壳聚糖微球转染人IL-1Ra与TGF-β1基因治疗兔骨关节炎

目的 探讨壳聚糖微球转染人IL-1Ra与TGF-β1基因治疗兔膝关节早期骨关节炎的方法与效果.方法 制备分别包裹IL-1Ra质粒DNA和TGF-β1质粒DNA的壳聚糖微球缓释系统,分组向兔膝关节早期骨关节炎模型关节腔注射含IL-1Ra基因和(或)TGF-β1基因的壳聚糖微球、不含上述基因的壳聚糖溶液,定期处死,使用ELISA检测关节腔灌洗液的IL-1Ra、TGF-β1浓度,取关节标本Mankin评分、苏木精-伊红(HE)染色、番红O染色及免疫组化检测.结果 经过60 d观察,壳聚糖微球转染基因组的IL-1Ra与TGF-β1的基因可持续表达,双基因组的软骨标本从外观、染色观察,损伤程度轻于单基因组.双基因组的Mankin评分明显低于单基因组(P＜0.05),单基因组的Mankin评分明显低于空白组(P＜0.05).结论 关节腔注射壳聚糖微球转染IL-1Ra与TGF-β1基因能抑制软骨的退变和促进软骨的修复.

Abstract：

Objective To explore the method and effect of transinfection of rabbit early knee osteoarthritis models via chitosan microsphere with gene of recombined human IL-1Ra gene and TGF-β1 gene. Methods Chitosan microspheres with plasmids of IL-1Ra gene and TGF-β1 gene, and rabbit early knee osteoarthritis models were prepared. Rabbits in different groups had intra-articular injections of chitosan microsphere containing IL-1Ra gene and / or TGF-β1 gene, and chitosan solution as control group before being executed regularly and randomly. The joint specimens were evaluated by HE staining, lycopene red O staining and immunohistochemical analysis and Mankin's score. ELISA was used for detection of IL-IRa and TGF-β1 concentration of articular cavity fluid in each group. Results The control group was consistent with the pathological changes of early OA. In co-transinfection group, judging from the appearance and staining of cartilage,the OA damage of the specimens was less serious than other groups'. Its Mankin's score was significantly lower than single-gene transinfection group (P ＜ 0.05), and the latters Mankin's score were significantly lower than control group (P ＜ 0.05). Conclusion Intra-articular injection of chitosan microspheres containing both IL-1Ra gene and TGF-β1 gene could inhibit the degeneration of cartilage and promote cartilage repair.     

重组人IL-1Ra与TGF-β1联合基因体外转染兔膝关节软骨细胞的研究

背景:多基因联合转染具有增强功能基因协同效应、消除短板差异等作用,因而目前被受到广泛重视。目的:观察以逆转录病毒(RV)为载体,介导白介素-1受体拮抗蛋白(IL-1Ra)基因单独转染及其与转化生长因子-β1(TGF-β1)基因共同转染兔膝软骨细胞后的表达,及对其增殖代谢的影响。方法:构建逆转录病毒载体PLNCX2-IL-1Ra-GFP 与 PLNCX2-TGF-β1-RFP,将其转染至包装细胞 PT67,待形成阳性克隆后扩增培养,收集病毒上清,并计算病毒上清滴度。将体外培养的软骨细胞分为空白转染组、PLNCX2空载体转染组、IL-1Ra单基因转染组及IL-1Ra +TGF-β1双基因转染组。酶联免疫吸附分析法(ELISA)进行瞬时基因表达(细胞转染后48 h)及稳定基因表达(筛选后4周)的检测;免疫组织化学染色法检测各组IL-1Ra、TGF-β1及Ⅱ型胶原的表达;流式细胞仪检测各组细胞生长周期比例。结果:PLNCX2-IL-1Ra-GFP 与 PLNCX2-TGF-β1-RFP 转染包装细胞后分别有绿色荧光与红色荧光表达;空白组与PLNCX2空载体转染组的上述指标无统计学差异(P>0.05);ELISA检测示基因转染组有明显基因表达;与空白组及PLNCX2空载体转染组相比,双基因转染组IL-1Ra、TGF-β1、Ⅱ型胶原含量明显提高,IL-1Ra基因转染组IL-1Ra含量提高明显,但TGF-β1、Ⅱ型胶原含量提高不明显;双基因转染组软骨细胞位于S期的比例明显增高,与其他组比较有统计学差异(P<0.05)。结论:逆转录病毒载体构建成功,基因转染软骨细胞后可获得稳定表达,双基因转染的软骨细胞生物学活性优于单基因转染,为基因治疗骨关节炎(OA)的研究提供实验基础。     

