间充质干细胞对活化T淋巴细胞的免疫调节作用

本研究的目的是探讨骨髓间充质干细胞（MSC）对活化T淋巴细胞的免疫调节作用及其在allo—HSCT相关GVHD防治中的作用。用终浓度为10μg/ml的PHA于不同时间作用T淋巴细胞，以^3H—TdR掺入法检测T细胞增殖功能；以不同数量的MSC分别与活化T淋巴细胞作用，根据MSC数量不同实验分为A组（对照组，不加MSC）、B组（MSC2×10^4）、C组（MSC4×10^4）、D组（MSC8×10^4），用^3H—TdR掺入法检测作用前后T细胞功能，FCM检测细胞免疫表型。结果显示，在终浓度为10μg／ml PHA作用下，T淋巴细胞的增殖能力随培养时间的延长而增强，48小时达高峰。FCM检测MSC细胞表型表明：CD44、CD105、CD29、FIK1表达阳性，不表达CD33、CD34、CD45、HLA—DR。随着MSC数量增加，与共培养前相比，T细胞的SI值逐渐降低（P〈0．05），但C组和D组间比较无差异（P〉0．05）。在低数量MSC作用下，CD3^＋CD4^＋表达低于对照组（P〈0．05），CD4^＋CD25^＋、CD4^＋CD152^＋高于对照组（P〈0．05）；C组和D组与对照组相比，CD3^＋CD4^＋表达明显降低（P〈0．01），CD3^＋CD8^＋、CD4^＋CD25^＋、CD4^＋CD152^＋明显增高（P〈0．01）。结论：丝裂原PHA可以使T细胞活化；骨髓MSC在体外可以使活化T细胞功能和细胞免疫表型发生改变，下调CD3^＋CD4^＋的表达，上调CD3^＋CD8^＋、CD4^＋CD25^＋、CD4^＋CD152^＋的表达。     

骨髓间充质干细胞通过上调CD8+CD28-T细胞抑制T细胞的增殖

本研究旨在探讨CD8^ CD28^-T细胞在间充质干细胞(MSC)抑制T细胞增殖中的作用。应用尼龙毛柱分离T淋巴细胞。再经CD8磁珠分选出CD8^ T淋巴细胞；用植物血凝素(PHA)刺激与或未与MSC共培养3天的CD8^ T细胞，应用MTT法测定T细胞的增殖；应用流式细胞术分别检测与或未与MSC共培养8天的CD8^ T细胞亚群的变化及用PHA刺激与或未与MSC共培养3天的CD8^ T细胞亚群的变化。结果表明，MSC抑制PHA刺激引起的CD8^ T细胞的增殖，且这种抑制作用是剂量依赖性的；流式细胞术结果显示，与未经MSC处理的CD8^ T细胞相比，MSC显著上调共培养8天的CD8^ T细胞中的CD8^ CD28^-亚群。及经PHA作用72小时后的CD8^ T细胞中的CD8^ CD28^-亚群。结论：MSC通过上调CD8^ CD28^-T细胞发挥抑制作用。     

单倍体相合骨髓移植后CD4~+CD25~+ T细胞免疫恢复的临床研究

本研究探讨单倍体相合骨髓移植后CD4+CD25+T细胞免疫恢复及其与移植物抗宿主病(GVHD)和复发的关系。采集27例单倍体相合骨髓移植患者在移植后不同时间内的外周血标本,用流式细胞仪检测分析CD4+CD25+T细胞百分比和绝对数,同时比较该细胞亚群恢复与GVHD和白血病复发的关系。结果表明:经过G-CSF动员后供者外周血中CD4+CD25+细胞百分比明显增高(p0.05)。移植后30天CD4+CD25+细胞恢复到正常水平的20%,但在移植后3个月内恢复颇为缓慢,直到180天才恢复到正常水平的50%。CD4+CD25+细胞恢复与急性GVHD的发生无关,但是在慢性GVHD组CD4+CD25+显著增高。移植后1年内未发现复发与CD4+CD25+细胞绝对计数有关。结论:在骨髓移植后给予抗CD25抗体预防GVHD的治疗模式下,CD4+CD25+细胞恢复与急性GVHD的发生无关,但与慢性GVHD的发生似乎有关,而与白血病的复发的关系不明确。     

