腺病毒介导野生型p53基因对人白血病细胞系HL—60,K562生长的抑制作用

目的 探索肿瘤抑制基因Ｐ５２对人白血病细胞系的生长抑制作用和促凋亡作用。方法 选用含野生型ｐ５３基因的重组腺病毒载体，体外感染人白血病细胞系ＨＬ－６０，Ｋ５６２。通过细胞生长曲线，ＤＮＡ检测及流式细胞仪分析检测转染细胞的增殖受抑制和细胞凋亡的发生。结果 ＰＣＲ检测转染后ＨＬ－６０和Ｋ５６２细胞ｐ５３ ｃＤＮＡ表达。     

外源性野生型p53基因抑制裸小鼠体内人白血病细胞的生长

目的探讨野生型ｐ５３基因对体内生长的白血病细胞的抑制作用。方法采用直接注射法向裸小鼠体内ＨＬ６０－ｎ和Ｋ５６２－ｎ细胞移植瘤注射编码人野生型ｐ５３的重组逆转录病毒，使其在这两种细胞中表达，并导致其编程性细胞死亡。结果裸小鼠在接种ＨＬ６０－ｎ或Ｋ５６２－ｎ细胞后２４ｈ，于接种部位连续７天注射编码野生型ｐ５３的逆转录病毒，移植瘤发生的潜伏期较对照组明显延长。结论直接注射转移野生型ｐ５３基因能有效地抑制裸小鼠体内人白血病细胞的生长。     

外源性野生型p53基因在K562－n细胞表达的意义

目的研究外源性野生型ｐ５３基因在红白血病细胞表达的意义。方法采用重组逆转录病毒载体介导的方法将人野生型ｐ５３基因ｃＤＮＡ转移入Ｋ５６２－ｎ细胞，用形态学、流式细胞仪和联苯胺染色试验检测转基因后的Ｋ５６２－ｎ细胞。结果野生型ｐ５３基因可以诱导Ｋ５６２－ｎ细胞编程性细胞死亡和分化的形态特征，且伴有细胞周期Ｇ１期的生长阻滞。结论野生型ｐ５３基因能抑制人红白血病细胞生长的某些机制。     

腺病毒介导的p53基因对喉癌细胞生长的抑制作用

目的探索ｐ５３基因在喉癌基因治疗方面的可行性。方法以人喉癌细胞系Ｈｅｐ－２为实验对象,将载有人野生型ｐ５３ｃＤＮＡ并含巨细胞病毒（ＣＭＶ）启动子的重组腺病毒（Ａｄ５ＣＭＶ－ｐ５３）感染Ｈｅｐ－２细胞及肿瘤组织,体内外实验观察Ａｄ５ＣＭＶ－ｐ５３对Ｈｅｐ－２细胞生长的影响。结果当Ａｄ５ＣＭＶ－ｐ５３在１００ＭＯＩ效靶比时,全部Ｈｅｐ－２细胞得到转染。感染２天后ｐ５３蛋白表达达到高峰,Ｈｅｐ－２生长受到明显的抑制。Ａｄ５ＣＭＶ－ｐ５３感染Ｈｅｐ－２细胞在裸鼠中失去致瘤性。瘤内注射Ａｄ５ＣＭＶ－ｐ５３后,荷瘤裸鼠的肿瘤体积明显减小。结论Ａｄ５ＣＭＶ－ｐ５３转导野生型ｐ５３基因可能是一种有效的喉癌基因治疗途径。     

野生型p53基因抑制膀胱癌细胞株HTB9生长及其机理的研究

目的：探讨野生型ｐ５３基因抑制膀胱癌生长的作用及其机理,方法：将野生型ｐ５３基是组腺病毒载体转染入膀胱癌细胞ＨＴＢ９,观察细胞生长曲线,细胞周期变化及ＤＮＡ合成情况,应用ＲＴ－ＰＣＲ检测ｐ２１ｍＲＮＡ水平,应用免疫组化法检测ｐ２１蛋白表达水平。结果：野生型ｐ５３基因导入可抑制ＨＴＢ９细胞生长和ＤＮＡ合成（ＡｄＣＭＶｐ５３）,流式细胞仪显示,ＤＮＡ合成前期或静止静的细胞比例增高,而合成期细胞比例下降,另外,ＡｄＣＭＶｐ５３还提高了ｐ２１的ｍＲＮＡ和蛋白水平,结论：腺病毒载体介导的野生型ｐ５３基因转梁对于膀胱可能是很有前途的基因治疗方法。     