重组PGL3-转化生长因子β1基因转染兔骨髓基质干细胞体外诱导向软骨细胞分化的实验研究

目的探讨将编码细胞转化生长因子β1(transforming growth factor β1,TGF-β1)的重组PGL3-TGF-β1质粒转染兔骨髓基质干细胞(marrow stromal stem cells,MSCs),体外通过自分泌、诱导作用向软骨细胞方向分化的可行性,为基因加强组织工程学修复软骨损伤提供体外实验依据.方法兔MSCs体外密度梯度离心及贴壁筛选法分离培养,脂质体法转染重组PGL3-TGF-β1,转染后绘制不同时期细胞生长曲线,MTT法分析转染后细胞(实验组)生长活性,以未转染空载体细胞为实验对照组,未转染细胞为空白对照组;转染后第2、7天,分别进行抗TGF-β1和抗Ⅱ型胶原蛋白的免疫组织化学染色(SABC法),以未转染细胞为实验对照组,PBS作为一抗为空白对照组,进行图像定量分析.结果 MSCs体外分离培养,脂质体法转染后,生长曲线显示转染后细胞生长活性较对照组降低,MTT法显示实验组及实验对照组吸光度(A)值较空白对照组低,差异有统计学意义(P＜0.01);实验组转染细胞第2天,抗TGF-β1免疫组织化学染色可见细胞内阳性颗粒,实验对照组及空白对照组均为阴性;转染细胞第7天,抗Ⅱ型胶原免疫组织化学染色实验组可见细胞内阳性颗粒,实验对照组及空白对照组均为阴性.图像分析示,实验组抗TGF β1及抗Ⅱ型胶原免疫组织化学染色阳性值与实验对照组及空白对照组相比,差异均有统计学意义(P＜0.01).结论脂质体法重组PGI3-TGF-β1基因可成功转染兔MSCs,但对细胞生长有一定影响,转染细胞表达TGF β1,通过其自分泌、诱导作用,细胞分泌Ⅱ型胶原蛋白,表现出软骨细胞样生理特征,并向软骨细胞方向分化.     

转化生长因子β1基因单独转染及与胰岛素样生长因子1基因联合转染治疗兔膝骨关节炎

目的 观察重组大鼠转化生长因子β1(transforming growth factor beta-l,TGF-β1)基因单转染及与胰岛素样生长因子1(insulin-like growth factor-1,IGF-1)基因共转染兔膝关节后对骨关节炎(osteoarthritis,OA)的治疗效果.方法 新西兰白兔24只,随机分为4组,Ⅰ组为空白对照组,Ⅱ组为手术对照组,Ⅲ组为TGF-β1基因转染组,Ⅳ组为TGF-β1和IGF-1双基因转染组.前十字韧带切断法制成兔膝关节OA模型,向膝关节内注射转染不同重组基因的阳性克隆软骨细胞.4、8周后,取关节标本进行Mankin评分,AB-PAS染色,TGF-β1、IGF-1、Ⅱ型胶原原位杂交和免疫组化检测,透射电镜观察.结果 Ⅱ组软骨损伤程度较大,其Mankin评分明显高于Ⅰ组和Ⅲ、Ⅳ组.各因子原位杂交和免疫组化染色,Ⅰ组及Ⅲ、Ⅳ组的灰度值均高于Ⅱ组,Ⅳ组的灰度值较Ⅲ组高;8周时各对应组灰度值较4周有明显下降.透射电镜观察显示,Ⅱ组的超微结构较Ⅰ组明显紊乱,治疗4周后,超微结构逐渐恢复正常,但在8周后紊乱程度又逐渐加重.结论 关节内注射转基因软骨细胞对OA有一定治疗作用;TGF-β1和IGF-1双基因治疗效果优于TGF-β1单基因;基因治疗4周后,基因表达逐渐减弱,基因治疗具时效性.     

