Fas基因在rhG-CSF诱导白血病细胞凋亡过程中的作用

目的探讨了Ｆａｓ基因是否参与重组人粒细胞集落刺激因子（ｒｈＧＣＳＦ）对白血病细胞的诱导凋亡过程。方法利用脂质体（ＤＯＴＡＰ）介导的基因转染技术将Ｆａｓ基因转入ＨＬ６０细胞中,并经原位杂交、Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ及流式细胞术（ＦＣＭ）证实已成功建立了Ｆａｓ高表达的ＨＬ６０细胞株,用ＦＣＭ对Ｆａｓ基因在ｒｈＧＣＳＦ诱导白血病细胞凋亡过程中的作用进行了探讨。结果相同浓度的ｒｈＧＣＳＦ作用相同时间后转染的ＨＬ６０细胞凋亡率较未转染的ＨＬ６０细胞凋亡率明显增加,且随ｒｈＧＣＳＦ作用时间延长,Ｆａｓ在ＨＬ６０细胞中的表达逐渐增加。结论Ｆａｓ基因是凋亡诱导基因,ｒｈＧＣＳＦ诱导白血病细胞凋亡依赖Ｆａｓ径路传递凋亡信号。     

中药癌痛克对人肝癌细胞HepG2增殖、凋亡及Rb基因表达的影响

目的:通过观察不同浓度癌痛克对肝癌细胞株HepG2增殖及凋亡的作用,以及在相应状态下细胞内Rb基因表达量的改变,探讨中药癌痛克抗肝癌的可能作用机制。方法:实验于2005-09/2006-03在广州医学院中心实验室完成。取对数生长期的HepG2细胞,使细胞静止于G0/G1期。随机分为癌痛克2,10,50mg/L组和对照组,癌痛克2,10,50mg/L组分别加入对应浓度癌痛克(购自河南省肿瘤研究所,由金蝎、土元、九香虫、大黄、人参、灵芝、黄芪等纯中药组成的粉状制剂,功能:消癌肿、消癌痛、消积水、升白排毒),对照组不加药物,每组设4个复孔。MTT法检测各组细胞24,48,72h增殖率,细胞增殖率=[(A570癌痛克组-A570对照组)/A570对照组]×100%;以流式细胞术检测各组细胞24,48,72h凋亡率;RT-PCR方法检测各组细胞24,48,72h细胞内Rb基因mRNA表达量。结果:①2～50mg/L癌痛克具有明显的增殖抑制作用,癌痛克2,10,50mg/L组在24,48,72h与对照组比较,差异有显著性意义(P<0.05);3组各时点两两之间比较差异有显著性意义(P<0.05);同组各时点之间比较差异有显著性意义(P<0.05)。②2～50mg/L癌痛克组可诱导HepG2细胞凋亡,相同作用时间癌痛克2,10,50mg/L组与对照组比较差异有显著性意义(P<0.001);同一时点各组比较差异有显著性意义(P<0.05);同组不同作用时间点比较差异有显著性意义(P<0.001)。③2～50mg/L癌痛克可上调Rb基因的表达,各浓度组在各时点与对照组比较,差异均有显著性意义(P<0.05);24,48,72h癌痛克2,10,50mg/L组之间比较差异无显著性意义(P>0.05);3组各时点比较差异有显著性意义(P<0.05)。结论:中药癌痛克可通过抑制HepG2细胞增殖或诱导其凋亡,而发挥抗肝癌作用;且其诱导细胞凋亡的机制之一可能为通过增加Rb基因的表达而实现。     

