KIR3 DL1启动子区域 CpG 岛甲基化对抗原表达的影响

目的：探索KIR3DL1启动子区域CpG岛甲基化对抗原表达的影响。方法选择抗原高表达KIR3DL1倡01502和低表达KIR3DL1倡005样本,分别测定启动子区域碱基序列和启动子区CpG岛甲基化程度。对携带有KIR3DL1倡01502、KIR3DL1倡005的NK细胞分别采用5-aza进行去甲基化处理,利用流式细胞仪检测KIR3DL1抗原。结果 KIR3DL1倡01502和KIR3DL1倡005启动子区域－65和－269位存在碱基差异,这导致它们的启动子区域有两个不同的CpG岛。 KIR3DL1倡01502启动子区CpG岛高度甲基化,去甲基化后相应的细胞表面抗原表达显著增加。而携带KIR3DL1倡005的细胞去甲基化处理后,抗原表达没有明显变化。结论 KIR3DL1倡01502启动子区域CpG岛甲基化影响抗原的表达,但是不同抗原表达模式的KIR3DL1等位基因可能存在不同的调控机制。     

小鼠神经母细胞瘤N2a细胞脑啡肽酶基因的表达与启动子区甲基化和组蛋白修饰相关

目的研究小鼠神经母细胞瘤Neuro-2a(N2a)细胞中脑啡肽酶(NEP)基因表达的表观调控机制,探讨DNA甲基化与组蛋白乙酰化之间的相互作用。方法体外培养N2a细胞,以3μmol/L、5μmol/L DNA甲基化酶抑制5-氮杂脱氧胞苷(5-Aza-dc)及(300、500、700)nmol/L组蛋白去乙酰化酶抑制剂曲古抑菌素A(TSA)分别处理N2a细胞48 h和24 h。采用逆转录PCR(RT-PCR)、Western blot法分别检测NEP的mRNA、蛋白表达;亚硫酸氢盐测序聚合酶链反应(BSP)法检测NEP基因启动子区DNA的甲基化水平;染色质免疫共沉淀(ChIP)法检测NEP基因启动子区组蛋白H3的乙酰化水平。结果 5-Aza-dc和TSA均能剂量依赖地提高NEP基因的表达(P0.01);5-Aza-dc可诱导NEP基因去甲基化(P0.01);TSA可增高NEP组蛋白H3乙酰化水平(P0.05),但不能明显改变NEP基因DNA的甲基化水平(P0.05)。结论在小鼠神经母细胞瘤N2a细胞中NEP基因的表达受DNA甲基化及组蛋白乙酰化的调控,组蛋白乙酰化水平并不影响DNA甲基化状态。     

KIR在NK-92MI及K562细胞中的基因型及表达谱分析

目的:分析杀伤细胞免疫球蛋白样受体(KIR)在NK-92MI及K562细胞中的基因型及表达谱, 探索KIR受体的表达调控规律.方法:采用PCR、 RT-PCR及分子克隆测序技术, 检测K562及NK-92MI细胞中KIR2DL1、 2DL2、 2DL3、 2DL4、 2DL5、 2DS1、 2DS2、 2DS3、 2DS4、 2DS5、 3DL1、 3DL2、 3DL3、 3DS1、 2DP1、 3DP1的基因型, 及KIR2DL1、 KIR2DL2、 KIR2DL3、 KIR3DL1、 KIR2DS1、 KIR2DS3及KIR2DS2/4受体mRNA的表达.结果:K562细胞携带KIR2DL1、 2DL2、 2DL3、 2DL4、 2DL5A、 2DS2、 2DS4*003-006、 2DS5、 3DL1、 3DL2、 3DL3基因, 但不表达KIR.NK-92MI细胞携带KIR2DL1、 2DL2、 2DL3、 2DL4、 2DS2、 2DS4*001/002、 2DS4*003-006、 3DL1、 3DL2、 3DL3, 但只表达KIR2DL1、 KIR2DL3及KIR2DS2/4.结论:K562细胞及NK-92MI细胞均携带KIR2DL1、 2DL2、 2DL3、 2DL4、 2DS2、 2DS4*003-006、 3DL1、 3DL2、 3DL3.NK-92MI细胞表达KIR受体, K562细胞不表达上述KIR, KIR呈细胞特异性表达.     