转IL-1Ra和TGF-β1基因治疗兔骨性关节炎的体外实验研究

目的 探讨重组人IL-1Ra和TGF-β1双基因在体外对兔骨性关节炎软骨退变的治疗效果.方法 取新西兰大白兔关节软骨,经消化分离,软骨细胞以1.5×105/ml浓度培养于6孔培养板.软骨细胞分为5组,转染IL-1Ra组、转染TGF-β1组、转染IL-1Ra＋TGF-β1双基因组、未转染组、空白组.上述转染组均以LipofectamineTM 2000 Reagent脂质体为转染媒介.各组加入软骨块,除空白组外,其余各组均加入20 ng IL-1β.于第6天后每组各取4孔1.5 ml培养基,ELISA法检测TGF-β1和IL-1Ra的含量,RIA法检测IL-1β和TNF-α的含量.收集软骨块做HE染色、阿尔新蓝染色及Ⅱ型胶原免疫组化检测等组织学观察.结果 转染组IL-1Ra或TGF-β1有较高的表达水平;转染组IL-1β和TNF-α的表达水平降低,在双基因组降低最明显,与单基因组之间有显著性差异（P〈0.05）.转基因组基质染色均比未转染组着色较深.在双基因组软骨细胞排列尚整齐,细胞数量多,基质深染.结论 联合基因治疗效果优于单基因,为体外骨性关节炎的基因治疗提供实验基础.     

腺病毒介导TGF-β1基因感染兔软骨细胞修复关节软骨缺损

[目的]探讨腺病毒介导转化生长因子β1（TGF-β1）基因感染对兔关节软骨细胞增殖和分化的影响，观察其构建组织工程化软骨对关节软骨缺损的修复质量。[方法]以腺病毒Adeno-X^TM为基因转移载体，制备携带TGF-β1基因的高滴度腺病毒液感染兔关节软骨细胞，通过光电镜、免疫细胞化学、Northern杂交及流式细胞仪分析细胞周期等方法观察软骨细胞形态、增殖及外源基因的表达。再将其与骨基质明胶（BMG）支架相复合移植修复同种异体关节软骨缺损。[结果]腺病毒感染软骨细胞后免疫细胞化学染色可检测出外源基因编码蛋白的表达，Northern杂交显示Ⅱ型胶原表达水平增加，TGF-β1的表达显著增加了原代软骨细胞S／G2／M期细胞比例。将其复合于骨基质明胶上，经组织染色和电镜观察可见软骨细胞贴附于BMG表面和孔隙内大量增殖，在体移植修复实验组新生组织为透明软骨，关节面平整，软骨下骨完全重建再生。[结论]软骨细胞经携带TGF-β1基因的腺病毒感染后，能促进软骨细胞的增殖，可用于制备组织工程化软骨。     

