4-1BBL分子在人恶性血液病细胞系的表达

目的:研究共刺激分子4-1BBL分子在人恶性血液病细胞系的表达及其生物学意义。方法:流式细胞仪检测4-1BBL分子在不同的人恶性血液病细胞系的表达;用可介导4-1BBL逆向信号的鼠抗人4-1BBL单抗(mAb1F1)作用于8个不同的人恶性血液病细胞系,细胞计数法和3H-TdR掺入法评价细胞系的体外生长和增殖。结果:FACS结果显示4-1BBL分子在人恶性血液病细胞系上有不同程度的表达,其中髓性白血病细胞系U937、HL60及B淋巴瘤细胞系Raji、Daudi上呈现较高水平的表达。细胞计数和3H-TdR掺入实验结果表明mAb1F1对髓性白血病细胞系U937和HL60,具有较强的促增殖效应。结论:共刺激分子4-1BBL分子在髓性白血病细胞系和B淋巴瘤细胞系上表达率较高;4-1BBL分子可通过介导逆向信号促进髓性白血病细胞系U937和HL60的生长和增殖。     

去甲斑蝥素对人多发性骨髓瘤细胞株U266生长调控的影响及其机制的研究

目的 研究去甲斑蝥素(norcantharidin,NCTD)对多发性骨髓瘤细胞株的增殖及其凋亡的影响及其可能的机制.方法 四甲基偶氮唑盐[3-(4,5-dimethyl-2 thiahiazoyi)-3,5-di-phenyl-tetrazolium bromide,MTT]检测5、20、40、80、160μmol/L的NCTD对U266细胞增殖的影响;用流式细胞术检测不同浓度NCTD对细胞周期及细胞凋亡的影响,并应用半定量反转录聚合酶链反应检测survivin基因表达的变化.结果 在20～160μmol/L的浓度内,NCTD对U266细胞的增殖有抑制,抑制与NCTD的浓度呈剂量依赖关系(P<0.05).不同浓度的NCTD能诱导多发性骨髓瘤细胞株U266凋亡,使细胞明显阻滞于G2 /M 期;在NCTD作用下,U266 细胞survivin 及其机制可能与诱导凋亡、细胞周期阻滞有关.结论 NCTD能抑制U266细胞的增殖,并诱导其凋亡的机制可能与抑制survivin的表达及G2 /M 期阻滞有关.     

蟾蜍灵抑制多发性骨髓瘤细胞的机制研究

目的探讨蟾蜍灵(bufalin)对多发性骨髓瘤(multiple myeloma,MM)的白细胞介素-6(interleukin-6I,L-6)表达的影响,以期证实蟾蜍灵抗MM的分子生物学机制。方法人MM细胞系U266与不同浓度的蟾蜍灵作用,逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测IL-6基因表达。结果不同浓度的蟾蜍灵作用U266细胞48h后RT-PCR检测结果表明:U266细胞的IL-6基因表达与对照相比均明显降低;差异有显著性意义(P<0.01)。结论蟾蜍灵能抑制U266细胞的IL-6基因表达。提示降低IL-6的表达是蟾蜍灵抗MM的机制之一。     

熊果酸对多发性骨髓瘤细胞株U266的凋亡作用及机制

目的 探讨三萜类化合物熊果酸（ursoIic acid,UA）对多发性骨髓瘤（multiple myeloma,MM）细胞株U266的凋亡诱导作用及分子机制.方法 用熊果酸处理U266细胞,Cell Counting Kit-8法检测细胞增殖抑制情况;用20μmol/L熊果酸处理U266细胞24 h,瑞氏法染色后在光学显微镜下观察细胞凋亡的形态学变化;Annexin-V标记,在流式细胞仪上检测细胞凋亡率变化;用实时荧光定量PCR方法及Western blot方法检测FGFR3、Bcl-2、CCND1、MYC及p53的表达变化.结果 经熊果酸处理后,U266细胞的增殖受到抑制,光学显微镜下可观察到细胞形态不规则样改变,胞膜小泡状形成,细胞质内空泡增多,细胞核染色质浓缩、固缩;流式细胞术检测Annexin-V阳性细胞比例随用药浓度增加及用药时间延长而增加;细胞内FGFR3、Bcl-2、CCND1、MYC的mRNA和蛋白质表达随用药浓度增加及用药时间延长呈显著下降趋势,而p53的mRNA及蛋白表达逐渐增高.结论 熊果酸可抑制U266细胞的增殖并诱导其凋亡,体外有抗多发性骨髓瘤细胞作用,为多发性骨髓瘤选择新的靶向治疗方案提供实验依据.     

