脑肿瘤干细胞的增殖活性与微血管密度的相关性研究

目的 探讨脑肿瘤干细胞(BTSC)增殖活性与微血管密度的相关性.方法 采用免疫组织化学染色检测BTSC标记物CD133、增殖细胞核标记物Ki-67和血管内皮细胞标记物CD31在胶质瘤组织中的表达;采用免疫荧光双染法检测CD133/Ki-67和CD133/CD31的共表达情况;并对BTSC的增殖活性与微血管密度的相关性行统计学分析.结果 免疫组化显示:低级别胶质瘤中,CD133、CD31和Li-67的阳性表达较少;而在高级别胶质瘤中,CD133、CD31和Ki-67阳性表达明显增加.免疫荧光双染显示:随着胶质瘤级别升高,CD133/Ki-67共表达明显增加,且可见CD133/CD31共表达于血管内皮细胞.在胶质瘤组织中,Ki-67、CD31表达均与CD133表达呈正相关(n=0.758,P<,1>=0.000;r<,2>=0.439,P<,2>=0.000),ki-67与CD31的表达也呈正相关(r<,3>=0.816,P<,3>=0.000).结论 BTSC与微血管联系密切,不仅在区域分布上围绕微血管增殖分化.并且在功能上与微血管相互促进和依赖.     

CD133鉴定胶质瘤干细胞血管周围壁龛的实验研究

目的 检测脑肿瘤干细胞(BTSC)标记物CD133、巢蛋白(Nestin)和增殖细胞核抗原(PCNA)在74例脑胶质瘤标本中的表达,探讨肿瘤干细胞生存的微环境一壁龛的组成、形态及其在脑肿瘤组织中的分布. 方法 选取安徽医科大学附属省立医院神经外科自2007年1月至2008年10月间手术切除的74例胶质瘤标本,按照WH02000年的神经系统肿瘤分类分级标准分为Ⅱ级22例(低级别组)、Ⅲ级27例和Ⅳ级25例(高级别组),采用免疫组织化学染色和免疫荧光双标法分别检测标本中CD133的表达及其与Nestin、PCNA的共表达情况.计算并比较不同级别胶质瘤组织CD133+细胞、CD133+血管和CD133+壁龛所占的百分比.并对CD133+血管和CD133+壁龛的表达进行相关性分析. 结果 CD133+细胞聚集于壁龛内生长,低级别组胶质瘤中CD133+壁龛阳性率较低.壁龛内增殖细胞较少,与相邻肇龛之间界限清晰,周围CD133+血管分布较少.高级别组胶质瘤中CD133+壁龛阳性率高,壁龛之间无明显界限,壁龛内细胞增殖活跃,周围可见丰富的CD133+血管分布:壁龛中除CD133+/Nestin+BTSC外,可见CD133+/Nestin-细胞、CD133/PCNA+细胞等亚群细胞;不同级别胶质瘤CD133+细胞、CD133+血管、CD133+壁龛百分比不同,且肿瘤级别越高,三者表达越高,差异有统计学意义(P<0.05).CD133+壁龛与CD133+血管的表达呈正相关(r=0.425,P=0.000). 结论 在脑胶质瘤组织中存在着由CD133+/Nestin+BTSC和一些亚群细胞组成的壁龛结构,CD133+血管对于壁龛结构的维持起着非常重要的作用.     

25例恶性胶质瘤中肿瘤干细胞的分离与检测

目的 从不同病理级别胶质瘤组织标本中分离、培养并鉴定胶质瘤干细胞.方法 取25例(23例原发胶质瘤,2例复发胶质瘤)新鲜人脑胶质细胞瘤标本,分离脑肿瘤细胞,接种于含生长因子的无血清达尔伯克(氏)必需基本培养基/F-12(DMEM/F-12)培养基中培养至细胞形成干细胞球,免疫荧光法检测脑肿瘤干细胞CD133、Nestin的表达情况,干细胞球诱导分化后检测细胞表面分化标记物β微管蛋白Ⅲ(β-TubulinⅢ)、神经胶质酸性蛋白(GFAP)表达情况.结果 被检测的23例原发胶质瘤标本中,随着胶质瘤级别的增高,形成神经球的时间缩短,数量增多.2例复发胶质瘤组织分离得到的细胞形成的神经球较原发胶质瘤快而多.免疫荧光方法检测神经球CD133、巢蛋白(Nestin)表达阳性.神经球细胞经诱导分化后β-TubulinⅢ、GFAP表达阳性.结论 胶质瘤组织中存在肿瘤干细胞,不同级别胶质瘤中BTSC数量及增殖能力不同.     

