痘苗病毒转移载体pSC65-HPV18 E6、E7的构建及鉴定

目的　构建及鉴定含有人乳头瘤病毒（human papillomavirus, HPV）18型E6、E7基因的痘苗病毒转移载体pSC65-HPV18 E6、E7。方法　以HPV18型全基因质粒为模板,PCR扩增HPV18 E6、E7基因,克隆到痘苗病毒转移载体pSC65中,获得重组转移载体pSC65-HPV18 E6、E7。重组转移载体转化大肠杆菌,挑取孤立菌落PCR初步筛选。选择阳性菌落提取质粒,酶切及测序鉴定。结果　阳性菌落质粒酶切结果显示有340bp、500 bp大小的目的基因片段,表明为重组转移载体。测序结果证实重组转移载体包含HPV18 E6、E7基因。 结论　成功构建包含HPV18 E6、E7基因的痘苗病毒转移载体pSC65-HPV18 E6、E7,研究结果为进一步构建包含HPV18 E6、E7基因的重组痘苗病毒奠定基础。     

HPV16地方分离株E6基因的克隆与原核表达研究

目的克隆人乳头瘤病毒（HPV16E6）基因并在大肠埃希菌中表达，对表达产物进行鉴定。方法用PCR方法从克隆质粒pUC19-HPV16E6E7中扩增HPV16E6基因，采用定向克隆构建pQE30-HPV16E6原核表达质粒．利用酶切和序列测定鉴定重组质粒。将pQE30-HPV16E6转化大肠埃希菌BL21（DE3），建立重组工程菌pQE30-HPV16E6／BL21（DE3）。经异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）诱导，SDS—PAGE分析蛋白表达情况，利用Western blot鉴定抗原特异性。结果PCR产物470bp，重组质粒经酶切和序列测定证实构建正确。SDS—PAGE分析在18×10^3处有蛋白条带出现，与预期一致。Western blot分析证实目的条带与HPV16E6抗体有特异性反应。结论成功构建了HPV16E6基因的基因工程菌株，能高效表达E6蛋白，表达蛋白具有良好的免疫反应性。     

查菲埃立克体28kD表面抗原基因的克隆与表达

目的 克隆和高效表达查菲埃立克体（Ehrlichia chaffensis)28kD表面抗原基因。方法 依据书籍的查菲埃立克体28kD表面抗原基因设计引物，用PCR从查菲埃立克体基因组中克隆该基因片段（531bp），再将该基因片段定向插入表达载体（PinPoint^TMXa-3）中，然后将该重组质粒转化E.coli JM109细胞。结果 经SDS-PAGE分析，转化子所产生的融合蛋白分子量为32kD，与预期的结果相一致；在37℃用0.1Mn IPTG诱导转化子12h，融合蛋白量达到细菌总蛋白量的35.8%。结论 查菲埃立克体28～kD表面抗原基因在E.coli JM109细胞内得到高效率表达，从而为该抗原的大量制备奠定了基础。     

结核分枝杆菌ESAT-6蛋白的表达与纯化

目的构建结核分枝杆菌esat-6基因原核表达载体,使其在大肠杆菌中表达融合重组蛋白,并纯化。方法用PCR方法从结核分枝杆菌H37Rv基因组中扩增出esat-6基因片段,克隆至pMD18-T载体,PCR筛选阳性克隆并测序;用限制性内切酶消化后,目的片段亚克隆至表达载体pGEX-4T-2,构建pGEX-esat-6重组质粒,将其转化入大肠杆菌JM109;PCR和双酶切鉴定转化菌落;将阳性菌株经IPTG诱导,SDS-PAGE和免疫印迹分析靶蛋白的表达;用谷胱甘肽-琼脂糖亲合层析法纯化融合蛋白。结果PCR扩增出esat-6 288bp的基因,克隆到pMD18-T载体中,经测序与GenBank中序列一致;随后亚克隆到表达载体pGEX-4T-2构建重组表达质粒,在JM109中表达了ESAT-6融合蛋白,表达的蛋白能被GST免疫血清识别;通过亲和层析纯化获得的蛋白能被结核病人血清识别。结论成功构建esat-6重组表达质粒,该质粒在JM109中表达ESAT-6融合蛋白,并获得较纯的蛋白。     