中剂量rhG-CSF对正常供者外周血CD34+细胞动员效果

本研究探讨中等剂量600μg/d粒细胞集落刺激因子(GCSF)对正常供者CD34 细胞的动员效果及动员前后外周血单个核细胞中T细胞亚群的变化。对2002-2004年我科31例健康供者给予rhGCSF600μg/d,在动员的第4天开始采集外周血干细胞(PBSC),并检测动员前后白细胞总数、动员后的有核细胞(NC)数、单个核细胞(MNC)数、CD34 细胞数及粒巨噬细胞集落形成单位(CFUGM),同时观察动员及采集过程中的不良反应。对12例供者GCSF动员前后外周血单个核细胞中T细胞亚群的变化进行了观察。结果显示:600μg/d组与既往使用的300μg/d组相比,rhGCSF动员后的外周血细胞中NC、MNC和CD34 细胞及CFUGM显著增加(P<0.05),受者造血重建时间缩短(P<0.05),动员和采集过程中的不良反应发生率无明显上升(P>0.05),无严重不良反应发生。动员后CD3 细胞在PBMNC中的比例较动员前下降(15.05±3.3)%,(P<0.05)。动员前后CD4 /CD8 淋巴细胞的比值无明显变化(P>0.05)。结论:600μg/d的GCSF对正常供者的动员效果好,受者造血重建快,无严重不良反应发生。动员后PBMNC中CD3 细胞的下降及CD4 /CD8 淋巴细胞比值无明显变化,从而使得移植后急性GVHD的发生率无明显上升。     

CD8+CD28-T淋巴细胞在骨髓间充质干细胞治疗实验性自身免疫性脑脊髓炎小鼠中的免疫调

目的探讨CD8+CD28-T淋巴细胞在骨髓间充质干细胞(MSCs)治疗实验性自身免疫性脑脊髓炎小鼠中的免疫调节作用。 方法采用6~8周、体重16~20g的C57 BL/6雌性小鼠28只,MOG35-55作为免疫诱导剂,构建实验性自身免疫性小鼠模型(EAE)。将28只EAE小鼠随机分成4组：PBS治疗组、MSC低剂量治疗组（2×105个/只）、MSC中剂量治疗组（1×106个/只）、MSC高剂量治疗组（5×106个/只）,每组7只。各治疗组均于建模后第15天经尾静脉注射健康人来源的MSCs,对照组注射磷酸盐缓冲液（PBS）。 随后每日进行神经功能评分及测量体重,于治疗30d后处理动物,取材进行相关神经病理学及细胞免疫学分析。 结果不同剂量的MSCs均较PBS能有效地促进EAE小鼠神经功能的恢复（P<0.05）,且MSCs中剂量治疗更能显著促进EAE小鼠神经功能的恢复。各MSCs治疗组小鼠脾脏细胞中CD8+CD28-调节性T细胞的数量均较PBS治疗组的表达有所增加,但其分泌的IL-10水平较PBS治疗组差异无统计学意义（P>0.05）。 结论CD8+CD28-调节性T细胞可能不是MSCs促进EAE小鼠神经功能恢复的主要效应细胞,可能只是起到协同治疗作用。     