Islet-1诱导成纤维细胞系C3H10T1/2向心肌细胞分化过程中组蛋白乙酰化与DNA甲基化在GATA4启动子区的关系

目的研究在Islet-1诱导间充质干细胞C3H10T1/2向心肌细胞特异分化过程中的心肌早期发育相关基因GATA4启动子区域组蛋白乙酰化与DNA甲基化的相互作用关系。方法构建过表达Islet-1细胞模型,在GATA4基因表达过程中,用染色质免疫共沉淀技术(CHIP)检测其启动子区组蛋白H3K9乙酰化的时序性变化;甲基化特异性PCR技术(MSP)检测其启动子区Cp G岛甲基化的时序性变化,明确两者之间相互作用的关系。结果随着Islet-1诱导C3H10T1/2向心肌细胞特异分化的时间延长,GATA4基因的表达增高(P0.05),其启动子区第2个Cp G位点组蛋白H3K9乙酰化的水平升高(P0.05),DNA甲基化水平降低(P0.05)。结论 Islet-1诱导C3H10T1/2细胞向心肌细胞特异分化过程中,组蛋白乙酰化和DNA甲基化在调控心肌特异早期转录因子GATA4表达过程中存在相互拮抗作用,从而促其表达呈时序性变化。     

KIR3DL1基因启动子亚克隆及表达调控载体的构建

为研究KIR3DL1基因的表达调控机制,亚克隆KIR3DL1基因的核心启动子序列,并构建KIR3DL1基因启动子-荧光素酶报告载体,采用PCR法从含有KIR3DL1基因转录起始位点5'侧翼区的质粒中扩增KIR3DL1基因核心启动子序列,产物纯化回收后与pGEM-T easy载体连接,测序鉴定正确的重组子经限制性内切酶BglⅡ和NcoⅠ双酶切后,插入同样经BglⅡ和NcoⅠ双酶切的用于基因表达调控研究的pGL3-Basic报告载体,最终获得了长度为254bp的KIR3DL1基因启动子克隆,构建了调控荧光素酶报告基因的真核表达载体.通过酶切及基因测序的方法证实所构建的重组子是正确的,说明KIR3DL1基因启动子表达调控载体的构建是成功的.     

肿瘤DNA异常甲基化与组蛋白修饰

基因启动子区域异常甲基化是肿瘤抑制基因失活的一个关键机制 ,与肿瘤每一步形成有关的基因也能靠这种机制失活。DNA甲基化抑制剂如 5氮杂脱氧胞苷 (5AZA)能逆转这种表观遗传学事件 ,说明可以用它治疗肿瘤。染色质的结构对基因表达调控也起重要作用 ,组蛋白中包含低乙酰化赖氨酸的染色质有一个紧密的结构 ,对转录起抑制作用。组蛋白去乙酰化酶 (HDAC)抑制剂能够使染色质结构开放 ,激活抑制肿瘤生长的某些基因 ,这些组蛋白去乙酰化抑制剂也可用于肿瘤治疗。DNA甲基化与组蛋白去乙酰化的联合作用可以用于沉寂基因转录 ,具体分子机理牵涉到甲基化CpG岛结合蛋白吸附到甲基化启动子上 ,以及吸附组蛋白去乙酰化酶形成抑制转录的复合物 ,这两种表观遗传学修饰代表了用 5AZA和HDAC抑制剂治疗干预的靶位点 ,这两种试剂联合使用显示有重新激活肿瘤抑制基因和增强抗肿瘤细胞增殖的协同效果 ,应当作为表观遗传学治疗肿瘤的新方法加以研究。     