3株弓形虫GRA7基因的保守性鉴定

目的 比较弓形虫不同地理株(RH株、ZS2株、GT株)GRA7基因的异同。方法 从弓形虫不同地理株的基因组DNA中扩增出GRA7基因，对目的基因用限制性内切酶(Esp3I、CfrI、MboI)酶切并比较。将目的基因克隆至pGEX-4T-1质粒，转化大肠埃希菌JM109，进行测序并比较。结果 PCR扩增出3株弓形虫的目的基因片段，大小均在500～750bp之间；经3种限制性内切酶酶切，其大小均与理论值相符；3株弓形虫GRA7基因序列相同。结论 弓形虫不同地理株GRA7基因具有高度保守性。     

基于SSUrRNA基因序列的间日疟原虫LAMP检测技术的建立

目的克隆分析间日疟原虫小亚基亚单位核糖体核糖核酸(SSUrRNA)特异性基因序列,建立间日疟原虫环介导等温扩增(LAMP)检测技术。方法针对间日疟原虫SSUrRNA种特异性基因序列设计1对引物,采用聚合酶链反应(PCR)从血样核酸提取物中扩增SSUrRNA基因片段,纯化后与pGEM-Teasy载体连接,构建重组质粒并转化大肠埃希菌JM109,PCR与双酶切鉴定筛选阳性克隆并测序,设计6条寡核苷酸片段,LAMP检测感染血样中间日疟原虫DNA,扩增产物作琼脂糖电泳分析或直接荧光染色肉眼观察。结果间日疟原虫SSUrRNA基因扩增片段大小约为235 bp;阳性克隆重组质粒插入的SSUrRNA基因扩增片段含有235个核苷酸,与GenBank中的Sal-1株、Belem株间日疟原虫相同序列进行比对,同源性为100%,与PV2008/TR/DEL株、PVK1294株、E1 Salvador株的同源性均为99%,与三日疟原虫、卵形疟原虫及恶性疟原虫的序列同源性均低于95%。将含有SSUrRNA靶基因的重组质粒以蒸馏水倍比稀释后做LAMP,试验的灵敏度为10 copy/μl;特异性检验显示间疟原虫患者血样DNA呈阳性反应,恶性...     

铜绿假单胞菌重组Bb-OprF疫苗构建及鉴定

目的构建和鉴定铜绿假单胞菌重组双歧杆菌(rBb) OprF疫苗。方法以铜绿假单胞菌PAOl标准株提取总RNA为模板,自行设计引物,RT PCR扩增获得OprF抗原编码基因,经酶切、连接定向克隆入大肠埃希菌 双歧杆菌穿梭表达载体pGEX 1λT,构建重组质粒pGEX OprF。转化E.coli BL21(DE3)感受态细胞,抽提质粒行酶切电泳和测序验证后,电穿孔转化到Bb中,构建铜绿假单胞菌rBb OprF疫苗,抽提质粒进行PCR扩增鉴定。结果RT PCR扩增出1 016bp的OprF编码基因;重组质粒经双酶切鉴定,切出4 947bp的载体片段和10 16bp的目的基因片段;以rBb抽提质粒为模板进行PCR扩增可得到1 016bp的oprF基因片段。结论成功构建了铜绿假单胞菌rBb OprF疫苗,为该疫苗的进一步研究奠定基础。     