转化生长因子-β1基因转染鼠成骨细胞的研究

目的　研究转化生长因子 - β1 (TGF- β1 )基因转染鼠成骨细胞对其生物学特性的影响。方法　将TGF- β1 基因导入成骨细胞 ,通过原位杂交检测和成骨细胞培养上清液 TGF- β1 活性测定 (水貂肺上皮细胞生长抑制试验 ) ,了解转染细胞 TGF- β1 的表达。检测基因转染及转染细胞上清对成骨细胞增殖和碱性磷酸酶 (AL P)活性的影响 ,观察 TGF- β1 基因转染成骨细胞生物学活性的变化。结果　原位杂交检测基因转染成骨细胞可明显表达TGF- β1 。上清液 TGF- β1 活性检测结果显示 1∶ 1、1∶ 2、1∶ 4复合培养基对 Mv1抑制率分别为 16 .3%、2 2 .7%和2 8.2 % ,上清中 TGF- β1 含量越高 ,活化后对 Mv1抑制作用越明显。 TGF- β1 基因转染对成骨细胞生物学活性无明显影响 ,而转染细胞上清活化后可促进成骨细胞增殖 ,抑制 AL P活性。结论　 TGF- β1 基因转染鼠成骨细胞可显著促进 TGF- β1 表达 ,转染细胞生物学特性保持稳定 ,为骨缺损基因治疗的体内研究奠定了基础     

兔退变椎间盘体内转染hTGF-β1、β3的生物学效应

目的 应用重组腺相关病毒2(recombinant adeno-associated virus,rAAV2)介导人转化生长因子β1(human transforming growth factor-β1,hTGF-β1)和β3(hTGF-β3)单基因或双基因联合体内转染退变兔髓核细胞,观察基因产物的表达及其对基质成分...     

透明质酸修饰壳聚糖/pDNA纳米微球的制备及体外转染软骨细胞

目的 以透明质酸(HA)修饰基因载体壳聚糖(CS)纳米微球,制作一种新型的HA/CS/pDNA基因转染系统,观察其结构特征及体外对软骨细胞的转染能力.方法 将不同比例的HA和CS与负载增强型绿色荧光蛋白基因(EGFP)的质粒DNA(pDNA)以复凝聚法制成纳米微球,以扫描电镜检测纳米微球形态,Zeta电位粒度分析仪测定其粒径、表面电位;凝胶电泳阻滞实验观察CS和pDNA的结合力;体外转染兔关节软骨细胞,以流式细胞仪及荧光显微镜检测转染效率.结果 HA/CS/pDNA纳米微球多呈球形,粒径为(223±51)nm,表面Zeta电位为(17.4±6.1)mV,可有效保护pDNA免受 DNaseⅠ的降解.体外转染实验证明HA/CS/pDNA纳米微球能介导pEGFP转染软骨细胞并在细胞内表达绿色荧光蛋白,转染率达(15.450±0.404)%,比裸pDNA组和CS/pDNA组有更高的转染效率(P<0.05).结论 复凝聚法制备的HA/CS/pDNA纳米微球是一种有效的新型非病毒基因转染系统,对软骨细胞有着潜在的靶向基因转染能力.

Abstract：

Objective To prepare hyaluronic acid (HA)-modified chitosan (CS)/pDNA (HA/CS/pDNA) nanoparticles as novel gene vectors, study their structural characteristics and gene transfection efficiency for chondrocytes in vitro in rabbits. Methods The HA/CS/pDNA nanoparticles were prepared by a DNA (pDNA), which load enhanced green fluorescent protein (EGFP) gene. The morphology of the nanoparticles was observed under the transmission electron microscopy. The sizes and zeta-potentials of the nanoparticles were measured by a Marven-nano laser diffractometer. The binding of pDNA was evaluated by agarose gel electrophoresis analysis. The gene transfection experiments in vitro were performed with the chondrocytes of rabbits. The gene transfection efficiency was measured by using flow cytometry and under the fluorescence microscopy. Results HA/CS/pDNA nanoparticles were mainly spherical, with an average size of (223±51) nm, and zeta-potential of (17.4±6.1) mV. The agarose gel electrophoresis analysis confirmed that they could effectively protect pDNA from degradation against DNase I. Gene transfection in vitro proved that HA/CS/pDNA nanoparticles could be efficiently transfected into chondrocytes of rabbits, the expression of green fluorescent proteins was observed under the fluorescent microscopy, and the transfection efficiency reached as high as (15.450±0.404)%, significantly higher than that of the naked pDNA or the CS/pDNA nanoparticles (P<0.05). Conclusion HA/CS/pDNA nanoparticles were an effective novel non-viral gene transfer vector, which possessed the potential targeting transfection ability on chondrocytes.     

