稳定表达膜结合型CD40配体CHO细胞系的建立和鉴定

目的建立稳定表达膜结合型CD40配体（CD40L）的CHO细胞系。方法将编码膜结合型CD40L的重组质粒pcDNA3．1-fCD40L用Bg1 Ⅱ和Xho I酶进行双酶切鉴定。电穿孔法向CHO细胞转染该重组质粒，G418筛选抗性克隆，有限稀释法获取单克隆阳性细胞后扩大培养，获得2个整合了fCD40L基因的CHO细胞（CHO-fCD40L）克隆。用RT-PCR、流式细胞仪分别从RNA和蛋白质水平对2个CHO-fCD40L克隆细胞中膜结合型CD40L的表达进行检测；ELISA法检测2个CHO-fCD40L克隆细胞培养上清液中可溶性CD40L（sCD40L）的含量。结果重组质粒pcDNA3．1-fCD40L经双酶切和电泳检测到符合预期大小的基因片段。该重组质粒转染CHO细胞后经克隆化培养获得2个CHO-fCD40L克隆，分别命名为C10、E11。RT-PCR检测显示C10、E11细胞中有膜结合型CD40L mRNA的转录；流式细胞仪检测显示C10、E11细胞表达CD40L蛋白达90％以上；ELISA法检测到显示C10、E11细胞培养液上清中有sCD40L蛋白表达。结论成功获得稳定表达膜结合型CD40L的CHO细胞系，为比较膜结合型CD40L与sCD40L的生物学功能奠定了良好基础。     

CD40和CD40配体的研究进展

ＣＤ４０是一种存在于Ｂ淋巴细胞、树突状细胞、造血前体细胞、上皮细胞及某些癌细胞表面的跨膜糖蛋白。由２７７个氨基酸组成，分子量为４５～５０ＫＤａ，是ＴＮＦ－Ｒ超家族成员。人ＣＤ４０基因定位于２０号染色体ｑ１１－３，小鼠基因位于２号染色体上。ＣＤ４０配体（ＣＤ４０Ｌ）由２６１个氨基酸构成，分子量为３４ＫＤａ，是ＴＮＦ超家族成员。基因位于ｘｑ２４。主要存在于活化的ＣＤ４＋Ｔ细胞表面，在ＣＤ８＋、嗜碱／肥大细胞表面也有表达。ＣＤ４０与ＣＤ４０Ｌ间的反应与Ｂ细胞活化、增殖、抗体的产生、生发中心的形成有关。反应的中断可导致免疫耐受，ＣＤ４０Ｌ缺陷可造成性联高ＩｇＭ综合征（ＨＩＭ）。     

CD40和CD40配体的研究进展

ＣＤ４０是一种存在于Ｂ淋巴细胞、树突状细胞、造血前体细胞、上皮细胞及某些癌细胞表面的跨膜糖蛋白。由２７７个氨基酸组成，分子量为４５－５０ＫＤａ，是ＴＮＦ－Ｒ超家族成员。人ＣＤ４０基因定位于２０号染色体ｑ１１－３，小鼠基因位于２号染色体上，ＣＤ４０配体（ＣＤ４０Ｌ）由２６１个氨基酸构成，分子量为３４ＫＤａ，是ＴＮＦ超家族成员。基因位于ｘｑ２４。主要存在于活化的ＣＤ４＾＋Ｔ细胞表面，在ＣＤ８＾＋、ＫＦ     

动脉粥样硬化研究新进展：CD40—CD40配体

CD40 CD40配体广泛存在于动脉粥样硬化病变的各个阶段 ,并且与内皮细胞、平滑肌细胞和单核 /巨噬细胞的功能密切相关 ;阻断CD40 CD40配体的相互作用可以抑制动物动脉粥样硬化的发生与进展。     