人参皂苷Rh2诱导人肝癌HepG2细胞凋亡的研究

目的研究人参皂苷Rh2（G-Rh2）对肝癌HepG2细胞增殖抑制和凋亡诱导的作用,并探讨其作用机制。方法用终浓度为5、10、20 mg/L的G-Rh2作用于HepG2细胞,于24 h、48 h及72 h后采用MTT法检测细胞增殖抑制率;72 h后收集各组肝癌HepG2细胞,流式细胞术检测细胞周期及凋亡率;RT-PCR检测survivin mRNA表达。结果 MTT法检测显示,G-Rh2对肝癌HepG2细胞有增殖抑制作用,并存在浓度和时间依赖关系;流式细胞仪检测显示G-Rh2作用后,细胞被阻滞于G0/G1期,随药物质量浓度的增加,细胞凋亡率逐渐增加。RT-PCR结果显示,G-Rh2下调肝癌HepG2细胞survivin mRNA表达。结论 G-Rh2在体外对肝癌HepG2细胞有明显的增殖抑制和凋亡诱导作用,初步推断G-Rh2诱发肝癌细胞凋亡的作用与其对survivin基因表达的抑制有关。     

细胞凋亡因子Fas配体

Fas和Fas配体(FasL)是已认识到的一对诱导细胞凋亡的膜蛋白分子,它们之间构成一条独特的细胞凋亡通路。本文对FasL的分子生物学特性和生理功能及其在疾病发生中的作用作一综述。     

Fas基因与细胞凋亡

Fas抗原和Fas配体是细胞表面的两种跨膜蛋白;Fas介导的细胞凋亡对维持机体的正常免疫功能和在某些疾病的发生发展中有十分重要的作用.     

肝癌患者外周血单个核细胞膜表面Fas配体表达及意义

目的检测肝细胞癌患者外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cell,PBMC)膜表面Fas配体(Fas ligand,FasL)水平,并探讨其在肝细胞癌发生机制中的作用及意义。方法用免疫组化法分别检测了31例肝细胞癌患者及20例正常人PBMC细胞膜表面FasL表达。结果肝细胞癌患者PBMC细胞膜表面FasL阳性细胞百分率为64.0±7.8%,明显高于正常对照组(40.7±8.6%)(t=4.634,p<0.01)。肝细胞癌患者FasL阳性细胞百分率与CD8+T淋巴细胞数量之间存在正相关关系(r=0.547,p<0.05),而与CD3+、CD4+T淋巴细胞之间无相关性。结论肝细胞癌患者PBMC膜表面FasL表达增强有利于肿瘤细胞的清除。     

bcl-2基因转染阻断Fas介导的Jurkat细胞凋亡

目的：通过ｂｃｌ２阻断Ｆａｓ介导的细胞凋亡了解ｂｃｌ２基因在淋巴瘤癌变过程中逃避机体免疫监控的作用机制。方法：应用基因重组技术重组ｐＬＸＳＮｂｃｌ２，采用电穿孔法将其与空载体分别转染包装细胞系ＰＡ３１７，将阳性克隆病毒上清感染人Ｔ淋巴瘤细胞株Ｊｕｒｋａｔ，用Ｇ４１８筛选，其阳性克隆进行免疫组化检测，应用抗Ｆａｓ抗体诱导细胞凋亡来模拟细胞毒Ｔ细胞的杀伤机制，观察ｂｃｌ２在淋巴瘤逃避免疫机制中的作用。结果：转染人ｂｃｌ２基因的Ｊｕｒｋａｔ（Ｊｕｒｋａｔｂｃｌ２）细胞较对照Ｊｕｒｋａｔ及转染空载体Ｊｕｒｋａｔ（Ｊｕｒｋａｔｎｅｏ）细胞，ｂｃｌ２表达量明显增加，而Ｆａｓ基因表达量无明显变化。其Ｊｕｒｋａｔｂｃｌ２能明显耐受抗Ｆａｓ抗体诱导的细胞凋亡。结论：人ｂｃｌ２基因在淋巴瘤中过量表达，能部分阻断抗Ｆａｓ抗体诱导的细胞凋亡，ｂｃｌ２基因过量表达可能是淋巴瘤癌变过程中逃脱机体免疫监控的机制之一。     