超声微泡介导白细胞介素-1受体拮抗蛋白基因体外转染兔软骨细胞的研究

目的 观察超声介导下携白细胞介素-1受体拮抗蛋白基因(IL-1Ra)的微泡体外转染兔软骨细胞的效率和表达.方法 体外分离培养兔软骨细胞,分为单纯质粒组(P)、微泡+质粒组(M+P)、超声+质粒组(U+P)和超声+微泡+质粒组(U+M+P),照射后48 h,荧光显微镜和流式细胞术检测转染效率,逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)和Western blot法检测IL-1Ra基因的mRNA和蛋白表达,台盼兰染色检测细胞生存率.结果 U+M+P组转染效率较其他三组明显提高,为(11.6±1.0)%;且eGFP-C1-IL-1Ra质粒经超声微泡介导转染后可表达IL-1Ra的mRNA和蛋白.结论 超声微泡可介导IL-1Ra基因在兔软骨细胞内的转染和表达,可望成为软骨损伤基因治疗的新方法.     

转化生长因子β3基因转染兔骨髓间充质干细胞的实验研究

目的构建转化生长因子β3（transforming growth factor β3，TGF-β3）的腺病毒载体，并通过腺病毒载体将TGF-β3基因转染骨髓间充质干细胞（marrow mesenchymal stem cells，MSCs），使其在细胞内得到表达。方法将人TGF-β3质粒定向克隆进入穿梭质粒pAdTrack—CMV中，与pAdEasy-1共同转入细菌并重组，获得TGF-β3重组腺病毒质粒，用脂质体法导入包装细胞HEK293中，48～96h后荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白的表达。取1月龄新西兰大白兔5只，取其胫骨骨髓。采用密度梯度离心法分离纯化MSCs，并进行传代。取传至第3代细胞采用TGF-β3腺病毒载体转染，10h后荧光显微镜观察绿色荧光表达，转染TGF-β3重组腺病毒4d后的MSCs用免疫细胞化学方法观察TGF-β3在细胞内的表达。结果pAdEasy—TGF-β3转染HEK293细胞48～96h后，荧光显微镜可见明显的绿色荧光表达。兔骨髓分离培养10d后，培养MSCs融合达70％～80％、贴壁紧密，细胞形态均一，似成纤维细胞；14d完成原代细胞培养。TGF-β3重组腺病毒转染MSCs17h后，荧光显微镜下出现少量绿色荧光，48～72h荧光加强，荧光与MSCs轮廓一致。免疫细胞化学观察，转染TGF-β3重组腺病毒MSCs胞浆内有棕黄色阳性颗粒表达。结论TGF-β3基因重组腺病毒载体的成功构建并在MSCs内的表达，为创伤愈合的基因治疗提供了研究基础。     

腺病毒介导hTGF-β1基因体内转染兔腰椎间盘髓核细胞对蛋白多糖含量的影响

目的观察构建腺病毒载体介导外源性人转化生长因子(humantransforminggrowthfac-tor,hTGF-β1)基因(Ad/CMV-hTGF-β1)转染到兔椎间盘髓核细胞后,髓核组织中蛋白多糖含量的变化。方法(1)纯种成年新西兰大白兔35只,其中25只对腰椎间盘髓核组织注射Ad/CMV-hTGF-β1,每只注射2个椎间盘作为实验组,注射量为每个腰椎间盘20μl(6×106pfu);同时每只取2个未做注射的腰椎间盘作为自身空白对照组。其余10只兔每只注射2个腰椎间盘各20μl磷酸盐缓冲液(PBS)作为实验对照组。全组共120个椎间盘。(2)手术后1～12周的不同时间段分别取出各组椎间盘组织,采用间苯三酚分光光度法测定髓核组织中蛋白多糖的含量,所得数据经SPSS10.0统计学软件进行统计学处理。结果(1)术后1周,实验组与自身空白对照组蛋白多糖测定值经配对t检验,t=3.968,P<0.05。(2)术后2周,三组结果经方差分析显示,F=17.871,P<0.01;各组间再行两两q检验,实验组与自身空白对照组间q=7.686,P<0.01;实验组与实验对照组间q=6.894,P<0.01;实验对照组与自身空白对照组间q=0.792, P>0.05。实验组与自身空白对照组间配对t检验,t=5.276,P<0.01。(3)术后4周,实验组与自身空白对照组经配对t检验,t=8.352,P<0.01。(4)术后8周,实验组与自身空白对照组经配对t检验,t=7.086,     