大鼠心肌缺血再灌注损伤时粘附分子CD40及CD40配体的表达

目的:探讨粘附分子CD40及CD40配体(CD40L)在心肌缺血再灌注损伤中的表达。方法:采用大鼠心肌缺血再灌注损伤模型,大鼠分7组:对照组(n=3)、单纯缺血30min、缺血30min再灌注1min、5min、10min、20min和30min组(各组n=6),利用流式细胞技术观察外周血CD40及CD40L的表达,并用免疫组织化学法观察CD40及CD40L在心肌中表达情况。结果:单纯30min缺血组(I_30min)的CD40及CD40L高于对照组(P＜0.05);在不同的再灌注时间中,CD40及CD40L在再灌注1min(R_1min)开始升高,R_5min达高峰,随后开始下降,R_30min达基线,其中R_5min、R_10min的CD40及CD40L比I_30min及对照组高(P＜0.05),免疫组织化学法显示CD40及CD40L在心肌细胞膜上表达,正常心肌细胞膜上表达较弱,损伤心肌细胞膜上表达较强。结论:提示心肌缺血再灌注损伤的发生可能与粘附分子CD40及CD40L的异常表达有关。     

氧化低密度脂蛋白及抗氧化剂对人脐静脉内皮细胞表达CD40和CD40 L的影响

目的探讨OX -LDL和VitE对人脐静脉内皮细胞表达CD40 和CD40L的影响。方法应用流式细胞技术检测细胞表面CD40和CD40L表达水平。结果低浓度OX -LDL(<200μg/L)可使内皮细胞表达CD40 和CD40L含量明显增加 ,具有浓度和时间依赖效应。高浓度(>200μg/L)OX -LDL刺激时 ,CD40 和CD40L表达明显下降。抗氧化剂VitE呈剂量依赖性部分逆转OX -LDL对内皮细胞表达CD40 和CD40L。结论OX -LDL刺激内皮细胞高表达CD40和CD40L可能是其致动脉粥样硬化的重要机制。     

人CD40-Ig融合蛋白在CHO细胞中的表达与纯化研究

目的 建立稳定表达CD40－Ig融合蛋白的工程细胞株,获得大量融合蛋白以研究靶向阻断CD40：CD40L途径防治移植物抗宿主病（GVHD）策略的应用潜力。方法 自真核瞬时表达载体pIG／40Ig中切下CD40－Fc融合基因,插入pcDNA3．1载体中构建稳定表达载体。利用脂质体Lipo-fectamine将该载体转染CHO细胞,G418筛选抗性克隆;夹心ELISA法检测上清中CD40－Ig融合蛋白的表达;Westem blot法鉴定其免疫学活性。利用有限稀释法对筛选出的混合克隆单克隆化。滚瓶法无血清大批培养工程细胞,ProteinA亲和层析法纯化,SDS－PAGE后薄层扫描分析纯度。利用流式细胞术检测该蛋白与Jurkat细胞表面CD40L的结合功能。结果 CD40－Fc融合基因插入pcDNA3．1载体后构建成功稳定表达载体p3．1／40Ig,转染CHO细胞后经2次克隆化获得稳定表达CD40－Ig融合蛋白的基因工程细胞株,命名为p3．1／40Ig,转染CHO细胞后经2次克隆化获得稳定表达CD40－Ig融合蛋白的基因工程细胞株,命名为B2。ProteinA亲和层析纯化融合蛋白纯度达95％以上,该融合蛋白可特异结合Jukat细胞表面的CD40L。结论 CD40－Ig融合蛋白可模仿天然分子与其配基结合,为研究靶向CD40：CD40L途径的治疗制剂在防治GVHD中的潜在应用提供了有用的工具。     