转染mFas配体的COS-7细胞诱导Fas+淋巴瘤细胞系(Yac-1)凋亡

本研究探讨通过Fas配体(Fas ligand,FasL)-Fas途径进行免疫治疗淋巴瘤的可能性。常规转化pBillneo-mFasL至大肠杆菌DH5α,经扩增、质粒抽提和纯化后,进行限制性内切酶酶切、mFasL基因PCR及其产物DNA测序,以鉴定pBillneo-mFasL内mFasL基因一级结构及插入方向;用脂质体法转染 pBillneo-mFasL至猴肾COS-7细胞,G418选择培养后,Western印迹分析外源性mFasL cDNA基因表达水平,将高表达mFasL的COS-7细胞与Fas~+小鼠淋巴瘤细胞系Yac-1以不同比例混合培养,5小时后收集悬浮的Yac-1细胞,用膜联蛋白(annexin)V/PI标记后,借助FCM观察细胞调亡率。结果表明,质粒pBillneo-mFasL的EcoRI酶切获得920 bp和7227 bp产物,Hind Ⅲ酶切获得1293 bp和6807 bp产物,初步证实插入mFasL cDNA片段与理论预计大小一致,并系正向插入;PCR扩增出自起始密码子(ATG)至终止密码子(TAA)后+36 bp的mFasL cDNA全长890 bp序列,DNA测序结果与基因库已知序列完全一致;pBillneo-mFasL转染COS-7细胞,并经G418选择培养后,Western印迹检测到明显mFasL蛋白质表达;当用这种高表达mFasL蛋白质的COS 7细胞与Fas~+ Yac-1细胞以1:1,5:1和10:1混合培养5小时后,用annexin V/PI标记悬浮Yac-1,结果后者调亡率分别为(22±4.8)％,(32.18±7.8)％和(51.8±5.4)％,与     

银耳多糖诱导肝癌HepG-2细胞凋亡的研究

目的:研究银耳多糖(Tremdla Polysacchadd,TP)对肝癌HepG-2细胞体外增殖的影响.方法:采用MTT法检测TP对HepG-2细胞的抑制作用,改良苯酚品红染色观察细胞形态的改变,梯状DNA电泳检测细胞凋亡,半定量RT-PCR检测bcl-2和survivin的表达.结果:TP对HepG-2细胞具有明显的抑制作用且呈剂量-时间依赖性;细胞有明显染色质凝集、凋亡小体等现象;电泳出现梯状DNA现象;抗凋亡基因bcl-2和survivin表达下调.结论:TP可诱导HepG-2细胞凋亡,而抗凋亡基因bcl-2和survivin下调可能是其诱导凋亡的机制之一.     

三磷酸肌醇和bax基因表达变化在genistein抑制裸鼠肝癌增长中的作用

目的:探讨三磷酸肌醇(IP3)和bax基因表达变化在genistein治疗裸鼠移植人肝癌中的作用。方法:以裸鼠移植人肝癌为对照,对照组腹腔注入含0.04% DMSO的RPMI 1640培养基0.05mL/g,Genistein治疗组腹腔注入genistein 1mg/(kg·d),3周后观察肝癌增长情况,并应用同位素试剂盒检测肝癌组织IP3含量,RT-PCR分析癌组织bax mRNA表达,Western blotting分析肝癌组织bax蛋白表达。结果:Genistein治疗组肝癌体积和重量均显著低于对照组[体积(12.6±11.6)mm3vs(52.3±26.5)mm3,重量(42.7±27.8)mgvs(91.3±31.4)mg),P<0.01],IP3含量显著低于对照组[(13.4±1.4)pmol/mg proteinvs(35.3±6.6)pmol/mg protein,P<0.01],bax mRNA表达显著高于对照组[灰度与面积之积的相对强度(RI)0.88±0.21vs0.56±0.15,P<0.05],bax蛋白表达显著高于对照组[RI2.86±0.80vs1.37±0.48,P<0.05]。结论:Genistein能减少IP3生成,上调肝癌组织bax基因表达,抑制裸鼠移植人肝癌增长。     