二乙酰二脱水卫矛醇在体内外的抗瘤作用及其机制

目的：观察二乙酰二脱水卫柔醇（ｄｉａｃｅｔｙｌｄｉａｎｈｙｄｒｏｇａｌａｃｔｉｔｏｌ,ＤＡＤＡＧ）在体内外的抗肿瘤作用,探讨其抗肿瘤作用与诱导细胞凋亡的关系。方法：建立小鼠脑内接种艾氏腹水癌模型,观察ＤＡＤＡＧ体内抗瘤作用;ＭＴＴ法观察ＤＡＤＡＧ对人早幼粒白血病细胞株ＨＬ－６０和人红白血病细胞株Ｋ５６２的生长抑制作用,ＤＮＡ电泳和流式细胞仪分析ＨＬ－６０和Ｋ５６２细胞凋亡的情况。结果：ＤＡＤＡＧ１０ｍｇ／ｋｇ ｉｐ,每天１次,连续给药７天,可显著延长小鼠中位生存时间;对ＨＬ－６０和Ｋ５６２均有生长抑制作用,药物作用７２ｈ的ＩＣ５０分别为３．７ｍｇ／Ｌ和２５．５ｍｇ／Ｌ;作用ＨＬ－６０和Ｋ５６２细胞后电泳显示有凋亡细胞特有的“梯状”条带,ＤＮＡ直方图出现亚Ｇ１峰。结论：ＤＡＤＡＧ抗肿瘤作用与诱导细胞凋亡有关。     

番荔枝内酯化合物squamocin诱导白血病HL-60细胞凋亡

目的：研究番荔枝内酯化合物ｓｑｕａｍｏｃｉｎ诱导白血病ＨＬ－６０细胞凋亡作用。方法：采用ＭＴＴ法检测番荔枝内酯单体化合物ｓｑｕａｍｏｃｉｎ对白血病细胞株ＩＬ－６０细胞增殖的抑制作用;ＤＮＡ凝胶电泳检测细胞凋亡;Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ法检测ｂｃｌ－２,ｂａｘ,ｐ２１＾ＷＡＦ１,磷酸化ｐ４４／４２ ＭＡＰＫ的蛋白水平变化。结果：ｓｑｕａｍｏｃｉｎ处理ＨＬ－６０细胞５天后,细胞生长受到明显的抑制,ＩＣ５０为０．１７μｇ／ｍｌ。ＤＮＡ凝胶电泳可见典型的ＤＮＡ梯形带。ｓｑｕａｍｏｃｉｎ处理ＨＬ－６０细胞后,Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ检测结果呈现ｂｃｌ－２,ｂａｘ,ｐ２１＾ＷＡＦ１蛋白表达无明显变化,而磷酸化的ＭＡＰＫ量显著减少。结论：ｓｑｕａｍｏｃｉｎ能诱导ＨＬ－６０细胞凋亡,且与ｂｃｌ－２、ｂａｘ、ｐ２１＾ＷＡＦ１蛋白     

重组腺病毒介导反义c-myc基因对人肝癌细胞系的治疗作用

目的：探讨重组腺病毒介导反义ｃ－ｍｙｃ基因（Ａｄ－ＡＳｍｙｃ）治疗人肝癌细胞的作用。方法：观察Ａｄ－ＡＳｍｙｃ对人肝癌细胞系的转导效率,通过细胞生长曲线、克隆形成实验、ＤＮＡ片段化分析、ＲＴ－ＰＣＲ、裸鼠皮下移植瘤治疗实验,分析Ａｄ－ＡＳｍｙｃ对人肝癌细胞系Ｂｅｌ－７４０２、ＱＳＧ－７７０１、ＳＭＭＣ－７７２１和ＨＣＣ－９２０４细胞生长和ｃ－ｍｙｃ基因表达及裸鼠肿瘤生长的抑制作用。结果：Ａｄ－ＡＳｍｙｃ可高效转导人肝癌细胞系,抑制细胞生长;转染细胞克隆形成能力降低,克隆成活率为对照组的５３．９％～６９．１％,ｃ－ｍｙｃ基因表达下降;Ａｄ－ＡＳｍｙｃ处理肝癌细胞,ＤＮＡ凝胶电泳出现明显的梯形条带,瘤内注射Ａｄ－ＡＳｍｙｃ可抑制裸鼠皮下移植瘤生长。结论：重组腺病毒介导的反义ｃ－ｍｙｃ基因转移,有可能成为肝癌基因治疗     