胚胎骨髓来源间充质干细胞对人Th17细胞的免疫调节

背景:众多研究表明间充质干细胞能发挥免疫调节功能,抑制T细胞增殖。目的:观察胚胎骨髓来源间充质干细胞对人Th17细胞的调节作用。方法:将人胚胎骨髓间充质干细胞与正常人外周血单个核细胞或CD4+T细胞以1∶10比例共培养4d,以单个核细胞或CD4+T细胞单独培养为对照。应用实时定量PCR检测细胞白细胞介素17mRNA表达,酶联免疫吸附试验检测细胞上清中白细胞介素17蛋白水平,流式细胞术检测Th17细胞数量。结果与结论:胚胎骨髓来源间充质干细胞与单个核细胞共培养组白细胞介素17mRNA表达水平明显高于单个核细胞组(P<0.01)。与此一致的是,胚胎骨髓来源间充质干细胞与单个核细胞或CD4+T细胞共培养组细胞上清中白细胞介素17蛋白水平明显高于单个核细胞组、CD4+T细胞组(P<0.05,P<0.01)。胚胎骨髓来源间充质干细胞与CD4+T细胞共培养组Th17细胞数量明显高于CD4+T细胞组(P<0.01),但胚胎骨髓来源间充质干细胞本身并不表达白细胞介素17。表明胚胎骨髓来源间充质干细胞可促进人Th17细胞增殖。     

T细胞与移植物抗宿主病的关系

T细胞在移植物抗宿主病（GVHD）的发生发展中起关键作用。T细胞包括主要组织相容性抗原（MHC）限制性T细胞和非MHC限制性T细胞两种类型，前者指CD4^ T细胞和CD8^ T细胞，后者包括NK－T细胞和γδT细胞。CD4^ T细胞和CD8^ T细胞与GVHD密切相关，NK－T细胞和γδT细胞主要介导移植物抗白血病（GVL）效应。     

骨髓间充质干细胞在CD4+CD25+调节性T细胞减轻大鼠移植物抗宿主反应中的作用

本研究探讨间充质干细胞(MSC)对GVHD的作用及其机制.建立大鼠同种异体骨髓移植模型,同时输入供者的T淋巴细胞诱导出移植物抗宿主反应,联合或不联合移植供体来源的MSC,观察受鼠的GVHD的发生情况;利用双荧光标记抗体标记受鼠脾脏和胸腺单个淋巴细胞,通过流式细胞术分析CD4+CD25+调节性T细胞亚群比例的变化,分析MSC的作用机制.结果显示实验组的GVHD的发生程度减轻,存活率提高,而CD4/CD8比值在GVHD组出现不同程度的减少,CD4+CD25+调节性T细胞在实验组中的脾淋巴细胞和胸腺淋巴细胞的比例分别为31.55±7.58%、93.20±2.69%,在GVHD组中的比例分别为20.90±1.90%、57.17±6.79%,实验组中CD4+CD25+调节性T细胞比例比GVHD组中增多,具有显著性差异.结论MSC能有效抑制HSC移植后致死性GVHD的发生,提高生存率,同时MSC可能通过作用于体内调节性T淋巴细胞而间接发挥了抑制GVHD的作用.     

脐血间充质干细胞的生物学特征及其对造血干/祖细胞体外扩增的支持作用

目的探讨脐血间充质干细胞(MSC)的生物学特征及其对造血干/祖细胞体外扩增的支持作用。方法用液体培养法分离脐血贴壁细胞,采用ELISA方法检测贴壁细胞条件培养液中细胞因子的表达;用流式细胞术分析其免疫表型特征;在成软骨细胞诱导培养条件下诱导细胞分化,并用RTPCR方法检测分化后细胞原胶原Ⅱ型基因的表达。采用分阶段共培养方法观察脐血贴壁细胞对CD34+细胞体外扩增的支持作用。结果脐血单个核细胞纤维样细胞集落形成率为(3.5±0.7)/106。脐血MSC体外至少可以扩增15代。没有分化的脐血MSC表型为CD13、CD29、CD90、CD105、CD166、SH2、SH3和SH4阳性,CD45、CD34和CD14阴性;脐血MSC培养上清中干细胞因子、IL6和肿瘤坏死因子α检测阳性。在成软骨细胞诱导培养基培养条件下,脐血MSC原胶原Ⅱ型基因mRNA表达阳性。脐血MSC与CD34+细胞共掊养14d,CD34+细胞扩增率高于未共培养组4倍。结论脐血MSC具有类似于成体骨髓MSC的特征,对造血干细胞增殖有明显的支持作用。     