CD40-CD40L共同表达于人内皮细胞及人动脉粥样斑块中

目的:探讨CD40和CD40L在人脐静脉内皮细胞及动脉粥样硬化斑块中是否可共同表达。方法:CD40及CD40L在内皮细胞表面的表达分别采用荧光技术、RT-PCR、流式细胞仪和Western blotting检测。人的动脉粥样硬化斑块中CD40及CD40L的表达采用免疫组化方法。结果:人内皮细胞能连续表达CD40及CD40LmRNA和蛋白, 并且细胞因子IL-1β、IL-6、TNF-α、INF-γ能明显刺激内皮细胞表达CD40、CD40L。人动脉粥样斑块中能共同表达CD40及CD40L, 而动脉壁的其它部分不表达。CD40L主要表达在斑块的肩部和底部, CD40在斑块中表达广泛。结论:人内皮细胞表面及粥样斑块中能共同高表达CD40和CD40L, 提示CD40及CD40L相互作用在动脉粥样硬化形成及发展中起重要作用。     

CD40L在肿瘤治疗中的作用

CD40L和CD40的相互作用在胸腺依赖的体液免疫和细胞免疫的调控中居于重要地位。研究表明,CD40L具有对肿瘤直接的生长抑制作用和对抗瘤免疫的激活作用。在对CD40L转染细胞诱导的抗肿瘤免疫的研究中,研究者们也取得了一些可喜的成果。这些研究进一步揭示了CD40L在肿瘤免疫治疗方面的应用前景。     

CD40配体对结肠癌细胞株的体外抑制作用

研究免疫共刺激分子CD40在结肠癌细胞株的表达及重组可溶性人CD40配体(rshCD40L)对结肠癌细胞株的体外抑制作用。采用流式细胞仪分别检测4株结肠癌细胞(HCT116、Caco-2、SW48和COLO-320)CD40分子的表达,同时利用流式细胞仪检测γ干扰素(IFN-γ)对结肠癌细胞株CD40表达的影响。MTT法检测rshCD40L对结肠癌细胞的抑制作用,TUNEL法检测rshCD40L对结肠细胞的促凋亡作用,同时检测联合rshCD40L和IFN-γ抗结肠癌作用。结果流式细胞仪检测有3株结肠癌细胞(HCT116、Caco-2和SW48)表达CD40分子,IFN-γ能增强CD40+结肠癌细胞CD40分子的表达。rshCD40L能明显抑制CD40+结肠癌细胞的增殖作用(抑制率分别为HCT116:33.5%±5.5%;Caco-2:21.5%±3.6%;SW48:30.1%±4.2%),而对CD40-结肠癌细胞株(COLO-320)无明显抑制作用(P<0.05)。rshCD40L能诱导CD40+结肠癌细胞的凋亡作用(凋亡细胞百分比为HCT116:25.6%±4.52%;Caco-2:15.71%±2.27%;SW48:18.0%±3.7%),而对CD40-结肠癌细胞株(COLO-320)无诱导凋亡作用(P<0.05)。另外,IFN-γ能明显增强rshCD40L对结肠癌细胞的抑制增殖和促凋亡作用。重组人CD40配体与IFN-γ联合可显著诱导CD40阳性的结肠癌细胞凋亡,抑制其增殖,具有潜在的抗肿瘤作用。     

CD40L在肿瘤治疗中的作用

CD40L和CD40的相互作用在胸腺依赖的体液免疫和细胞免疫的调控中居于重要地位。研究表明，CD40L具有对肿瘤直接的生长抑制作用和对抗瘤免疫的激活作用。在对CD40L转染细胞诱导的抗肿瘤免疫的研究中，研究者们也取得了一些可喜的成果。这些研究进一步揭示了CD40L在肿瘤免疫治疗方面的应用前景。     