Tamoxifen inhibits proliferation and induces apoptosis in human hepatocellular carcinoma cell line HepG2 via down-regulation of survivin expression

Tamoxifen has been used in patients with hepatocellular carcinoma (HCC). However, its inhibitory mechanism remains unknown. In current study, we evaluated the effect of tamoxifen on the estrogen receptor-α-negative HCC cell proliferation, apoptosis and expression of survivin which had been known to play an important role in promotion of cellular proliferation as well as inhibition of apoptosis in cancer cells. HepG2 cells were incubated with tamoxifen (0.1, 1, 10, or 20 μM) for up to 72 h. Cell proliferation was assessed, flow cytometric analysis was performed, and survivin expression was detected. Our results are showed as follows. Ten or 20 μM tamoxifen induced a reduction of cell proliferation. Basically reduction of proliferation was related to an increase in the fraction of G0/1-phase. When tamoxifen was administrated at higher concentration (20 μM), the increase of the relative apoptosis appeared with a delay, augmenting the effect of tamoxifen on cell proliferation. When apoptosis was induced, a significant depression of survivin expression preceded. In conclusion, the tamoxifen decreasing cell proliferation and induction of apoptosis of HepG2 cells depends on drug concentration, which is due to cytostatic and cytocide effects, the latter may be mediated by a down-regulation of survivin expression.     

TIGAR基因真核表达载体的构建及在HepG_2细胞中的作用初探

目的:构建TP53诱导的糖酵解和凋亡调控子(TIGAR)全长cDNA的真核表达载体pEGFP-TIGAR,观察TIGAR在人肝细胞HepG2中的作用。方法:RT-PCR技术扩增获得TIGAR全长cDNA,将扩增的产物克隆,经酶切、DNA测序鉴定正确,构成pEGFP-TIGAR的真核表达重组质粒。利用脂质体将重组质粒转染入HepG2细胞,流式细胞仪和TUNEL法检测细胞凋亡、流式细胞仪检测细胞周期、MIB-1(Ki-67抗原测定)法检测细胞增殖、实时荧光PCR检测mRNA表达和Western-blot检测蛋白质的表达。结果:构建完成的真核表达重组质粒pEGFP-TIGAR,经DNA测序与GenBank中的人TIGARcDNA序列一致。荧光显微镜观察到转染重组质粒的细胞中有绿色荧光蛋白的表达。检测结果显示,转染pEGFP-TIGAR质粒的HepG2晚期凋亡细胞明显减少(P<0.05);S期细胞百分数则明显增加(P<0.05),增殖能力明显增高(P<0.05)。结论:本实验成功构建了pEGFP-TIGAR真核表达质粒,过表达的TIGAR可降低HepG2细胞发生晚期凋亡和促进细胞增殖,为进一步研究TIGAR基因在肿瘤细胞中作用提供了基础。     

Fas、Bcl—2在肾癌中表达的研究

目的：检测Fas,Bcl-2在肾癌中的表达,分析其在肾癌发生发展中的作用。方法：采用免疫组化法,结果：1．肾癌Fas比正常肾组织阳性表达率低,Bcl-2比正常肾组织高（P＜0．05）,2．Fas,Bcl-2表达在肾癌的细胞学分类,病理分级,临床分期无显著性差异（P＞0．05）,3．肾癌Fas表达与Bcl-2负相关（P＜0．05,r=-0.322),4.单因素生存分析Fas,Bcl-2表达及肾癌的各细胞学分类生存率无差异（P＞0．05）,肾癌病理分级G1＋G2组比G3＋G4组生存率高（P＜0．05）,临床分期S1＋S2组比S3＋S4组高（P＜0．05）,Cox回归多因素生存分析只发现肾癌病理分级能单儿作为反映肾癌预后因素的指标（P＜0．05）。结论：Fas,Bcl-2在肾癌的发生中并不能单独起主导作用。不能独立作为反映肾癌预后的指标,它们可能只是参与肾癌发生多种因素之一。     