人脑胶质瘤中CD133、SSEA-1、Nestin的表达和意义

目的：研究胶质瘤干细胞标志物CD133、SSEA-1和Nestin在胶质瘤组织中表达及其与病理分级的相关性;探讨三者在人脑胶质瘤的诊断及恶性程度判断中的临床意义。方法应用免疫组织化学方法检测54例脑胶质瘤组织和6例正常脑组织标本中CD133、SSEA-1及Nestin的表达。结果 CD133、SSEA-1和Nestin在胶质瘤组织中的阳性细胞平均表达率分别为25.38%、26.62%和22.39%,而在正常脑组织中均无表达。CD133、SSEA-1和Nestin阳性细胞率在胶质瘤各病理级别间比较,差异均有统计学意义,且三者的表达与胶质瘤病理级别呈正相关（P＜0.05）。SSEA-1与CD133、CD133与Nestin及SSEA-1与Nestin阳性细胞表达均呈正相关（P＜0.05）。结论检测CD133、SSEA-1、Nestin表达,有利于胶质瘤的诊断及恶性程度判断,并在胶质瘤的个性化综合治疗和预后评估发挥作用。     

人脑胶质瘤中CD15、Ki-67的表达及其临床意义

目的研究细胞粘附分子CD15及Ki-67抗原在人脑胶质瘤中的表达及其临床意义。方法应用免疫组化S-P法检测例正常脑组织和858例人脑胶质瘤组织中CD15和Ki-67的表达。结果CD15和Ki-67在正常脑组织中均不表达,而在各级别的人脑胶质瘤中均有表达差异极显著,(P<0.01)。CD15和Ki-67的表达在高级别胶质瘤中均显著高于低级别胶质瘤(P<0.01),且CD15和Ki-67的表达呈显著正相关(P<0.05,r=0.462)。结论Ki-67可以作为评估胶质瘤细胞增殖的良好指标,CD15和Ki-67的表达可为判断胶质瘤的恶性程度和临床病理分级提供有意义的依据。     

胶质瘤组织中CD105与Ki-67表达的相关性

目的探讨胶质瘤组织中CD105与Ki-67表达的相关性。方法对58例胶质瘤和10例正常脑组织标本采用免疫组织化学方法检测CD105和Ki-67蛋白表达情况,并分析其相关性。结果①正常脑组织CD105蛋白表达阴性,而各级胶质瘤组织均有CD105蛋白阳性表达。高倍视野(×200倍)下Ⅰ～Ⅳ级胶质瘤组织CD105标染的微血管密度(CD105-MVD)分别为(6.33±2.97)个/视野、(10.69±2.88)个/视野、(19.13±5.14)个/视野和(25.13±5.51)个/视野,随病理分级提高逐渐增高(r=0.834,P<0.01),且不同级别胶质瘤间差异显著(P<0.01)。②Ⅰ～Ⅳ级胶质瘤组织Ki-67标记指数(Ki-67LI)分别为(4.20±1.30)%、(5.32±2.08)%、(9.88±3.24)%和(22.25±6.68)%,随病理分级升高逐渐增高(r=0.872,P<0.01),与正常脑组织比均有显著性差异(P<0.01)。除Ⅰ、Ⅱ级胶质瘤间无明显差异(P>0.05)外,其他各级别胶质瘤间均相差显著(P<0.01)。③CD105-MVD与Ki-67LI呈显著正相关(r=0.699,P<0.01)。结论胶质瘤组织中CD105-MVD与Ki-67LI有显著相关性,提示其可作为判断胶质瘤恶性程度的指标。     