龙葵总提取物对多发性骨髓瘤U266细胞株的作用

目的:研究龙葵总提取物对U266细胞的细胞毒作用及其机制.方法:U266细胞株与龙葵总提取物共同培养,用CCK-8试剂检测细胞毒作用;用流式细胞仪测定细胞周期及凋亡.结果:龙葵总提取物对U266细胞有细胞毒作用,半数抑制(质量)浓度约为117 mg/L;龙葵总提取物影响U266细胞周期,G0/G1期细胞减少,S期、G2/M期细胞增加,凋亡细胞增加.用Annexin V/PI染色及TFAR19染色流式细胞仪检测,均显示细胞凋亡与龙葵总提取物有剂量依赖关系.结论:龙葵总提取物对U266细胞有体外细胞毒作用,其作用机制部分是诱导细胞凋亡.     

沉默NUPR1基因对人多发性骨髓瘤U266细胞自噬的影响及机制研究

目的：探讨沉默核蛋白1（nuclear protein 1,NUPR1）对人多发性骨髓瘤U266细胞自噬的影响及可能机制。方法：以正常人骨髓单个核细胞为对照,采用实时荧光定量PCR（quantitative real-time PCR,qRT-PCR）检测人多发性骨髓瘤U266细胞NUPR1和自噬相关基因（ATG5和Beclin1）mRNA水平。构建含有靶向抑制NUPR1基因表达的小发夹RNA（small hairpin RNA,shRNA）序列的NUPR1-shRNA慢病毒载体,并将其转染人多发性骨髓瘤U266细胞。实验分为未转染组、阴性对照转染组和转染组,qRT-PCR、Western Blot检测NUPR1干扰效果、3组细胞自噬相关指标（ATG5、Beclin1、P62、LC3Ⅱ/LC3Ⅰ） 及相关通路蛋白（p-AKT/T-AKT、p-mTOR/T- mTOR）的表达;单丹磺酰戊二酸（monodansylcadaverine,MDC）染色后,荧光显微镜下观察自噬囊泡的聚集。结果：人多发性骨髓瘤U266细胞较正常人骨髓单个核细胞及转染组细胞NUPR1（F=7.747,P=0.004）、Beclin1（F=5.548,P=0.013）和ATG5（F=4.031,P=0.034） mRNA水平明显增高。转染组NUPR1（F=9.798,P=0.013）、ATG5（F=7.017,P=0.027）、Beclin1（F=7.213,P=0.025）和LC3Ⅱ/LC3Ⅰ（F=7.040,P=0.027）蛋白表达较未转染组和阴性对照转染组明显降低,而P62（F=52.622,P=0.000）、p-AKT/T-AKT（F=6.584,P=0.031）和p-mTOR/T- mTOR（F=7.950,P=0.021）蛋白表达明显增高;转染组细胞胞质内自噬囊泡聚集明显减少（F=12.172,P=0.008）。结论：人多发性骨髓瘤U266细胞NUPR1高表达,自噬水平较正常人骨髓单个核细胞高。沉默NUPR1可下调U266细胞自噬水平。NUPR1基因可能通过AKT/mTOR通路调节U266细胞自噬。     

凝血酶受体在多发性骨髓瘤细胞XG-1增殖和抗凋亡作用中的机制

目的研究凝血酶及其受体在促进多发性骨髓瘤细胞增殖和抗凋亡作用中的机制。方法采用免疫荧光标记、流式细胞仪检测、细胞计数和免疫印迹等方法,对多发性骨髓瘤细胞株XG-1细胞表达的凝血酶受体、凝血酶对XG-1的增殖与抗凋亡作用及细胞内JAK2-STAT3分子磷酸化进行分析。结果凝血酶可以通过激活XG-1表面的凝血酶受体,继而激活JAK2-STAT3途径的磷酸化,促进骨髓瘤细胞的增殖与抗凋亡作用,且该作用与gp130介导的信号转导作用无关。结论凝血酶及其受体介导的信号转导通路是多发性骨髓瘤维持增殖和抗凋亡作用的因素之一。     