CyclinDl在肝细胞癌中的表达及与肝细胞癌患者预后的关系

目的探讨CyclinDl在肝细胞癌中的表达及与肝细胞癌患者预后的关系。方法取133例肝细胞癌患者的癌组织（HCCs）及癌旁组织（PTLTs）病理切片,用免疫组化染色技术分析CyclinDl的表达,统计分析CyclinDl表达强度与肝细胞癌患者临床病理因素之间的关系,并以Kaplan－Meier生存曲线及Log－rank法检测不同CyclinDl表达组的生存差异。最后以单因素及多因素Cox回归模型分析影响肝细胞癌患者预后的独立危险因素。结果免疫组化染色结果发现51例肝癌患者的癌组织中CyclinDl表达阳性,表达率为38．3％（51／133）,而在癌旁组织中仅有4例CyclinDl表达阳性,表达率为3％（4／133）,肝癌组织中Cy－clinDl表达率显著高于癌旁组织（P=0．01）。Mann-WhitneyU检验发现肝癌组织中CyclinDl的高表达与AFP水平（P=0．006）之间呈正相关,且有统计学意义。而CyclinDl表达与性别（P=0．394）、年龄（P=0．232）、肿瘤大小（P=0．842）、肿瘤数目（P=0．479）、包膜（P=0．085）、脉管侵犯（P=0．331）、淋巴结转移（P=0．168）和Edmondson-Steiner病理分级（P=0．521）不相关;Kaplan-Meier生存曲线发现CyclinDl表达强度与患者生存相关,即表达强者预后差（P=0．001）;单因素及多因素Cox回归分析发现肿瘤数目、脉管侵犯、CyclinDl表达是影响HCC患者预后的独立危险因素（P值分别为0．003,0．010和0．017）。结论CyelinDl在肝细胞癌中表达升高,其表达与肝细胞癌患者预后呈负相关,并且是肝细胞肝癌预后的独立危险因素。     

肝细胞癌循环肿瘤细胞的检测进展

肝细胞癌(HCC)是我国发病率及死亡率都很高的恶性肿瘤之一,其术后复发转移是影响患者预后的重要因素。循环肿瘤细胞(CTCs)作为一种可以代表原发肿瘤的"液态活检标本",有助于实时、无创性地监测疾病进程。CTCs的检测有助于HCC的早期诊断、复发与转移的监测、预后的预测以及疗效的评估,而且可能成为临床分子检测、分析转移机制及优化治疗方法的一种重要手段。本文就近年来CTCs的检测及临床研究进行综述。     