胶质瘤中CD105与VEGF、Ki-67表达的相关性

目的探讨胶质瘤中CD105与血管内皮生长因子(VEGF)、Ki-67表达的相关性。方法对58例胶质瘤和10例正常脑组织标本采用免疫组化法检测CD105、VEGF、Ki-67蛋白表达情况并分析其相关性。结果①在正常脑组织中CD105、VEGF和Ki-67均表达阴性,且与各级胶质瘤的表达相差显著(P<0.01)。②Ⅰ～Ⅳ级胶质瘤CD105标染的微血管密度(CD105-MVD)分别为(6.33±2.97)个/视野、(10.69±2.88)个/视野、(19.13±5.14)个/视野和(25.13±5.51)个/视野,不同级别的胶质瘤间差异显著(P<0.01),且其表达与病理分级呈正相关(r=0.834,P<0.01)。③Ⅰ～Ⅳ级胶质瘤VEGF阳性细胞百分率分别为(15.00±3.39)%、(20.26±9.64)%、(36.19±10.75)%和(55.94±11.69)%,除Ⅰ、Ⅱ级之间外,其余各级别胶质瘤间相差显著(P<0.01),且其表达与胶质瘤病理分级呈正相关(r=0.836,P<0.01)。④Ⅰ～Ⅳ级胶质瘤Ki-67标记指数(Ki-67LI)分别为(4.20±1.30)%、(5.32±2.08)%、(9.88±3.24)%和(22.25±6.68)%,除Ⅰ、Ⅱ级之间外,其余各级别胶质瘤间相差显著(P<0.01),且其表达与胶质瘤病理分级呈正相关(r=0.872,P<0.01)。⑤CD105-MVD与VEGF阳性细胞百分率、Ki-67LI均呈显著正相关(r1=0.671,r2=0.699,P<0.01)。结论胶质瘤中CD105-MVD与VEGF阳性细胞百分率、Ki-67LI均有显著相关性,提示其可作为判断胶质瘤恶性程度的指标。     

Ki—67表达强度对人脑胶质瘤恶性度的评价

目的 研究细胞核增殖抗原Ki-67人脑胶质瘤中的表达强度与病理分级的关系。比较Ki-67与其他评价肿瘤增殖潜能指标的优越性。方法 SP免疫组化方法对41例不同级别人脑胶质瘤细胞的Ki-67表达进行观察,评价染色强度和阳性细胞百分数与胶质瘤细胞恶性度的关系。结果 全部受检病例中对照组Ki-67均为阴性染色,全部胶质瘤标本表达阳性率达85%星形细胞瘤I级绝大部分病例为阴性染色,只存在2例阳性染色。结论 Ki-67表达与胶质瘤恶性程度相关,其表达水平不仅可以反映胶质瘤的恶性增殖潜能,亦可反映其预后,Ki-67在人脑胶质瘤中的表达可以应用于临床,作为评价胶质瘤生物学行为,选择治疗措施、预测患者生存时间的指标。     

CD133基因表达与人脑胶质瘤恶性程度相关性分析

目的探讨人脑胶质瘤组织中胶质瘤干细胞标志物CD133的表达与肿瘤恶性程度的关系。方法应用实时荧光定量PCR方法检测75例不同病理级别胶质瘤组织及4例正常脑组织中CD133基因的表达情况，并与肿瘤病理级别进行相关性分析；同时采用免疫组化法检测35例肿瘤组织和2例正常脑组织中CD133的表达情况，在蛋白表达水平予以验证。结果CD133在基因转录水平和蛋白表达水平具有良好的相关性。CD133在正常脑组织中未见表达，在各级别胶质瘤中均有表达，且差异有显著性（P〈0．01）；CD133表达量与肿瘤的恶性程度呈正相关（P〈0．01）。结论检测胶质瘤CD133表达水平有助于评价肿瘤的生物学行为，并为针对肿瘤干细胞的靶向治疗提供参考依据。     

