干细胞,在3种氧浓度中进行培养.体积分数为0.95的N2 体积分数为0.05的CO2为无氧组,体积分数为0.01的O2 体积分数为0.94的N2 体积分数为0.05的CO2为低氧组,体积分数为0.05的CO2 空气为正常氧浓度组.测定MTT值绘制生长曲线、用锥虫蓝和Hoechst33258染色计数细胞死亡和凋亡的数量.主要观察指标:细胞在不同氧浓度及不同培养时间点的死亡和凋亡百分数,以及细胞数日增长情况.结果:①生长曲线显示骨髓间充质干细胞在1%低氧浓度和无氧条件下的增殖能力较正常氧浓度条件下显著降低(P<0.05).②在不同氧浓度条件下,连续培养5 d内,各时间点骨髓间充质干细胞死亡百分率3组间差异无显著性.③通过检测细胞核碎裂发现缺氧未显著增加骨髓间充质于细胞凋亡,在不同氧浓度条件下,连续培养5 d内,细胞凋亡率均低于8%(P>0.05).结论:骨髓间充质干细胞在体外培养时对缺氧耐受性较好.     

骨髓间充质干细胞的相关迁移机制

背景：基于骨髓间充质干细胞的多向分化潜能,促使其迁移至损伤部位,可对患者的康复起到极大的促进作用。目的：通过国内外相关文献的综合分析,探讨细胞因子和炎症因子促进骨髓间充质干细胞迁移的作用机制。方法：由第一作者应用计算机检索CNKI、Pubmed相关文献,英文检索词＂BMSCs,chemotactic factor,migration＂,中文检索词为＂骨髓间充质干细胞,细胞因子,迁移＂,排除重复性研究,计算机初检到68篇文献,最终保留23篇进行归纳总结。结果与结论：骨髓间充质干细胞具有强大的分化潜能,在临床疾病治疗中起到了巨大的辅助作用,同时鉴于该细胞取材简单、方便,易于体外培养,所以就其增殖、分化、迁移的研究实属国内外热点。相关细胞因子的干预,促使骨髓间充质干细胞的迁移加强,这就使得细胞因子对该细胞的促迁移研究极具价值。     

静脉输注骨髓间充质干细胞的归巢路径

背景：间充质干细胞被认为是最有希望用于治疗多种疾病的一种非造血组织的多能干细胞,但是其靶向组织器官归巢率偏低,影响了其作为干细胞疗法的效果。目的：通过对国内外相关文献的综合分析,探讨静脉输注骨髓间充质干细胞的归巢现象。方法：利用计算机检索清华同方数据库、万方数据库、Pubmed数据库,检索英文关键词为＂Bone marrow mesenchymal stemcells,homing＂,中文关键词为＂骨髓间充质干细胞,归巢＂,主要筛选出近10年内最具代表性的文献资料。经查阅、整理出33篇可支持本综述的文献。结果与结论：研究发现,静脉输注的骨髓间充质干细胞与血管壁接触并穿过内皮细胞从而归巢至多个脏器,特别是损伤、炎症及肿瘤部位。文章从静脉输注骨髓间充质干细胞的归巢特点,输注回输骨髓间充质干细胞迁移与归巢的可能机制等方面进行了相关论述。归巢的机制与参与调控的信号分子及其受体,如趋化因子、生长因子和黏附分子等有关。     

骨髓间充质干细胞向软骨细胞的分化

背景：以骨髓间充质干细胞构建组织工程气管尚缺乏理想的特异性表面标志物,对其鉴定主要依赖细胞形态学、细胞表型及诱导分化的功能进行分析。目的：体外分离培养、鉴定兔骨髓间充质干细胞,观察在特定条件下向气管软骨细胞分化的潜能。方法：无菌环境取兔骨髓,经全骨髓贴壁筛选法分离培养细胞至第2代,流式细胞术鉴定第1、第2代细胞表面抗原CD44、CD45的表达。无菌环境取气管,经酶消化法分离培养气管软骨细胞,甲苯胺蓝染色鉴定软骨细胞蛋白聚糖的合成。在使用转化生长因子B1的基础上,将骨髓间充质干细胞与气管软骨细胞通过Transwell小室非接触式共培养,倒置显微镜观察细胞形态,甲苯胺蓝染色鉴定蛋白聚糖的合成,荧光实时定量PCR鉴定Ⅱ型胶原和蛋白聚糖mRNA的表达。结果与结论：分离、培养的细胞呈长梭形、不规则形聚集生长,传代后细胞生长速度明显增快,呈鱼群状聚集生长。第1代有96．97％的细胞表达CD44、13.72％的细胞表达CD45,第2代有99．11％的细胞表达CD44、8．54％的细胞表达CD45。气管软骨细胞甲苯胺蓝染色阳性。在诱导后,骨髓间充质干细胞形态逐渐由长梭形变为三角形或不规则形,表达软骨细胞特异性Ⅱ型胶原和蛋白聚糖mRNA基因,甲苯胺蓝染色示阳性。结果表明全骨髓贴壁筛选法可成功分离培养骨髓间充质干细胞,第2代纯度较高,且在特定诱导条件下具有分化为气管软骨细胞的潜能。