壳聚糖酶基因在软骨细胞中的表达及对壳聚糖介导基因转染的影响

[目的]探讨携带壳聚糖酶(CSN)基因的重组慢病毒感染软骨细胞后影响CSN活性的因素,及CSN在壳聚糖(CS)/DNA纳米粒介导基因转染软骨细胞中的作用。[方法]构建携带CSN和红色荧光带白(RFP)基因的重组慢病毒(LV-CSN)并感染兔关节软骨细胞,流式细胞仪及荧光显微镜检测其感染率;二硝基水杨酸比色法(DNS)检测对CSN活性的影响因素;以CS/DNA纳米粒介导体外基因转染软骨细胞,检测CSN对CS/DNA纳米粒介导基因转染软骨细胞的作用。[结果]带RFP基因的LV-CSN感染软骨细胞后48 h和第7 d,RFP表达率分别为(91.40±0.98)%和(91.67±1.00)%,二者差异无统计学意义(P=0.583)。p H值、温度及铜离子浓度对CSN的活性有明显影响。LV-CSN感染软骨细胞后CS/DNA组的基因转染效率显著高于裸p DNA组和CS/DNA组(P<0.05),但铜离子可以拮抗这种作用。[结论]在一定时间内LV-CSN感染软骨细胞后可稳定表达CSN,CSN的活性受p H值、温度及铜离子浓度的影响;CSN可提高CS/DNA对软骨细胞的基因转染效率,铜离子则可拮抗这种作用。     

重组腺病毒介导的hTGF-β1基因增加兔髓核组织蛋白多糖合成的研究

椎间盘退变是导致下腰痛及一系列功能障碍的主要致病原因^[1]。髓核组织内的蛋白多糖使椎同盘保持一定的含水量^[2]．因此，蛋白多糖的减少可直接影响椎间盘的生物功能。研究表明，转化生长因子β1(TGF-β1)能促进髓核细胞产生蛋白多糖^[3]。我们用腺病毒作为载体，将人TBF-β1基因转染至兔髓核组织内，使TGF-β1在髓核组织内大量表     

TGF-β1缓释载体体外构建组织工程软骨

目的制备负载TGF—β1壳聚糖缓释微球的三维多孔壳聚糖支架，检测TGF—β1缓释载体对软骨细胞功能的影响．方法乳化交联法制备TGF—β1壳聚糖缓释微球并将其与壳聚糖支架复合，检测其体外降解并通过ELISA法检测微球的载药、释药性能。将软骨细胞置于复合载体中立体培养，通过苏木素伊红染色、Ⅱ型胶原免疫组化染色、扫描电镜观察复合载体对细胞的增殖、功能的影响。结果缓释微球的TGF—β1包封率达90．1％，并具有良好的药物缓释性能，软骨细胞在复合载体中增殖良好，并能够保持其表型及Ⅱ型胶原分泌功能。结论负载TGF—β1壳聚糖缓释微球的壳聚糖支架作为软骨细胞的载体在组织工程软骨的构建及软骨损伤的修复中有良好的应用前景。     