恶性疟原虫FCC1／HN（CQS）株Pfmdr1、Cgl基因T—A克隆及序列分析

目的：将恶性疟原虫FCC1／HN株（CQS）Pfmdrl和Cgl全基因编码区克隆入测序载体，测定其序列，为以后研究其为疟原虫耐药性的关系奠定基础。方法：利用PCR扩增技术，分3个片段从恶性疟原虫FCC1／HN株基因组DNA中，特异扩增Pfmdrl全基因编码序列；分2个片段特异扩增Cgl基因编码序列。扩增产物经纯化回收后，T－A克隆入测序载体pMD18-T，转化大肠杆菌（E.coli)jm109，筛选阳性克隆，并进行双酶切及PCR扩增鉴定，获得阳性重组质粒，用Sanger双脱氧链终止法进行DNA测定。结果：CQS FCC1／HN株Pfmdrl基因序列与CQS Fc27株同源性高，全长4248bp，编码1415个氨基酸；测得Cgl基因全长为2820bp，编码939个氨基酸，存在串联α重复序列。结论：恶性疟原虫FCC1／HN（CQS）株Pfmdrl和Cgl全基因编码序列的测定，为以后研究耐药性虫株的上述基因以及它们与疟原虫耐药性的关系奠定基础。     

白细胞介素18基因工程表达方法

目的探讨人白细胞介素(IL)-18基因工程表达方法。方法复苏含有p GEX-IL-18重组体质粒的E.coli JM109,并进行增菌培养;利用质粒提取试剂盒提取p GEX-IL-18重组体质粒,通过琼脂糖凝胶电泳、基因片段测序、基因库比对等技术鉴定IL-18基因序列;将提取得到的p GEX-IL-18重组体质粒转化到DH5α,制成高效表达的IL-18原核表达系统。结果含有p GEX-IL-18重组体质粒的E.coli JM109增菌培养后提取质粒,酶切电泳与Marker比对,证实质粒大小2.7 kb;经测序并利用基因库比对证实,所制备的DNA片段符合IL-18基因序列。将p GEX-IL-18转染DH5α细菌内,并经过蓝白筛选系统进行筛选,证实转染成功。结论经过系统的实验研究,成功建立了IL-18的基因工程表达系统。IL-18具有重要的生物学功能,在后续的科研工作中将对IL-18的应用价值进行系统研究。     

SARS冠状病毒S蛋白部分序列2的克隆与表达

目的 构建SARS冠状病毒棘突蛋白部分序列2(S2)的原核表达质粒，分析其在大肠杆菌中的表达状况。方法 采用逆转录聚合酶链式反应技术从SARS冠状病毒基因组中扩增出编码S蛋白的第2170到2814位碱基的基因片段，克隆至pMD18-T载体，PCR筛选阳性克隆并测序。用限制性内切酶消化后，目的片段亚克隆至表达载体pGEX-4T-2，转化大肠杆菌．JM109，PCR和双酶切鉴定转化菌落。将阳性菌落经IPTG诱导，SDS—PAGE和免疫印迹分析靶蛋白的表达。结果 RT—PCR扩增出S2特异片段，经测序与GenBank比对存在1处碱基突变。S2基因片段亚克隆至表达载体pGEX-4T-2构建成重组表达质粒，并在JM109中表达了S2融合蛋白。结论 成功构建了SARS冠状病毒S2的重组表达质粒，并在大肠杆菌中表达了S2融合蛋白。     

弓形虫棒状体蛋白2和膜表面蛋白1融合基因的克隆与表达

目的 进行弓形虫棒状体蛋白2（ROP2）和膜表面蛋白1（P30）融合基因的克隆与表达，为弓形虫ROP2?鄄P30基因工程复合抗原的制备做准备。 方法 半套式PCR扩增编码弓形虫P30的基因片段，克隆至已构建成功的重组质粒pUC119/ROP2中，经PCR和酶切鉴定正确的重组质粒pUC119/ROP2-P30再以SacⅠ/HindⅢ双酶切克隆至表达载体pET28b上，鉴定正确的重组质粒pET28b/ROP2-P30转化大肠埃希菌表达菌株BL21-Codon Plus（DE3）-RIL，经异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）诱导表达。 结果 从弓形虫RH株基因组DNA中扩增出700 bp P30基因片段，成功构建重组质粒pET28b/ROP2-P30，该质粒经PCR和酶切鉴定，与预期结果一致，并在大肠埃希菌中高效表达，产生相对分子质量（Mr）约为 69 000的重组目的蛋白。 结论 弓形虫ROP2和P301融合基因克隆成功，并表达出预期的复合重组蛋白ROP2-P30。     