重组人可溶性CD40配体对树突状细胞体外分化、成熟及功能的影响

用Ficoll密度离心及贴壁法获得外周血单个核细胞 (PBMC ) ,PBMC经细胞因子组合诱导分化成树突状细胞 (DC ) :GM CSF (10 0ng/ml)与IL 4 (5 0ng/ml)诱导 5d后 ,分别加入TNF α (10ng/ml)或rhsCD4 0L (2 μg/ml)继续培养 4d ;倒置显微镜下观察DC形态 ,免疫荧光标记和流式细胞术分析DC表型 (CD1a、CD80、CD83、HLA DR、CD14、CD16、CD19)及摄取FITC Dextran抗原的能力 ;3 H TdR掺入法检测DC刺激自体混合淋巴细胞体外增殖反应 (MLR )能力 ;ELISA法分析DC培养上清中IL 12的水平 ;Trans well细胞趋化实验检测DC对自体外周T淋巴细胞的趋化能力。发现经rhsCD4 0L刺激的DC表面分子 (CD1a、CD80、CD83、HLA DR )的表达水平高于经典的细胞因子组合组 (GM CSF +IL 4 +TNF α ) ,同时rhsCD4 0L刺激后的DC摄取FITC Dextran的能力下降而刺激自体MLR和分泌IL 12的能力明显提高 ;而且rhsCD4 0L诱导的DC表面趋化因子受体CXCR4的表达水平及对自体外周T淋巴细胞的趋化能力均强于TNF α或FL激发的DC。rhsCD4 0L在体外不仅具有显著的诱导DC分化 ,促进DC成熟的功能 ,而且经rhsCD4 0L作用的DC能更有效地激发T淋巴细胞     

单核／巨噬细胞表达CD40和CD40L及其在疾病中的作用

单核，巨噬细胞具有重要的生物学功能，参与机体非特异性免疫防御、特异性免疫应答和免疫调节。单核细胞表达CD40和CD40L，其在单核，巨噬细胞的功能中发挥重要的作用。CD40系统是细胞间重要的信号传导途径，通过相互作用可以促进各种细胞因子、趋化因子、金属基质蛋白酶产生、一氧化氮分泌，促使细胞逃逸凋亡、促进单核细胞分化为树突细胞等。单核细胞上异常表达CD40，CD40L在肾脏疾病、自身免疫性疾病、败血症和心血管疾病等发生发展中起重要作用。     

神经肽Y基因在哺乳动物细胞CHO中的稳定表达

以ＬｉｐｏｆｅｃｔｉｎＴＭ介导将ｐＲｃ／ＣＭＶＮＰＹ质粒转染入ＣＨＯ细胞，经Ｇ４１８筛选及Ｎｏｒｔｈｅｒｎｂｌｏｔ、ＥＬＩＳＡ和ＨＰＬＣ检测，得到稳定表达神经肽Ｙ（ＮｅｕｒｏｐｅｐｔｉｄｅＹ，ＮＰＹ）的细胞株，表达量为２～１０ｎｇ／（ｍｌ·１０７细胞）；表达时相分析结果显示转染细胞在转染后第４天表达量最高。     

单核/巨噬细胞表达CD40和CD40L及其在疾病中的作用

单核/巨噬细胞具有重要的生物学功能,参与机体非特异性免疫防御、特异性免疫应答和免疫调节。单核细胞表达CD40和CD40L,其在单核/巨噬细胞的功能中发挥重要的作用。CD40系统是细胞间重要的信号传导途径,通过相互作用可以促进各种细胞因子、趋化因子、金属基质蛋白酶产生、一氧化氮分泌,促使细胞逃逸凋亡、促进单核细胞分化为树突细胞等。单核细胞上异常表达CD40/CD40L在肾脏疾病、自身免疫性疾病、败血症和心血管疾病等发生发展中起重要作用。     

CD40/CD40L介导信号的免疫调节作用

B细胞的CD40分子与活化T细胞的CD40配体(CD40L)结合可调节B细胞生长分化、克隆转换、Ig分泌、阻断B细胞凋亡和诱导Fas表面分子表达等,直接参与调节体液免疫。CD40与CD40L结合也影响细胞免疫功能,诱导Th1和Th2细胞因子产生。CD40与CD40L连接使TRAF蛋白多聚化,从而调节基因的转录。CD40介导的信号传导过程与蛋白酪氨酸酶、蛋白酪氨酸磷酸化酶等有关。     