转化生长因子-β1基因转染骨髓基质细胞的瞬时表达与稳定表达

目的 探讨转化生长因子-β1（TGF-β1）基因转染骨髓基质细胞（BMSCs）的表达能力。方法 取6周龄新西兰白兔BMSCs,传代培养后以3μl阳离子脂质体（Lipofectamine):1μg pcD-NA3J-TGF-β1的比例转染,通过免疫组织化学染色及图像分析对3组15份样本检测TGF-β1表达水平;利用水貂肺上皮细胞生长抑制法检测TGF-β1生物活性,分析转染的量效关系和时效关系。结果 瞬时表达组转染后48h免疫组织化学染色部分细胞呈强阳性,稳定表达组全部细胞呈强阳性表达持续4周以上。图像分析显示转染细胞TGF-β1表达显著增强,与对照组比较差异有非常显著性（P＜0．01）。量效关系显示,在转染体系中pcDNA3-TGF--β1(μg）：阳离子脂质体（μl）为1：3时,TGF-β1表达效率最高;时效关系显示,稳定表达组TGF-β1表达活性较瞬时表达组更强。结论 TGF-β1基因转染可使BMSCs有效地表达活性TGF-β1而产生生物效应。     

hTGFβ_1基因转染对NIH3T3成纤维细胞增殖的影响

目的　探讨在体外培养条件下转化生长基因 β1(hTGFβ1)转染对成纤维细胞生物学功能的影响。　方法　用脂质体介导共转染法将hTGFβ1质粒DNA转染至NIH 3T3成纤维细胞中 ,并设NIH 3T3转染空载体组和NIH 3T3对照组 ,用细胞生长计数、四唑氮蓝流式细胞法 (MTT)和软琼脂集落形成试验分别进行检测。　结果　 (1)转染hTGFβ1后 ,成纤维细胞的生长速度下降 ,以 4～ 6d尤为显著。DNA合成下降 ,G1比例增高 (从 39.9%升至 6 6 .2 % ,P <0 .0 5 ) ;(2 )转染空载体组与对照组的各细胞周期未见明显的变化 ;(3)MTT法与细胞计数法间有良好的相关性 (相关系数达 0 .992 ) ;(4 )转染hTGFβ1后 ,成纤维细胞的软琼脂克隆形成率明显下降 (从 1.18%降至 0 .5 5 % ,P <0 .0 5 )。　结论　hTGFβ1基因转染可抑制成纤维细胞的增殖。原因可能是TGFβ1阻碍了成纤维细胞的DNA合成 ,即G1期与S期之间发生了阻碍     

转化生长因子-β1基因和胰岛素样生长因子1基因联合转染治疗兔膝骨性关节炎的研究

目的观察重组大鼠转化生长因子(TGF)-β1和胰岛素样生长因子(IGF)-1基因转染兔膝关节后对骨性关节炎(OA)的治疗效果。方法前交叉韧带切断法(ACLT)将新西兰白兔膝关节制成OA模型,分为5组,分别向膝关节内注射转染了不同重组基因的阳性克隆软骨细胞。4 周和8周后,取关节标本进行Mankin’s评分,AB-PAS染色,TGF-β1、IGF-1、Ⅱ型胶原原位杂交和免疫组织化学检测,透射电镜观察。结果手术对照组软骨损伤程度较大,其Mankin’s评分为 9．50±0．96(4周)和12．5±1．71(8周),明显高于空白对照组(P<0．01)和TGF—β1基因转染组、双基因转染组(P<0．05);各因子原位杂交和免疫组织化学染色,空白对照组(P<0．01)及TGF-β1 基因转染组、双基因转染组(P<0．05)的灰度值高于手术对照组;双基因转染组的灰度值较单基因转染组高(P<0．05);8周时各对应组灰度值较4周有明显下降(P<0．05);透射电镜观察显示,手术对照组的超微结构较空白对照组明显紊乱,经基因治疗4周后,超微结构逐渐恢复正常,但在8 周后,其紊乱程度又逐渐加重。结论关节内注射转基因软骨细胞对OA有一定治疗作用;TGF-β1 和IGF-1双基因的治疗效果优于单基因;基因治疗4周后,基因表达逐渐减弱,基因治疗具有时效性。     