粉尘螨6类变应原（Der f6）的克隆表达、纯化及免疫学特性鉴定

目的 构建粉尘螨6类变应原（Dermatophagoides farinae，Der f6）基因的高效原核表达载体，并进行表达、纯化及生物学功能分析。 方法 根据Der f6基因已知序列，设计1对引物，通过对纯培养的粉尘螨提取总RNA，采用RT-PCR方法扩增出Der f6基因片段，PCR产物克隆入pMD18-T载体，转化大肠埃希菌（E.coli Top10），经PCR和酶切鉴定并测序。将上述所得阳性克隆菌株扩大培养，碱裂解法提取质粒，所得重组质粒pMD18-T-Der f6和空质粒pET-24a同时用限制性内切酶EcoRⅠ和XhoⅠ双酶切，经纯化后连接并转化至E.coli Top10。构建的重组质粒pET24a-Der f6经PCR、酶切和测序鉴定后，再转化至E.coli BL21（DE3）， 异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）诱导表达。用十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）和蛋白质印迹法（Western blotting）鉴定其表达效果，用Ni+离子亲和层析柱纯化重组质粒pET24a-Der f6表达产生的组氨酸重组蛋白。 结果 构建了重组质粒pMD18-T-Der f6和pET24a-Der f6。SDS-PAGE 结果表明Der f6基因在E.coli Bl21(DE3）中获得良好的表达，所得重组蛋白相对分子质量(Mr) 为31 000, 与理论值一致, 经亲和层析纯化后，SDS-PAGE 结果显示单一条带。该蛋白以尘螨过敏患者血清进行Western blotting, 结果表明具有良好的IgE结合活性。 结论 克隆、表达并纯化了具有良好尘螨致敏患者IgE结合活性的Der f6。     

球形芽胞杆菌S层蛋白基因的克隆及原核表达

目的克隆球形芽胞杆菌S层蛋白的编码基因,实现其原核表达并纯化表达产物。方法提取球形芽胞杆菌菌体基因组DNA,根据GenBank公布的核酸序列设计并合成引物,扩增S层蛋白编码基因sllB,与pMD19-T载体连接;测序验证后,构建原核表达质粒pET28a(+)-sllB并转化BL21(DE3)中,经IPTG诱导表达,SDS-PAG和Westernblot鉴定表达产物,亲和柱层析纯化重组蛋白。结果扩增获得S层蛋白编码基因sllB全长(3 306bp),与参考序列同源性为97.5%。构建的原核表达质粒pET28a(+)-sllB转化BL21(DE3)后,SDS-PAGE显示表达蛋白的分子质量为116ku,与理论值相符。Western blot显示其全蛋白、可溶性蛋白和不溶性蛋白中均被鼠抗Penta-His抗体识别。结论获得了球形芽胞杆菌S层蛋白编码基因sllB,并实现了其原核表达。     

弓形虫RH株膜表面抗原2全长基因的高效表达与抗原性分析

目的　构建原核重组表达质粒pET23aSAG2,并在大肠埃希菌中实现高效表达,以及检测表达产物的抗原性。　方法　PCR扩增SAG2编码基因目的片段,琼脂糖凝胶电泳回收纯化,克隆至pMD18T载体,转化大肠埃希菌DH5α。测序后亚克隆至表达质粒载体pET23a,构建重组表达质粒pET2 3aSAG2,转化大肠埃希菌DH5α。筛选阳性克隆,经限制性酶切分析鉴定后,转化大肠埃希菌BL21(DE3),以异丙基 βD硫代半乳糖苷诱导表达。十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS PAGE)与免疫印迹分析表达产物。　结果　PCR扩增出约500bp的SAG2编码基因目的片段,与预期片段大小相符,经测序鉴定无基因突变;所构建的pET23aSAG2重组表达质粒阳性克隆经PCR与双酶切鉴定,与预期结果一致;含有pET23aSAG2重组质粒的大肠埃希菌BL21(DE3)诱导后得到了高效表达,SDS PAGE显示表达产物约Mr19000;免疫印迹结果表明表达产物具有良好的抗原性。　结论　成功构建了pET23aSAG2表达质粒,实现了全长成熟SAG2蛋白在大肠埃希菌中的高效表达;表达产物具有良好的抗原性。     