系统性红斑狼疮外周血单个核细胞CD40L的表达增高

目的:了解系统性红斑狼疮(SLE)患者外周血单个核细胞(PBMCs)的白细胞分化抗原40配体(CD40L)表达,探讨其在发病中的作用。方法:分离SLE患者和正常人PBMCs,采用流式细胞术,检测其在正常状况和应用植物凝集素(PHA)及地塞米松(Dex)后,CD40L的表达水平,并进行比较;分析SLE患者CD40L的表达水平和狼疮活动指数(SLEDAI)的相关性。结果:活动期SLE患者PBMCs的CD40L阳性细胞百分率(%)明显高于对照组,且高于静止期SLE患者;应用PHA处理24h后,3组PBMC表达CD40L均明显增加,但活动期SLE患者增加更明显;应用地塞米松后,SLE患者(活动期和静止期)PBMCs的CD40L表达明显减少,对照组无明显改变;SLE患者(活动期和静止期)CD40L的表达水平和SLEDAI均呈明显正相关。结论:CD40L在SLE患者PBMCs的表达增加,和疾病活动度有关;其受PHA和Dex调控,在SLE发病和病程中起重要作用。     

可溶性CD40配体酶联检测试剂盒的研制及其运用

目的 :建立灵敏、特异和稳定的人可溶性CD4 0配体 (sCD4 0L)酶联检测试剂盒。方法 :采用鼠抗人CD4 0L单克隆抗体 1B1为包被抗体 ,识别人CD4 0L不同位点的单克隆抗体 4F1经琥珀酰羟基生物素 (BNHS)标记后为检测抗体 ,建立双抗体夹心的人sCD4 0L酶联检测方法。在此基础上 ,测定 2 0 0例健康供血员血清和血浆中sCD4 0L的含量。结果 :成功研制人sCD4 0L酶联检测试剂盒 ,灵敏度为 0 5ng ml。该试剂盒 4℃放置 3个月 ,离散度 (CV) <± 6 9% ,回收率为 94 7%～ 10 4 8% ,提示该检测系统具有良好的灵敏度、稳定性和准确性 ,与国外商品化试剂盒的分析结果相似。应用该试剂盒测得的健康供血员血清和血浆sCD4 0L含量分别为 9 5 6± 4 71、2 98± 1 13ng ml。结论 :研制成灵敏、特异和稳定的人sCD4 0L酶标检测试剂盒 ,能够对血清和血浆中sCD4 0L进行准确定量分析 ,并首次证实血清和血浆中sCD4 0L水平的差异性     

人突变CD59基因在CHO细胞的表达、检测及生物活性研究

目的：分别构建两个高效表达人突变CD59的CHO细胞真核表达系统，探讨突变CD59基因表达蛋白糖基化前后抗补体活性的变化，为在基因水平阐明糖尿病血管增殖症的发病机理奠定基础。方法：将两种含不同突变基因的人CD59全长cDNA序列（HM7、HM8）的重组pALTER质粒运用阳离子脂质体导入法共转染CHO细胞，用含有400μg/ml新霉素类似物（G418）的F12培养基筛选出阳性表达克隆，应用荧光免疫组化（FIH）检测CD59在CHO细胞表面的表达。经染料释放试验检测突变CD59糖基化前后抗补体活性。结果：运用阳离子脂质体导入法将重组pALTER质粒与pcDNA3质粒共转染CHO，成功筛选出的阳性克隆经FIH证明突变CD59可在CHO细胞表达。染料释放法证实两种突变CD59均具有抗补体活性，且在高糖环境下易糖基化，糖基化后抗补体活性明显降低。结论：建立了两个高效表达突变CD59的真核表达系统，获得阳性克隆细胞株。初步研究证实突变CD59具有抗补体活性，糖基化后抗补体活性明显降低，为单克隆抗体的制备奠定了基础。