慢病毒介导TGF-β1基因诱导大鼠骨髓间充质干细胞成软骨细胞分化

[目的]探讨慢病毒介导转化生长因子β1(tansforming growth factor bata 1,TGF-β1)基因转染大鼠骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs)诱导成软骨细胞分化的作用。[方法]密度梯度离心法分离培养BMSCs,探索病毒感染最佳条件,取第3代细胞,分为实验组和对照组,通过慢病毒载体将外源性TGF-β1基因转染入细胞,观察绿色荧光表达情况,Real-time PCR法和western blot法检测TGF-β1基因的mRNA和蛋白表达情况,7、14 d时行Ⅱ型胶原免疫细胞化学染色、甲苯胺蓝染色和Real-time PCR检测Ⅱ型胶原及聚集蛋白聚糖的表达。[结果]TGF-β1基因转染BMSCs后能够稳定表达。转染7、14 d时,实验组免疫细胞化学染色、甲苯胺蓝染色均为阳性。转染7、14 d时,实验组II型胶原mRNA均显著高于对照组(P<0.01)。转染7 d时,实验组聚集蛋白聚糖mRNA变化不明显,而14 d时显著高于对照组(P<0.01)。[结论]慢病毒介导的TGF-β1基因可成功转染大鼠BMSCs,并诱导其向软骨细胞分化。在此过程中软骨特异性标志Ⅱ型胶原和聚集蛋白聚糖的mRNA表达具有时间差异性。     

褪黑素对骨性关节炎大鼠关节软骨中TGF-β1和IL-1β表达的影响

[目的]探讨褪黑素对骨性关节炎(osteoarthritis,OA)雄性大鼠关节软骨的影响.[方法]雄性SD大鼠40只,通过在大鼠膝关节腔注射4%papain(木瓜蛋白酶)溶液0.2 ml制作骨性关节炎模型和采用持续光照的方法建立大鼠去松果体模型.实验随机分为4组:Ⅰ组:正常对照组(n=10);Ⅱ组:骨性关节炎组(n=10);Ⅲ组:Ⅱ组+持续24 h光照组n=10);Ⅳ组:Ⅲ组+给予褪黑素治疗(n=10).成功建立模型1周后,Ⅳ组左膝关节腔注射浓度为20 mg/ml褪黑素溶液0.2 ml,每周4次,共4周.注射最后1次后,应用ELISA测取大鼠2 Am和2 Pm的血清褪黑素含量,并处死全部老鼠,同时切取股骨髁进行大体观察,之后脱钙制片,行HE染色观察和IL-1β、TGF-β1免疫组化观察(均采用Mankin法进行评分).[结果](1)大体观察:Ⅰ组软骨表面光滑,有弹性且边缘规整;Ⅱ组软骨表面凹凸不平,失去原有的光泽,存在软骨软化现象及软骨下骨外露;Ⅲ组较Ⅱ组严重;Ⅳ组软骨软化现象消失及软骨剥脱,软骨下骨外露减少.(2)组织学观察:Ⅰ组软骨细胞大小一致,排列规整;Ⅱ组软骨细胞排列紊乱,局部可见簇聚现象;Ⅲ组较Ⅱ组严重;Ⅳ组软骨细胞排列较规则,炎性细胞侵润明显较少.(3)免疫组化观察:Ⅳ组关节软骨IL-1β表达显著低于Ⅲ组和Ⅱ组.Ⅳ组关节软骨TGF-β1表达显著高于Ⅲ组和Ⅱ组.同时,4组组织学和免疫组化的Mankin评分比较差异均有统计学意义.[结论]雄性OA模型大鼠在持续光照下可以加快骨性关节炎关节软骨的的退变进程.浓度为20 mg/ml的褪黑素溶液0.2 ml关节腔注射4周后能够抑制骨性关节炎的进一步发展,其可能作用机制与上调软骨生长因子TGF-β1及下调炎性因子IL-1β表达有关.