外源p53对人肺癌细胞生长的抑制

目的 观察外源性野外型ｐ５３对有ｐ５３基因突变的人肺癌细胞系生长的影响。方法 用ＰＣＲ－ＳＳＣＰ及ＤＮＡ测序，选择ｐ５３突变的人肺巨细胞癌系８０１－Ｄ。构建野生型ｐ５３表达质粒ＰＺｉＰ－ｐ５３。用基因枪介导外源基因。经Ｇ４１８筛选得到转染细胞系８０１－Ｄ－ｐ５３。用ＰＣＲ检测外源基因，观察转染细胞恶性生长的变化。结果 转染细胞系８０１－Ｄ－ｐ５３体外长期传代有外源性ｐ５３基因存在，转染细胞生长明显     

Ad—p53与Ad—p16联合对人肺腺癌GLC—82细胞作用的研究

目的：探讨腺病毒介导的ｐ５３与ｐ１６基因联合对人肺腺癌ＧＬＣ－８２疗效提高的可能性。方法：将分别携有ｐ５３基因、ｐ１６基因重组腺病毒（Ａｄ－ｐ５３与 Ａｄ－ｐ１６）联合使用,通过细胞生长和存活实验、克隆形成实验、流式细胞分析、ＴＵＮＥＬ检测、ＲＴ－ＰＣＲ分析、免疫组织化学实验,观察其对人肺腺癌ＧＬＣ－８２细胞的作用。结果：在总感染强度相同的前提下,Ａｄ－ｐ５３与Ａｄ－ｐ１６联合导入ＧＬＣ－８２细胞,对细胞生长存活及克隆形成能力的抑制、以及所造成的凋亡效果比施用单种基因的效果强,表明ｐ５３基因与ｐ１６基因在体外疗效上互为协同。结论：Ａｄ－ｐ５３与Ａｄ－ｐ１６联合,可以提高对人肺腺癌ＧＬＣ－８２细胞的疗效。     

抑癌基因p16INK4a与p53抑制白血病细胞株生长作用的比较

 目的 比较野生型p16INK4a、p53抑癌基因的表达对白血病细胞株K562和HL60的生长抑制。方法 采用脂质体介导野生型p16INK4a、p53抑癌基因转染K562、HL60细胞并进行G418筛选，免疫印渍检测p16INK4a、p53基因的表达，通过细胞生长曲线检测细胞活力，流式细胞仪进行细胞DNA周期分析及细胞凋亡分析，采用联苯胺氧化试验检测K562细胞的分化。结果 转染后p53、p16INK4a在K562及HL60细胞中表达；与对照细胞相比，实验组细胞生长受到明显的抑制，G1期细胞数增加，S期细胞减少。与p16INK4a相比，抑癌基因p53使细胞表达Annexin V增加，显示出更强的致凋亡现象，尤其在HL60细胞株。结论 抑癌基因p16INK4a、p53能有效抑制白血病细胞株的生长，可能更适合复发、难治性白血病的基因治疗。     