胚胎骨髓来源间充质干细胞对人Th17细胞的免疫调节

背景：众多研究表明间充质干细胞能发挥免疫调节功能,抑制T细胞增殖。目的：观察胚胎骨髓来源间充质干细胞对人Th17细胞的调节作用。方法：将人胚胎骨髓间充质干细胞与正常人外周血单个核细胞或CD4＋T细胞以1∶10比例共培养4d,以单个核细胞或CD4＋T细胞单独培养为对照。应用实时定量PCR检测细胞白细胞介素17mRNA表达,酶联免疫吸附试验检测细胞上清中白细胞介素17蛋白水平,流式细胞术检测Th17细胞数量。结果与结论：胚胎骨髓来源间充质干细胞与单个核细胞共培养组白细胞介素17mRNA表达水平明显高于单个核细胞组（P〈0.01）。与此一致的是,胚胎骨髓来源间充质干细胞与单个核细胞或CD4＋T细胞共培养组细胞上清中白细胞介素17蛋白水平明显高于单个核细胞组、CD4＋T细胞组（P〈0.05,P〈0.01）。胚胎骨髓来源间充质干细胞与CD4＋T细胞共培养组Th17细胞数量明显高于CD4＋T细胞组（P〈0.01）,但胚胎骨髓来源间充质干细胞本身并不表达白细胞介素17。表明胚胎骨髓来源间充质干细胞可促进人Th17细胞增殖。     

骨髓间充质干细胞对T细胞亚群的影响

本研究探讨人骨髓间充质干细胞对植物血凝素（phytohemagglutinin，PHA）刺激引起的T细胞增殖的影响和可能机制。应用CD3^＋磁珠分选T淋巴细胞，从骨髓分离出的间充质干细胞经照射后与T细胞共培养过夜，经PHA（5μg/ml）作用72小时后，应用BrdU检测T细胞的增殖情况，应用流式细胞术检测T细胞的Annexinv／PI的水平。对未经照射的骨髓间充质干细胞处理的T细胞，用PHA处理72小时后收集T细胞，应用流式细胞术检测CD4，CD8以及CD4和CD25的表达，同时设立未经PHA处理的T细胞与照射的骨髓间充质干细胞共培养组，及未经骨髓间充质干细胞处理的T细胞组。结果表明：骨髓间充质干细胞抑制PHA引起的T细胞的增殖，但不诱导T细胞凋亡。与未处理组相比，骨髓间充质干细胞处理组中T细胞的CD4^＋CD8^＋细胞比例无显著变化；但在PHA作用下，骨髓间充质干细胞处理组中T细胞的CD4^＋亚群显著增加，且呈剂量依赖性，但CD4^＋CD25^＋细胞亚群显著减少。结论：骨髓间充质干细胞抑制PHA刺激所引起的T细胞增殖，对CD8^＋T细胞的抑制作用更强．推测其可能的机制与CD4^＋调节性T细胞的参与有关．但与CD25^＋T调节细胞无明显关系。     

骨髓间充质干细胞对体外分化的原态(naive)T细胞分泌细胞因子的影响

目的观察骨髓间充质干细胞(MSC)对原态(naive)T细胞的反应,探讨其免疫调节机制。方法传代培养3代的MSC经60Co照射后与脐血CD34+细胞分化产生的原态T细胞共孵育1周,用ELISA方法检测培养上清细胞因子的变化。结果孵育7d后,与MSC共孵育后T细胞数量明显增加,为(9.15±0.68)×105/孔,而原态T细胞单独培养组为(4.87±1.33)×105/孔(P<0.05);ELISA检测共孵育组IFNγ分泌减少为(1.147±0.181)pg/ml,而原态T细胞单独培养组为(4.897±0.189)pg/ml、共孵育组IL2分泌增加为(16.141±2.729)pg/ml,而原态T细胞单独培养组为(2.551±0.460)pg/ml,未检测到IL4和IL10。结论MSC有一定的抗原性,与MSC共孵育导致原态T淋巴细胞增殖,MSC可能通过直接或间接抑制T细胞产生IFN-γ发挥免疫抑制作用。为进一步阐明MSC免疫调节机制提出新的线索。     