人脐带源间充质干细胞条件培养液对人肝癌HepG2细胞生长的影响

目的 探讨人脐带源间充质干细胞(HUC-MSC)条件培养液(CM)对人肝癌HepG2细胞生长的影响.方法 选择2011年2月至2014年1月于中国人民解放军第105医院妇产科分娩的35例足月妊娠剖宫产健康胎儿脐带为研究对象,取其用于分离、培养并扩增HUC-MSC.传代扩增至第3代HUC-MSC融合达80％时,更换培养液,继续培养24 h后收集上清液,即为HUC-MSC-CM备用.将对数生长期的人肝癌HepG2细胞按照随机数字表法随机分成相等的3份,分别于含50％,20％及不含HUC-MSC-CM的培养中培养,并分别纳入高含量组、低含量组和空白对照组.采用倒置显微镜观察人肝癌HepG2细胞生长状态,采用3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴盐(MTT)法和细胞划痕愈合实验分别检测3组人肝癌HepG2细胞增殖和迁移情况,并采用流式细胞术(FCM)法检测各组细胞的细胞周期变化情况.本研究遵循的程序符合中国人民解放军第105医院人体试验委员会所制定的伦理学标准,得到该委员会批准,脐带获取前,均征得孕妇知情同意,并与之签署临床研究知情同意书.结果 ①所分离的原代HUC-MSC培养至第3代后,细胞形态开始比较均一.②MTT法检测结果显示,人肝癌HepG2细胞培养24,48和72 h时,3组相对吸光度(A)值比较,差异均有统计学意义(F=21.330,6.223,9.345;P=0.004,0.032,0.027),且在这3个时间点,高含量组和低含量组相对A值均显著高于空白对照组,差异均有统计学意义(P＜0.05),高含量组相对A值亦显著高于低含量组,差异亦均有统计学意义(P＜0.05).③划痕愈合实验结果显示,3组人肝癌HepG2细胞过河时间比较,差异有统计学意义(F=12.860,P=0.025),且高含量组人肝癌HepG2细胞过河时间短于低含量组和空白对照组,差异均有统计学意义(P＜0.05),低浓度组人肝癌HePG2细胞过河时间亦短于对照组,差异亦有统计学意义(P＜0.05).④FCM法检测人肝癌HepG2细胞周期结果显示,3组G0/G1期和S期人肝癌HepG2细胞比例比较,差异均有统计学意义(F=30.600,30.590;P＜0.05).且与空白对照组相比,高含量组和低含量组人肝癌HepG2细胞G0/G1期细胞比例显著降低,S期细胞比例显著增加,差异均有统计学意义(P＜0.01);且高含量组G0/G1期细胞比例比低含量组下降更显著,而S期细胞比例显著增加,差异均有统计学意义(P＜0.05).结论 HUC-MSC-CM可促进入肝癌HepG2细胞增殖和迁移,并可促进人肝癌HepG2细胞周期G1/S转换.     

Effects of smoking on activation markers, Fas expression and apoptosis of peripheral blood lymphocytes

BACKGROUND: Smoking influences numbers and function of peripheral blood lymphocytes (PBL) by a process that is badly understood. We conducted this study to evaluate whether the immune impairment of smoking might be related to changes in the expression or functionality of Fas, a cell surface molecule that plays a central role in immune homeostasis and cytotoxic activity. METHODS: PBL from 10 smoking and 10 nonsmoking healthy volunteers were isolated. Flow cytometry was performed to measure the state of activation, Fas expression and apoptosis of PBL. Functionality of Fas was tested by assessing apoptosis after incubation of isolated lymphocytes with agonistic anti-Fas antibodies in four smoking and four nonsmoking individuals. RESULTS: Smoking was associated with an increase in the percentage of Fas-expressing CD4+ T and B lymphocytes. A decrease in the percentage of activated (CD38+) B cells was observed. In vitro Fas-induced apoptosis did not appear different between smokers and nonsmokers. No differences in the percentages of circulating apoptotic lymphocytes could be demonstrated between smoking and nonsmoking individuals. Conclusion Smoking is associated with increased Fas expression on PBL in general, and on B cells in particular. This might render these cells more susceptible for apoptosis. As Fas is functionally intact this may also explain the reduced percentage of activated (CD38+) B cells found in smoking individuals. The latter may contribute to the reduced humoral immune response observed in smokers.     

柴胡皂甙d上调HL-60细胞糖皮质激素受体mRNA并诱导细胞凋亡

目的　观察柴胡皂甙d(SSd)对HL 6 0细胞糖皮质激素受体 (GR)mRNA表达的调节作用以及对细胞凋亡的影响。方法　选用从柴胡中提取的单体成分SSd ,以3 H 胸腺嘧啶掺入法观察SSd对细胞生长的抑制作用 ,DNA凝胶电泳及流式细胞术分析细胞凋亡 ,用Northernblot分析GRmRNA的改变。结果　经SSd作用后 ,HL 6 0细胞3 H 胸腺嘧啶掺入率明显降低 ,呈时间和剂量依赖关系 ,10 μg/mlSSd处理 48小时作用最明显 ,6 0小时时出现典型的DNA片段梯形带 ,流式细胞仪分析细胞阻滞于G1期并出现凋亡峰 ;GRmRNA表达增加。结论　SSd可上调HL 6 0细胞GRmRNA表达并诱导细胞凋亡。