野生型p53对白血病K562细胞中心体过度复制的抑制作用

背景与目的：肿瘤组织细胞中p53基因突变或缺失是导致非整倍体的发生和基因组不稳定的主要原因之一：最近研究发现慢性粒细胞白血病（chronic myelogenous leukemia．CML）各期患者均有中心体异常,且异常的程度与临床分期有关。急变期显示更为严重的中心体异常。本研究建立携野生型p53基因的CML急变K562细胞株．以研究该细胞内野生型p53基因表达后p53信号转导通路对K562细胞中心体的影响。方法：用HEK293细胞扩增重组p53野生型、突变型及空载腺病毒载体,联合polybrene分别感染K562细胞;未接受感染的细胞作为空白对照。流式细胞术检测重组腺病毒载体感染效率,Western blot检测P53蛋白表达。间接免疫荧光染色后用激光共聚焦计数K562细胞中心体的变化。Westernblot检测p53信号转导通路下游效应分子生长阻滞和DNA损伤应答基因Gadd45a（growtharrest and DNA damage）、BubRl（Bublrelated）、AuroraA的表达。结果：成功建立携野生型p53基因的K562细胞株．腺病毒载体感染效率达60％以上,野生型p53可在K562细胞中持续表达。感染72h后,携野生型p53基因的K562细胞中中心体数量异常（n〉2）的细胞比例降至（0．38＋0．02）％,与空白对照组（0．71＋0．14）％比较其差异有统计学意义（P〈0．05）;Westernblot结果发现p53信号转导通路下游效应分子Gadd45a、BubRl表达分别上调93％、88％．而AuroraA的表达下降56％（P值均〈0．05）。结论：重组腺病毒介导的野生型p53基因能够在白血病K562细胞中持续表达：野生型P53蛋白可能通过转录激活-依赖途径上调Gadd45a、BubR1表达以及转录激活-非依赖途径使AuroraA的表达下降,从而抑制K562细胞中心体的过度复制。     

柚皮素对人类白血病K562细胞生长的作用及其机制探讨

 目的 研究柚皮素（naringenin）对人类慢性髓系白血病K562细胞株的作用及其机制。方法 体外培养K562细胞,MTT法检测柚皮素在不同浓度、不同时间点对K562细胞生长的影响;用免疫组织化学的方法检测细胞增殖核抗原（PCNA）的表达,并计算PCNA标记指数（LI）;显微镜和透射电镜下观察细胞形态变化;流式细胞仪分析细胞周期分布和细胞凋亡率;用RT-PCR和Western blot的方法检测K562细胞中p53、p21WAF1 mRNA和蛋白表达的变化。结果 柚皮素对K562细胞增生有明显抑制作用,作用24、48和72 h后的半数抑制浓度（IC50）分别为455 μmol／L、225 μmol／L和175 μmol／L;PCNA在柚皮素实验组的表达显著低于对照组;普通光镜以及电镜观察均见实验组细胞显著的增生抑制和典型的细胞凋亡形态学改变;流式细胞仪分析证实柚皮素能使K562细胞聚积在G0／G1期、S期细胞减少,凋亡率增加;RT-PCR和Western-blot检测表明,实验组细胞表达p21 mRNA和蛋白质呈浓度和时间依赖性升高,而p53变化不明显。结论 柚皮素对K562细胞具有明显的增生抑制作用,细胞周期阻滞和诱导凋亡可能是其重要机制,而非p53依赖性的p21上调可能是其发挥作用的重要途径。     

转染抗VEGF发夹状核酶基因白血病细胞模型的建立

 目的 建立转染抗血管内皮生长因子（VEGF）发夹状核酶基因的白血病细胞模型,探讨发夹状核酶对白血病细胞系K562 VEGF基因表达的效应。方法 采用脂质体介导的方法将抗VEGF发夹状核酶基因真核表达载体（pcDNA3-RZ）转染入人白血病细胞系K562,G418抗性筛选获得阳性克隆,转染VEGF pcDNA3-RZ和空载体（pcDNA3）的细胞组均有抗性细胞生长,分别命名为K562-RZ和K562-PC;抽提基因组DNA,用PCR方法验证核酶基因已转染入K562细胞,荧光定量PCR和western blot方法分别检测白血病细胞VEGF mRNA和蛋白的表达量;同时测定K562-RZ,K562-PC和 K562三组培养上清刺激内皮细胞生长的情况。结果 抗VEGF pcDNA3-RZ成功转入白血病细胞系K562,G418筛选2周获得阳性克隆,PCR检测证实核酶基因整合入白血病细胞基因组DNA;与K562及K562-PC细胞相比,转染VEGF核酶基因的K562-RZ细胞VEGF mRNA和蛋白的表达量明显降低;K562-RZ组培养上清对内皮细胞的刺激作用明显弱于K562-PC组。结论 建立了转染VEGF发夹状核酶基因的白血病细胞模型,抗VEGF发夹状核酶基因可明显下调白血病细胞VEGF的表达,为抗肿瘤治疗提供了新的线索。     