体外阻断CD40-CD40L共刺激途径减轻小鼠异基因骨髓移植中移植物抗宿主病的研究

目的在异基因骨髓移植移植物抗宿主病(GVHD)小鼠模型中,观察抗CD40L单克隆抗体(单抗)体外预处理供鼠T细胞输注,观察其减轻GVHD的作用并探讨其作用机制.方法供鼠(C57BL/6H-2b)脾T细胞作为反应细胞,受鼠(BALB/cH-2d)脾细胞作为刺激细胞,分别加抗CD40L单抗或不加单抗进行混合培养,培养第5天的细胞作为经体外诱导后的脾T淋巴细胞,分别混合供鼠骨髓细胞后移植给接受8.0 Gy全身照射预处理的受鼠.比较受鼠GVHD发生和造血重建.在移植后不同时间点采用流式细胞仪检测受鼠脾细胞中T细胞表型的改变,用ELISA法检测外周血血清中Th1和Th2类细胞因子的水平.结果移植后对照组受鼠均于25 d内死于GVHD,实验组GVHD的发生率为20%,与对照组小鼠相比,存活率和存活时间明显增高和延长(P<0.01);存活的实验组小鼠(8只)第40天时骨髓细胞中H-2Db阳性细胞为(93.54±2.32)%.实验组小鼠CD3+CD4+、CD3+CD8+、CD4+CD25+、CD4+CD69+、CD8+CD25+、CD4+CD40L+和CD8+CD69+T细胞比例明显低于对照组(P<0.05),CD8+CD40L+和CD4+CD45RA+T细胞比例在两组中变化差异无显著性(P>0.05).实验组受鼠血清中细胞因子水平明显低于对照组(P<0.05).结论应用抗CD40L单抗体外孵育的脾T细胞与骨髓细胞混合移植,可明显减少GVHD的发生率,且不影响供鼠造血干细胞的植入,CD4+和CD8+T细胞对异体抗原发生耐受,耐受化T 细胞的活化障碍发生于活化的早期和成熟阶段,同时抑制了Th1和Th2类细胞因子分泌,为抗CD40L单抗应用于临床移植预防GVHD提供了实验依据.     

复制缺陷性慢病毒介导的双自杀基因在小鼠异基因骨髓移植中的应用

目的　探讨复制缺陷性慢病毒介导的胞嘧啶脱氨酶 (cytosinedeaminase,CD)和胸苷激酶(thymidinekinase ,TK)双自杀基因在异基因骨髓移植 (allo BMT)时控制移植物抗宿主病 (GVHD)的可行性及其有效性。方法　将携带双自杀基因的复制缺陷性慢病毒通过脂质体转染入T细胞中。将经6 0　Coγ射线照射后的荷瘤小鼠分组进行骨髓移植 ,观察骨髓移植后荷瘤鼠CFU S、CFU GM、Y染色体整合、T细胞中CD TK基因整合、生存率和生存期、体重及病理组织学等指标。结果　复制缺陷性慢病毒载体可将双自杀基因高效稳定转染入T细胞。在allo BMT中 ,除空白对照组外 ,各组小鼠的CFU S的数目和CFU GM产率差异无显著性 ,且均有Y染色体整合。使用前体药物治疗的小鼠未发生明显的GVHD ,其生存率和生存期明显高于其它各组 ;双自杀基因的效果优于单自杀基因。结论　复制缺陷性慢病毒介导的双自杀基因系统可在不影响移植物存活的情况下有效控制GVHD的发生 ,显著提高allo BMT的成功率。     