5-氮杂胞苷对结肠癌细胞CHD5基因表达及细胞增殖活性的影响

目的研究甲基化转移酶抑制剂5-氮杂-2-脱氧胞苷(5-氮杂胞苷,AZA)对人肿瘤相关基因CHD5(染色质解旋酶DNA结合蛋白5)在结肠癌细胞中的基因转录的诱导作用以及其对细胞增殖的影响。方法 5μmol/L 5-氮杂胞苷分别作用于Lovo和SW480细胞,连续作用72 h后,用荧光定量PCR(qPCR)检测两种结肠癌细胞系中CHD5mRNA的表达,重亚硫酸盐测序(BSP)法分析启动子区的甲基化状况,MTT法分析5-氮杂胞苷对Lovo和SW480细胞增殖的影响。结果 5μmol/L 5-氮杂胞苷处理Lovo和SW480细胞72 h后,Lovo和SW480细胞中CHD5基因的发生了去甲基化,其mRNA重新表达,细胞生长受到抑制。结论 5-氮杂胞苷能够反转CHD5基因的甲基化状态,调控CHD5 mRNA表达,并能有效地抑制结肠癌细胞的增殖。     

地塞米松诱导NK-92MI细胞株凋亡机制的研究

目的:探讨地塞米松(DEX)对NK-92MI细胞株杀伤活性及凋亡的影响及机制.方法:用不同浓度的DEX处理NK-92MI细胞:采用MTT比色法测定NK-92MI细胞的增殖率和对靶细胞的杀伤作用;流式细胞术检测NK-92MI细胞凋亡率;RT-PCR 检测凋亡相关基因Bcl-2、Bax的表达.结果:浓度为1×10-8mol/L至1×10-3mol/L的DEX作用NK-92MI细胞24、48、72小时后,对其增殖均有明显抑制作用(P<0.05);效靶比为5∶1时,1×10-8mol/L至1×10-3mol/L的DEX对NK-92MI细胞杀伤活性均有抑制作用,与对照组相比有显著性差异(P＜0.05);DEX可诱导NK-92MI细胞发生凋亡且凋亡诱导作用呈浓度时间依赖性;与对照组相比,DEX组Bcl-2基因表达降低(P＜0.05),Bax基因表达增高(P＜0.01).结论:DEX可以抑制NK-92MI细胞增殖并且降低其杀伤活性,机制可能是通过诱导NK-92MI细胞凋亡,而后者与Bax/Bcl-2基因表达增高有关.     

雌激素受体α阴性乳腺癌雌激素受体α基因启动子区CpG岛甲基化和肼苯哒嗪去甲基化作用

目的 检测雌激素受体(ER)α阴性乳腺癌细胞株MDA-MB-231和MDA-MB-435细胞及ERα阴性乳腺癌组织中ERα基因启动子区CpG岛甲基化状态;探索肼苯哒嗪能否作为去甲基化药物恢复ERα基因表达。方法应用特异性聚合酶链反应(MSP)检测乳腺癌细胞株MDA-MB-231和MDA-MB-435细胞和20例ERα阴性乳腺癌组织ERα基因3个启动子区A、B、CpG岛甲基化情况,肼苯哒嗪处理上述两种乳腺癌细胞,逆转录(RT)-PCR检测不同启动子调控下ERα基因异型体(isoform)ERα-A、ERα-B、ERα-C mRNA和ERα基因公共编码区mRNA表达。结果MDA-MB-231和MDA-MB-435细胞启动子区ERα-A、ERα-B均存在CpG岛甲基化,ERα-C无甲基化,20例ERα阴性乳腺癌组织中,13例(65％)ERα-A、10例(50％)ERα-B CpG岛甲基化阳性。其中9例ERα-A、ERα-BCpG岛甲基化均阳性(45％),仅1例(5％)ERα-C存在CpG岛甲基化。肼苯哒嗪处理上述两种细胞后,检测到ERα-A、ERα-B mRNA和公共编码区mRNA表达。结论乳腺癌组织和细胞ERα基因表达沉默可能与ERα基因启动子区A、B甲基化有关,且肿瘤分期愈晚,甲基化程度愈高。肼苯哒嗪能作为去甲基化药物诱导ERα基因表达。     

DNA甲基化、组蛋白去乙酰化与基因表达抑制

DNA甲基化是指由S．腺苷甲硫氨酸（SAM）提供甲基基团。在DNA甲基转移酶（DNA methyltransferases,DNMTs）的作用下,将CpG二核苷酸的胞嘧啶（C）甲基化为5-甲基化胞嘧啶（5-mC）的一种化学反应。DNA甲基化是调节基因转录表达的一种重要的表遗传的修饰方式。一些抑癌基因由于启动子的甲基化而使该基因表达失活从而导致肿瘤发生的理论已经被广泛认可。已有研究发现,选择性地结合于甲基化DNA的特异性的转录抑制子MeCP2（methyl-CpG binding protein2）,即甲基化CpG结合蛋白（methyl-CpG binding proteins）,与组蛋白去乙酰化酶（histone deacetylase,HDAC）在细胞中共存于一个复合物中心。因而有理由认为DNA甲基化调节基因表达与组蛋白去乙酰化之间有密切的关系。     