人4-1BBL胞外区蛋白的生物学活性研究

目的 研究人4-1BBL胞外区蛋白与4-1BB表达阳性细胞的结合与激活活性.方法 采用酶联免疫吸附分析人4-1BBL胞外区蛋白与A549细胞的结合活性,并进一步采用免疫组化分析人4-1BBL胞外区蛋白与4-1BB阳性细胞的结合活性,然后研究人4-1BBL胞外区蛋白对Jurkat细胞IL-2释放的影响.结果 4-1BBL胞外区蛋白能与4-1BB表达阳性的A549细胞系以及激活的Jurkat细胞特异性结合,并能维持激活的Jurkat细胞释放IL-2.结论 所获得的人4-1BBL胞外区蛋白具有结合与激活双重活性,在肿瘤及其他免疫性疾病的治疗中具有潜在的应用前景.     

多发性骨髓瘤患者血清IL-6及sIL-6R变化的意义

目的:探讨多发性骨髓瘤(MM)患者血清白细胞介素6(IL-6)及血清可溶性白细胞介素6受体(sIL-6 R)水平及临床意义.方法:联合检测24例MM患者化疗前后血清IL-6及sIL-6 R水平.结果:初诊时血清IL-6及sIL-6 R较正常对照组显著增高(P<0.01).MM患者sIL-6 R水平与疗效及病情活动有关.有效组用药后sIL-6 R明显下降,低于无效组(P<0.01),无效组用药后变化不明显(P>0.05).动态观察发现sIL-6 R水平与骨髓浆细胞比例的变化相一致.结论:初诊MM患者血清IL-6及sIL-6 R较正常对照组显著增高.血清sIL-6 R可作为估计MM疗效、判断预后的指标.     

白细胞介素6及其受体在多发性骨髓瘤患者外周血中的表达及作用

本研究测定了多发性骨髓瘤（ＭＭ）患者血清的白细胞介素６（ＩＬ６）及ＩＬ６Ｒ水平，以及外周血单个核细胞（ＰＭＮＣ）中ＩＬ６和ＩＬ６Ｒ的ｍＲＮＡ表达，并通过凝胶阻滞电泳（ＥＭＳＡ）的方法对病变条件下ＩＬ６与ＰＭＮＣ核内急性期蛋白反应因子（ＡＰ...     

人4-1BBL转基因细胞株的构建及其生物学功能的研究

目的为探讨人4-1BBL分子的生物学功能，构建人4-1BBI。转基因细胞株。方法利用RT-PCR方法克隆人4-1BBI。全长基因，继而重组入逆转录病毒表达载体pEGZ．Term。重组逆转录病毒载体pEGZ．Term／4-1BBI。与两个辅助病毒载体用脂质体法共转染包装细胞293T，用含有完整重组逆转录病毒颗粒的293T细胞培养上清感染L929细胞，筛选获得Zeocin抗性的转基因细胞。^3H-TdR掺入实验分析4-1BBL转基因细胞对T细胞增殖的影响，ELISA法分析细胞因子的分泌。结果流式细胞仪表型分析结果表明，L929／4．1BBL转基因细胞稳定表达人4-1BBL分子。体外实验表明，L929／4-1BBL细胞能够促进T细胞活化、增殖及IL-2、IL-6和IFN-γ的分泌。结论该研究成功克隆了人4-1BBL基因，构建了能稳定表达4-1BBL分子的转基因细胞株L929／4-1BBL，该株转基因细胞能提供有效的4-1BBL共刺激信号，促进T细胞活化、增殖及细胞因子的分泌。     

激发型鼠抗人4-1BBL单克隆抗体的研制

目的鼠抗人4—1BBL单克隆抗体的制备及其生物学特性研究。方法以高表达人4—1BBL分子的基因N-程细胞株L929／4—1BBL为免疫原免疫BALB／c小鼠,利用淋巴细胞杂交瘤技术进行细胞融合,经过选择性克隆化培养及流式细胞术分析,筛选分泌特异性抗A4—1BBL单抗的杂交瘤细胞株;采用快速定性试纸法鉴定单抗亚类、间接免疫荧光法检测单抗对肿瘤细胞株的识别谱。进而,将所获抗人4-1BBL单抗体外刺激白血病细胞株U937,通过细胞计数法分析单抗对U937生长的影响。结果获得一株持续、稳定分泌鼠抗人4—1BBL单抗的杂交瘤细胞株,并将其分泌的单抗命名为39A8。单抗39A8可有效识别不同肿瘤细胞株表达的4—1BBL,经细胞计数分析,39A8对U937细胞的生长具有明显的促增殖作用。结论单抗39A8是可激发4-1BBL逆向信号的单克隆抗体,是研究4—1BBL分子及其功能的重要工具。     