骨髓间充质干细胞抑制异体T淋巴细胞反应的实验研究

目的了解骨髓间充质干细胞(MSC)能否诱导异体T淋巴细胞反应性下降,探讨防治异基因造血干细胞移植中移植物抗宿主病的途径。方法骨髓来源的MSC经60Co照射后与异体T淋巴细胞共培养,用3H-TdR掺入的方法测定共培养前后T淋巴细胞增殖状态及对异体细胞和非特异性分裂原刀豆素A(ConA)的反应性变化。结果MSC与异体T淋巴细胞共培养后,并不刺激T淋巴细胞的增殖;MSC作为刺激细胞与异体T淋巴细胞的首次及二次接触均不引起T淋巴细胞活化。单独T淋巴细胞的放射性核素每分钟闪烁计数(CPM)值为27529±969,首次接触与二次接触的CPM值分别为9126±654及13260±874。混合淋巴细胞反应结果表明,与MSC共孵育后的异体T淋巴细胞对MSC同源淋巴细胞反应性下降,共孵育前的CPM值为45876±5285,共孵育后的CPM值为9850±1618,ConA刺激的细胞增殖活性也显著减低。结论骨髓MSC在体外可使异体T淋巴细胞对异体抗原的反应性减低,这种作用与其低免疫原性有关。     

间充质干细胞分泌TGF-β1抑制异体T细胞反应性

为探讨骨髓间充质干细胞（MSC）诱导异体T细胞反应性下降的机制。应用流式细胞术检测了异体T细胞与骨髓间充质干细胞共培养前后CD4，CD8，CD25和CD28等的变化，同时应用RT-PCR测定MSC是否表达IL-4，IFN-γ和TGF-β1等细胞因子，并用ELISA的方法验证培养上清中蛋白的存在。结果显示，异体T细胞与MSC共培养后，CD8^ 细胞增多，CD25^ 细胞减少，RT-PCR检测结果证明MSC高表达TGF-β1基因，但不表达IL-4和IFN-γ基因，ELISA证实MSC培养上清存在TGF-β1蛋白，其72小时分泌量约为1ng/ml。结论：骨髓MSC在体外可使异体T细胞对异体抗原的反应性减低，这种作用体现在细胞亚群的改变与MSC分泌TGF-β1有关，这一研究结果为预防HLA不相同合骨髓移植中GVHD的发生提出一条新的思路。     

人骨髓间充质干细胞对T淋巴细胞的免疫调节作用

为了探讨人骨髓间充质干细胞（mesenchymal stem cell，MSC）体外对T淋巴细胞的免疫调节作用，从人骨髓液中分离培养MSC，通过细胞形态、免疫组织化学及流式细胞术检测其表面标记进行鉴定；将植物血凝素（PHA）及从人脐血中分离培养的树突状细胞（dendritic cell，DC）作为刺激因素，经磁珠分选的人CD2^＋ T淋巴细胞作为反应细胞．用^3H—TdR标记β液体闪烁计数仪检测与MSC共培养前后T淋巴细胞增殖能力的变化；用流式细胞术检测与MSC共培养10天后的CD2^＋ T细胞内各亚群Th1、Th2、Tc1、Tc2比例的变化。结果表明：MSC能明显抑制由DC诱导的T淋巴细胞增殖（P=0．004），同时MSC抑制由PHA引起的T细胞增殖，但不具有显著性差异（P=0．26），MSC培养上清液单独并不具备抑制T细胞增殖的作用，与MSC共培养后的T细胞亚群中，Th2及Tc2亚群含量较共培养前明显增加（P〈0．05）。结论：MSC对由DC和PHA诱导的淋巴细胞增殖反应均具有抑制作用，并且这种作用可能与细胞间相互作用及诱导T细胞亚群的改变有关。