可溶性HLA-G1与NK-92细胞表面ILT2及KIR2DL4受体相互作用的研究

 目的 探讨可溶性 HLA-G1（sHLA-G1）对人 NK-92 细胞杀伤活性的抑制与细胞表面免疫球蛋白样转录分子 2（ILT2）和杀伤细胞免疫球蛋白样受体 2DL4（KIR2DL4）受体的关系。 方法 ①通过原核表达技术获得 sHLA-G1 重组蛋白（重组蛋白），并采用蛋白质印迹法进行鉴定。②取 NK-92 细胞，加入终浓度 20 μg/ml 的重组蛋白分别培养 10、30 min，再分别加入抗 HLA-G1/G5、抗ILT2 和抗 KIR2DL4 抗体，采用流式细胞术检测各组 NK-92 细胞表面 sHLA-G1 和 ILT2、KIR2DL4 受体表达阳性率；以 NK-92 细胞单独培养作为对照组。③以人白血病 K562 细胞为靶细胞，以经不同方式处理的 NK-92 细胞为效应细胞，效靶比为5:1，共同培养 2 h，采用流式细胞术检测 NK-92 细胞对 K562 细胞的杀伤率。NK-92 细胞处理方式为单纯重组蛋白处理（分别加入终浓度为 0、10、20 μg/ml 的重组蛋白培养 30 min）和表面受体封闭 + 重组蛋白处理（分别加入抗 ILT2、抗 KIR2DL4、抗 LT2 + 抗 KIR2DL4 抗体培养 30 min，再分别加入终浓度为 0、10、20 μg/ml 的重组蛋白培养 30 min）。 结果 ①蛋白质印迹分析表明所获重组蛋白为带有组氨酸标签的特异蛋白。②NK-92 细胞与 20 μg/ml 重组蛋白共培养 30 min 后，sHLA-G1 表达阳性率明显高于而 ILT2、KIR2DL4 受体表达阳性率均明显低于对照组（均 P < 0.05）。③以终浓度 0、10、20 μg/ml 的重组蛋白处理的 NK-92 细胞对 K562 细胞的杀伤率分别为 39.79% ± 2.00%、27.79% ± 0.75%、21.36% ± 0.67%（两两比较，均 P < 0.01）；单独封闭 ILT2 受体，杀伤率分别为 23.09% ± 1.63%、21.13% ± 0.38%、18.42% ± 0.47%（两两比较，均 P < 0.01）；单独封闭 KIR2DL4 受体，杀伤率分别为 30.74% ± 0.44%、26.03% ± 0.38%、21.15% ± 0.35%（两两比较，均 P < 0.01）。 结论 sHLA-G1 通过与 NK-92 细胞表面 ILT2 和 KIR2DL4 受体直接结合而抑制 NK-92 细胞的杀伤活性。     

Pharmacologically upregulated carcinoembryonic antigen-expression enhances the cytolytic activity of genetically-modified chimeric antigen receptor NK-92MI against colorectal cancer cells

Background

The natural killer cell line, NK-92MI, is cytotoxic against various types of cancer. The aim of this study was to develop chimeric antigen receptor-modified (CAR) NK-92MI cells targeting carcinoembryonic antigen-expressing (CEA) tumours and increase killing efficacy by pharmacologically modifying CEA-expression.