脑微血管内皮细胞和脑肿瘤干细胞共培养的体外实验研究

目的 研究体外培养条件下,脑微血管内皮细胞(brain microvascular endothelial cells,BMECs)对脑肿瘤干细胞(braintumor stem cells,BTSCs)增殖、自我更新及分化功能的影响.方法 应用Transwell小室建立BMECs与BTSCs共培养模型,并建立对照组,共培养14 d后,测量肿瘤球(brain tumor sphere,BTS)直径大小,检测BTSCs增殖曲线,测定单细胞克隆形成率.在含血清的培养基中培养10 d后,行CD133、Nestin、GFAP、DAPI免疫荧光染色,计数两组的CD133、Nestin、GFAP染色的细胞数及同一视野的DAPI染色细胞核数,观察两组之间的差异.结果 共培养组BTS直径是对照组的5.05倍,增殖快,共培养组有61.4%能形成下一代BTSCs,而对照组为39.0%.在含血清的培养基中培养10 d后,共培养组的GFAP阳性率较对照组低,而CD133、Nestin阳性率较对照组高.结论 BMECs能够促进BTSCs增殖、自我更新能力,保持BTSCs未分化状态.     

人脑胶质瘤中肿瘤干细胞的体外培养及生物学特性

背景：有研究者提出，脑内存在少量正常的神经干细胞能够向肿瘤组织迁移。这需要对从胶质瘤体外培养得到的肿瘤干细胞与正常的神经干细胞进行鉴别。 目的：从人脑胶质瘤组织中分离脑胶质瘤干细胞进行体外培养，并对其干细胞特性加以鉴定，观察脑肿瘤干细胞的生长特性。 设计、时间及地点：细胞学观察实验，于2007-02/12在解放军第四军医大学细胞工程研究中心完成。 材料：7份肿瘤标本来源于胶质瘤患者，间变性星形细胞瘤标本3份，多形性胶质母细胞瘤标本4份。 方法：将获取的胶质瘤细胞置于含2%B27、表皮细胞生长因子、碱性成纤维细胞生长因子、左旋谷胺酰氨、胰岛素、青霉素和链霉素生长因子的无血清DMEM/F12培养基中，重新悬浮为单细胞悬液，以1×108 L-1接种于含有B27、表皮细胞生长因子及碱性成纤维细胞生长因子的DMEM/F12培养基中培养分离培养肿瘤干细胞球。取第5代的肿瘤干细胞球，离心后除去原培养基，用含有体积分数为0.10胎牛血清的DMEM/F12培养基接种于放置有多聚赖氨酸包被盖玻片的小平皿中，观察肿瘤干细胞分化情况。 主要观察指标：利用细胞免疫荧光及组织免疫组织化学法检测脑肿瘤干细胞在细胞培养或组织切片中CD133及巢蛋白表达。 结果：在胶质瘤中存在一定量的细胞能在无血清培养基中存活并悬浮生长，并增殖形成克隆性脑肿瘤干细胞球，细胞核较大，核质比例高，具有肿瘤细胞的特性，与原肿瘤组织标本的苏木精-伊红染色比较，肿瘤干细胞分化后的子代细胞中大部分与胶质瘤细胞相似。原代及传代脑肿瘤干细胞表达神经干细胞的特异性标志物巢蛋白和CD133。 结论：人脑胶质瘤中存在一定量的肿瘤干细胞，并能在体外将其分离培养，能够自我更新增殖、诱导分化，表达神经干细胞标志物CD133。     

Nanog基因在脑肿瘤干细胞中的表达及意义

目的 探讨Nanog基因在脑肿瘤干细胞(BTSCs)的表达以及生物学意义.方法 无血清悬浮培养法从U87胶质瘤细胞株分离培养BTSCs.免疫细胞化学染色和RT-PCR方法检测U87肿瘤细胞及其BTSCs中Nanog的表达,双重免疫细胞化学染色法检测Nanog/CD133共表达情况.结果 在U87胶质瘤细胞株中成功分离培养出BTSCs,Nanog蛋白在U87肿瘤细胞和BTSCs中的阳性率分别为(64.1±18.2)%和(97.2±1.8)%,且Nanog+/CD133+细胞共表达于部分细胞中;Nanog mRNA相对含量在U87肿瘤细胞和BTSCs中分别为0.3851±0.0771和0.6032±0.1223,差异有统计学意义(P＜0.05).结论 U87细胞株中存在BTSCs.Nanog在U87细胞株中高表达,在BTSCs中表达水平高于U87肿瘤细胞且Nanog与CD133存在共表达,表明Nanog与BTSCs关系密切.