RNA干扰Apollon基因逆转白血病K562细胞多药耐药

背景与目的：Apollon基因在白血病等多种肿瘤内高表达。本试验通过构建高效干扰Apollon基因的短发夹RNA(short hairpin RNA,shRNA)真核表达载体,探讨RNA干扰技术能否逆转人髓系白血病K562细胞多药耐药。方法：构建靶向Apollon基因真核表达载体pGPHI-GFP-Neo-Apollon,应用Lipofectamine^TM2000转染K562细胞,G418稳定筛选。采用反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)法、细胞免疫荧光法分别检测重组载体稳定转染K562细胞后Apollon mRNA及蛋白的表达情况;四甲基偶氮唑盐(MTT)、流式细胞术检测细胞转染前后对长春新碱(leurocristine,VCR)、足叶乙苷(etoposide,VP16)的敏感性及凋亡率的变化。结果：成功构建了pGPHI-GFP-Neo-Apollon载体并在K562细胞内稳定表达的细胞克隆,经G418筛选后,重组载体能有效沉默Apollon的表达,Apollon mRNA及蛋白表达水平明显下降。MTT结果显示,基因干扰组细胞对VCR、VP16的敏感性明显增强,其半数抑制浓度(half-inhibitory,IC₅₀)值分别为(0.144±0.018)mg/L、(17.336±3.571)mg/L,明显低于细胞对照组(P<0.05)。流式细胞术检测结果表明,基因干扰组细胞联合化疗药物后细胞凋亡率显著升高(P<0.05),而转染阴性对照组细胞凋亡率与正常对照组比较差异无统计学意义(P>0.05)。结论：pGPHI-GFP-Neo-Apollon载体能显著增强VCR和VP16对白血病K562细胞的诱导凋亡作用,提高K562细胞对化疗药物的敏感性,提示RNA干扰Apollon基因表达能一定程度逆转白血病细胞的多药耐药。     

PTEN/PI3K/Akt信号通路对K562细胞凋亡调控的研究

 目的 探讨PTEN/PI3K/Akt信号传导通路对人慢性粒细胞白血病细胞系K562的增殖、凋亡调控的研究及可能的分子作用机制。 方法 将携带有野生型PTEN及绿色荧光蛋白的腺病毒（Ad-PTEN-GFP）及空载体（Ad-GFP）腺病毒,转染人慢性粒细胞白血病细胞系K562。通过MTT检测细胞生长曲线,流式细胞术检测细胞凋亡率和细胞增殖指数,同时用细胞光镜、电镜形态等方法检测细胞凋亡,荧光定量PCR（FQ-PCR）检测PTEN及凋亡相关基因Bcl-2、Bcl-_xL、Bax mRNA水平变化,Western blot检测PTEN及Akt、p-Akt蛋白水平变化。 结果 与Ad-GFP组相比,Ad-PTEN-GFP 转染K562细胞后,细胞增殖受抑,增殖指数降低,凋亡率增加,p-Akt表达降低,抗凋亡相关基因Bcl-2、Bcl-_xL mRNA表达降低,促凋亡基因Bax mRNA表达增加。 结论 过表达PTEN可能通过抑制PI3K/Akt通路抑制K562细胞系增殖,促进细胞凋亡。     

未知基因KH的真核表达载体构建及其对细胞增殖的影响

目的 构建未知基因KH的开放阅读框架(KH-ORF)的真核表达体系,初步探讨未知基因KH对细胞增殖的影响。方法 采用DNA重组技术构建KH-ORF的表达载体pCI-neo-KH-ORF,通过脂质体法转染COS-7细胞和K562细胞,RT-PCR检测目的基因的表达。采用流式细胞术检测：KH-ORF对COS-7细胞和K562细胞周期的影响,四甲基偶氮唑蓝(MTT)法检测KH-ORF对COS-7细胞增殖速度的影响,生长曲线与乳酸脱氢酶(LDH)活性测定检测KH-ORF对K562细胞增殖速度的影响。结果 (1)KH-ORF在COS-7细胞与K562细胞中获得表达。(2)KH-ORF对COS-7细胞的细胞周期与增殖速度无明显影响。(3)流式细胞术检测显示,KH-ORF使K562／pCi-KH-ORF细胞周期中S期细胞增多;生长曲线显示,KH-ORF促进K562／pCI-KH-ORF细胞增殖;LDH活性测定结果表明,K562／pCI-KH-ORF细胞LDH比活性上升,高于对照组细胞。结论 KH基因可能是一个与K562细胞增殖有关的白血病未知基因。