Result

We generated anti-CEA-CAR NK-92MI cells by retroviral vector transduction. This genetically-modified cell line recognised and lysed high CEA-expressing tumour cell lines (LS174T) at 47.54?±?12.60% and moderate CEA-expressing tumour cell lines (WiDr) at 31.14?±?16.92% at a 5:1 effector: target (E/T) ratio. The cell line did not lyse low CEA-expressing tumour cells (HCT116) as they did their parental cells (NK-92MI cells). The histone deacetylase-inhibitor (HDAC) sodium butyrate (NaB) and the methylation-inhibitor 5-azacytidine (5-AZA), as epigenetic modifiers, induced CEA-expression in HCT116 and WiDr cells. Although the IC₅₀ of 5 fluorouracil (5-FU) increased, both cell lines showed collateral sensitivity to anti-CEA-CAR NK-92MI cells. The cytolytic function of anti-CEA-CAR NK-92MI cells was increased from 22.99?±?2.04% of lysis background to 69.20?±?11.92% after NaB treatment, and 69.70?±?9.93% after 5-AZA treatment, at a 10:1 E/T ratio in HCT116 cells. The WiDr cells showed similar trend, from 22.99?±?4.01% of lysis background to 70.69?±?10.19% after NaB treatment, and 59.44?±?10.92% after 5-AZA treatment, at a 10:1 E/T ratio.

Conclusions

This data indicates that the effector-ability of anti-CEA-CAR NK-92MI increased in a CEA-dependent manner. The combination of epigenetic-modifiers like HDAC-inhibitors, methylation-inhibitors, and adoptive-transfer of ex vivo-expanded allogeneic-NK cells may be clinically applicable to patients with in 5-FU resistant condition.

     

Changes of Inhibitory Receptors on NK-92 Cells and HLA-G on BeWo Cells with Toxoplasma gondii Infection

The aim of this study were to demonstrate the effects of Yellow fluorescent protein-Toxoplasma gondii infection on the NK-92 cells co-cultured with BeWo cells in vitro and to verify the implications upon adverse pregnancy outcome. There are four groups including NK-92 cells infected or uninfected with T. gondii, and NK-92 cells co-cultured with BeWo cells in the presence or absent of T. gondii infection. Cells were observed by fluorescence microscope at 12, 24, 36, 48, and 60 h after infection. Levels of inhibitory receptors killer immunoglobulin-like receptor (KIR)2DL4 and ILT-2 expressed on NK-92 cells, and their common ligand HLA-G expressed on BeWo cells were measured by real-time PCR and flow cytometry in all groups. Levels of KIR2DL4, ILT-2 and HLA-G increased at 12, 24, 36, and 48 h, while decreased at 60 h in all T. gondii-infected groups compared with their parallel control groups, respectively. KIR2DL4 and ILT-2 expression in co-culture groups with infection were higher than those in infected NK-92 groups at 12, 24, 36, and 48 h, while there were no significant differences at 60 h. The expression of the two inhibitory receptors was correlated with HLA-G expression in infected co-culture groups. The changes of inhibitory receptors on NK-92 cells and their common ligand HLA-G on BeWo cells with T. gondii infection might contribute to the occurrence of adverse pregnancy outcome.     

Possible roles of KIR2DL4 expression on uNK cells in human pregnancy

PROBLEM: To investigate possible roles of the natural killer (NK) cell receptor killer immunoglobulin-like receptor (KIR)2DL4 expressed on uterine NK (uNK) cells during pregnancy, we investigated KIR2DL4 expression on uNK cells isolated from patients with early recurrent spontaneous abortion (RSA) and normal early pregnancy women, and functions of KIR2DL4 was analyzed in vitro. METHODS OF THE STUDY: Semi-quantitative RT-PCR analysis was introduced to detect KIR2DL4 messenger RNA (mRNA) expression on uNK cells. Cytotoxicity and cytokine production as the result of interaction of KIR2DL4 and its ligand human leukocyte antigen (HLA)-G were analyzed in vitro with lactic dehydrogenase releasing method and enzyme-linked immunosorbent assay, respectively. RESULTS: No significant difference in KIR2DL4 mRNA expression was observed, while the KIR2DL4 protein level in isolated uNK cells is much higher in normal controls than that in RSA patients. Data showed that HLA-G transfection could not reverse the lysis of uNK against HLA-G transfected K562 cells but induced cytokine production. Furthermore, we demonstrated that, via KIR2DL4, membrane-bound HLA-G could induce high cytotoxicity and cytokine production in a high cytotoxic, IL-2 dependent human NK cell line NK-92 cells. CONCLUSION: Our data suggest that KIR2DL4 might play a crucial implication for human pregnancy.