Abstract：

Objective To detect the expression of Nanog in glioma cell line U87 and the relationship with BTSCs.Methods BTSCs were isolated from glioma cell line U87 and cultured in simplified serum-free neural stem cell medium by nanosphere suspension culture method spheres,and purified continuously through the monoclonal formation experiment.The immunofluorescence staining of cells was employed to identify the BTSCs and differentiated cells.The expression of Nanog mRNA was examined by RT- PCR and Nanog protein was detected by immunocytochemistry in U87 and BTSCs respectively.Double immunocytochemistry staining was used to detect the co- expressions of Nanog/CD133.Methods BTSCs were isolated ,cultured and purified successfully from glioma cell line U87.Both Nanog mRNA and protein were expressed in U87 and BTSCs.The expression rate of immunopositive cells was (64.1 ±18.2)% in U87 and (97.2±1.8)% in BTSCs respectively(t =5.719,P =0.000).The Nanog+/CD133+ cells could be found co-expressed in U87 and BTSCs by using double immunocytochemistry s taining.The relative level of Nanog expression was 0.3851 ±0.0771 in U87 and0.6032±0.1223 in BTSCs(t =4.770,P =0.000).Conclusion BTSCs exist in glioma cell line U87 in vitro.The levels of Nanog expression in BTSCs were higher than that in U87.Nanog expression was associated with the genesis and differentiation state of glioma.The overexpression of Nanog and co- expression of Nanog/CD133 showed that it might contribute to the existence of BTSCs,which lay a foundation to the further explore its role in biological behaviour of glioma.Expression of Nanog in U87 indicated the close relationship between glioma and stem cell,and suggested Nanog may play a critical role in the development of glioma.     

胶质母细胞瘤肿瘤干细胞的分离培养与生物学特性研究

目的从人脑胶质母细胞瘤中分离培养脑肿瘤干细胞（brain tumorstem cells,BTSC）,并研究其生物学特性。方法利用无血清培养基和悬浮培养方法,从6例人胶质母细胞瘤标本中分离培养BTSC,并通过单克隆形成实验观察脑肿瘤干细胞球（brain tumor sphere,BTS）的形成过程。将BTSC接种于含血清培养基,观察其在体外的分化特点。将BTSC子代分化细胞更换培养条件,观察其在无血清培养基中的逆向分化现象。应用细胞免疫荧光染色对BTSC及其分化细胞进行鉴定。结果在人胶质母细胞瘤中成功分离出BTSC,其在无血清培养基中呈悬浮球状生长,具有很强的自我更新和增殖能力;免疫荧光显示其表达CD133。BTSC在含血清培养基中发生贴壁分化。分化后的子代细胞可表达CD133、神经元特异性烯醇化酶（NSE）和胶质纤维酸性蛋白（GFAP）。BTSC子代分化细胞在无血清条件下培养,能够再次增殖形成BTS,呈逆向分化现象。结论人胶质母细胞瘤中存在BTSC,其具有自我更新、无限增殖、多向分化以及逆向分化等生物学特性。     

脑胶质瘤干细胞鉴定与增殖及耐药特性的实验研究

目的 从胶质瘤组织中分离和培养出肿瘤干细胞,并初步探讨其生长特性. 方法 收集脑胶质瘤手术标本并获取细胞,用含有表皮生长因子(EGF)、白血病细胞抑制因子(LIE)和碱性成纤维生长因子(bFGF)的无血清培养液原代培养,再经免疫磁珠分离得到CD133+细胞.并用免疫细胞化学技术检测CD133、NSE和GFAP在细胞中的表达以鉴定CD133+细胞,比较不同恶性级别胶质瘤组织的CD133+细胞生长情况,并用CCK8法比较CD133+和CD133-细胞对替尼泊苷(VM-26)的耐药性. 结果 从胶质瘤组织中成功分选获得CD133+细胞,这些细胞能自我更新,增殖,并分化成NSE+和GFAP+的细胞.恶性度高的胶质瘤组织中CD133+细胞生长速度明显比低级别中的CD133+细胞快,且CD133+细胞在含有VM-26培养基中的存活细胞数显著多于CD133-细胞(P＜0.05). 结论 胶质瘤组织中存在肿瘤干细胞,这类细胞具有很强的耐药性,高恶性度胶质瘤组织中的CD133+细胞具有更强的增殖能力.