4-1BB/4-1BBL在自身免疫性心肌炎小鼠心肌中的表达及意义

目的:探讨4-1BB/4-1BBL在实验性自身免疫性心肌炎(EAM)小鼠心肌组织中的表达及意义。方法:将提纯的猪心肌肌球蛋白和完全弗氏佐剂等体积混合成乳浊液在1 d、8 d免疫具有遗传易感性的BALB/c小鼠,建立EAM模型。对照组小鼠仅用完全弗氏佐剂皮下注射。分别于初次免疫后21 d、80 d进行心肌炎症评分及血清cTnI测定,采用免疫荧光及RT-PCR技术检测4-1BB/4-1BBL在小鼠心肌组织中的表达。结果:在急性期21 d,模型组小鼠心肌组织见不同程度的急性炎性细胞浸润和心肌细胞变性坏死、cTnI水平高于对照组(P<0.05);80d模型组小鼠心肌组织炎症减弱伴有纤维化出现、cTnI较前期降低;免疫荧光见4-1BBL在模型组心肌中表达明显,在对照组小鼠心肌中少量表达(P<0.05);21 d模型组小鼠心肌组织中4-1BB/4-1BBL基因表达水平均高于对照组(P<0.01),80 d时表达仍然升高(P<0.01)。结论:4-1BB/4-1BBL在EAM小鼠心肌中的表达是上调的,4-1BB/4-1BBL通路参与了自身免疫性心肌炎的发生发展过程。     

靶向4-1BBL基因siRNA抑制HL-60B细胞生长的体外研究

目的：观察4-1BBL基因小分子干扰RNA（siRNA）对HL-60细胞生长及诱导其凋亡作用的影响。方法：化学合成法合成靶向人4-1BBL基因siRNA,脂质体转染法转染HL-60B细胞;半定量PCR和流式细胞术检测转染前后HL-60B细胞4-1BBL的表达水平,MTT法检测HL-60B细胞增殖,流式细胞术检测细胞凋亡。结果：靶向4-1BBL基因siRNA转染HL-60B细胞后,4-1BBLmRNA和蛋白的表达明显降低;细胞增殖被抑制,其抑制作用在转染后48h最明显,增生抑制率达到（22.1±2.3）%;细胞凋亡率增加,由（9.8±2.5）%上升到（32.5±5.1）%。结论：化学合成的siRNA在体外能成功抑制靶基因4-1BBL的表达和HL-60B细胞的增殖,并有助于细胞趋向凋亡。     

雷公藤红素对多发性骨髓瘤细胞株LP-1凋亡的诱导作用

目的研究雷公藤红素对多发性骨髓瘤细胞LP-1凋亡的诱导作用及可能机制。方法通过雷公藤红素体外作用于多发性骨髓瘤LP-1细胞,研究其对于细胞增殖及细胞凋亡的影响。采用EnoGeneCell TM细胞计数试剂盒-8(cell counting kit-8,CCK-8)研究雷公藤红素对LP-1多发性骨髓瘤细胞体外增殖的影响,采用膜联蛋白Ⅴ(AnnexinⅤ)-增强型绿色荧光蛋白(enhanced green fluorescent protein,EGFP)荧光染色法定性检测及流式细胞术定量检测雷公藤红素对LP-1多发性骨髓瘤细胞株凋亡的诱导作用,采用级联酶底物显色法检测雷公藤红素对LP-1多发性骨髓瘤细胞Caspase-3酶原活化状态的影响。结果雷公藤红素能明显抑制LP-1多发性骨髓瘤细胞体外增殖,其半数抑制浓度(half inhibitory concentration,IC50)为0.881 7μmol/L。雷公藤红素可诱导LP-1细胞发生细胞凋亡,此效应具有剂量依赖性,雷公藤红素60.0μmol/L作用于LP-1细胞24h可诱导细胞凋亡百分率达到80.7%。雷公藤红素可引起LP-1细胞Caspase-3酶原活化。结论雷公藤红素可抑制多发性骨髓瘤细胞株增殖,诱导其凋亡,此作用可能通过Caspase-3酶原活化途径而实现。     

人4-1BB转基因细胞的构建及体外生物学功能的研究

目的构建人共刺激分了4-1BB转基因细胞并探讨4-1BB的体外生物学功能。方法利用RT-PCR方法从人外周血淋巴细胞总RNA中克隆出人4-1BB基因，经双酶切装入逆转录病毒载体pGEZ-Term中，重组逆转录病毒载体4—1BB／pGEZ-Term与两个辅助病毒载体用脂质体法共转染包装细胞293T．用含有完整病毒颗粒的293T细胞的培养上清感染晕新铺板的293T细胞，加入Zeocin选择性培养基进行筛选。经RT-PCR、Western blot、流式细胞仪表型检测等方法鉴定转基因细胞。^3H-TdR掺入法分析转基因细胞对T细胞的作用；DCs培养过程中，加入转基因细胞与激发型CI40单抗5C11．流式细胞仪分析DCs表面分子CD80、CD83和CD86的表达。结果成功构建了能稳定表达人4-1BB蛋白的转基因细胞4-1BB／293T，该转基因细胞与T细胞共培养可抑制其体外增殖，可协同5C11促进DCs的体外成熟，上凋DCs表面分子CD80、CD83和CD86的表达。结论稳定表达4—1BB蛋白的转基因细胞株的建立为该基因功能的后续研究和单克隆抗体的研制奠定了基础。     

小鼠4-1BBL基因真核表达载体构建及其在前列腺癌细胞中的表达

目的:构建含小鼠4-1BBL编码区cDNA序列的真核表达载体,并检测其在前列腺癌细胞株(PC-3)中的表达。方法:将目的基因m4-1BBL全长cDNA克隆到真核表达载体pcDNA3.1(+),获得m4-1BBL定向插入重组子pcDNA3.1(+)m4-1BBL,采用限制性内切酶和测序鉴定是否成功构建。用脂质体法将重组质粒转入PC-3细胞,逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)和Western blot检测m4-1BBL在PC-3中的表达。结果:酶切鉴定和序列分析证实,重组质粒含有小鼠4-1BBL全长cDNA编码序列,转染实验表明m4-1BBL基因能在PC-3细胞中表达。结论:小鼠4-1BBL全长cDNA基因真核表达载体构建及其在PC-3细胞中的表达均获成功,为进一步研究莫定了基础。     

大鼠4-1BBLcDNA的克隆、分析及染色体定位

目的克隆、分析并染色体定位肿瘤坏死因子配体超家族（Tumor Necrosis Factor Superfamily，TNFSF）成员4-1BBL分子。方法在对小鼠、人4-1BBLmRNA进行生物信息学分析的基础上，采用PCR扩增、T载体克隆测序等实验技术，并用软件对基因进行了拼接、序列分析及同源性比较，同时通过荧光原位杂交（FISH）技术对该基因进行了染色体定位。结果首次获得了具有完整开放阅读框的大鼠eDNA，GenBank登录号为No．AY259541，通过同源性比较分析，证明该基因与小鼠高度同源，编码区的核苷酸序列与小鼠、人的同源性分别为88％、37％。推导出的大鼠4-1BBL蛋白质由308个氨基酸分子组成，分子量为33469d，胞外区有三个潜在的N糖基化位点：AA138，AA160和AA292，是典型的Ⅱ型糖蛋白，与小鼠、人在氨基酸水平的同源性分别为83％、31％，其中胞质区为76％、32％，跨膜区为45％、40％，胞外区为87％、28％。该基因定位于大鼠染色体9q1（Gen Bank UniGene登录号为No．Rn．46783）。结论大鼠4-1BBL胞内区的“SDAA”可能发挥着TNF家族中具有逆信号的其他成员的胞内区酪氨酸激酶Ⅰ磷酸化位点“SXXS”的作用。大鼠4-1BBLcDNA的成功克隆与定位为探讨4-1BBL在免疫共刺激中的作用机制以及TNF分子的进化研究打下了基础。