弓形虫RH株致密颗粒蛋白GRA4基因的克隆与表达

目的 克隆和表达弓形虫RH株致密颗粒蛋白GRA4基因。方法 根据GRA4基因序列,设计合成一对引物,用聚合酶链式反应(PCR)方法从弓形虫RH株基因组DNA中扩增GRA4基因片段,插入pMD18-T载体,并转化大肠杆菌JM109,经PCR、双酶切、测序验证后,将GRA4基因片段定向亚克隆到载体pGEX-4T-2中构建原核表达重组质粒pGEX-4T-2.GRA4,重组子在E.coli BL21中经IPTG诱导表达,并对表达产物进行SDS-PAGE及Westem blot分析。结果 从弓形虫RH株基因组DNA中扩增出GRA4基因片段并诱导表达出能被兔抗弓形虫血清识别的重组GRA4蛋白。结论 成功构建和表达了弓形虫pGEX-4T-2-GRA4重组质粒,为弓形虫病诊断抗原和疫苗的研究奠定了基础。     

轮状病毒VP4蛋白与肠产毒性大肠杆菌热稳定肠毒素蛋白的融合表达

利用DNA重组技术将轮状病毒（Rotavirus RV)VP4蛋白主要抗原编码区基因与产肠毒素大肠杆菌(Enteotoxigenic Escherichia coli ETEC)热稳定肠毒素（Heat-stable enteotoxin Escherichia coli ST)基因融合，插入原核表达质粒pET-28a( )中，经PCR、酶切、测序分析表明已将vp4-st片段克隆入PET－28a( ),而且具有正确的读码框和方向性，正确构建了VP4－ST的融合表达载体pET28-VP4-ST。表达质粒转化受体菌BL21（DE3）plysS，取经IPTG诱导后表达的目的蛋白进行SDS－PAGE、凝胶薄层扫描分析。结果表明：表达的目的蛋白以包涵体的形式存在，大小约40．2kDa，表达的蛋白量占菌体总蛋白的13．048％。     

C2株蓝氏贾第鞭毛虫组蛋白H3基因的克隆表达与基因分析

目的 克隆表达C2株蓝氏贾第鞭毛虫H3组蛋白基因,与WB株蓝氏贾第鞭毛虫进行同源分析,构建C2株蓝氏贾第鞭毛虫H3组蛋白分子进化树。方法 PCR扩增获取H3组蛋白基因,构建pGM-T-H3重组载体,转化E. coli TOP10感受态宿主细胞,挑选阳性克隆并进行序列分析,利用限制性内切酶NcoⅠ和 XhoⅠ构建pET28a(+)-H3重组载体,转化E. coli Rosetta( DE3),IPTG诱导组蛋白H3表达,Western blotting鉴定表达,与美国WB株蓝氏贾第鞭毛虫及模式生物H3组蛋白基因和蛋白序列进行同源分析。结果 成功克隆表达C2株蓝氏贾第鞭毛虫H3组蛋白基因,同源比对结果显示C2株蓝氏贾第鞭毛虫基因序列与美国WB株完全一致,但与其他现存真核生物亲缘关系较为疏远。结论 C2株蓝氏贾第鞭毛虫H3组蛋白分子进化树分析表明贾第虫H3组蛋白基因在进化过程中与其他物种分化较早,本研究结果为进一步研究蓝氏贾第鞭毛虫的生物进化地位提供有价值的实验资料。     

阴道毛滴虫病毒衣壳蛋白基因cap2037的克隆与表达

目的对阴道毛滴虫病毒衣壳蛋白基因的克隆与原核表达。方法提取阴道毛滴虫总核酸为模板，根据所克隆的阴道毛滴虫病毒部分序列和GenBank中发表的阴道毛滴虫病毒TvV—T1序列设计一对引物，经RT—PCR得到与预计大小一致的PCR特异性产物，将其克隆到pMD-18T载体后测序，并与GenBank中核苷酸序列进行同源性搜索与分析，再将其克隆至表达载体pET28a。并以异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）诱导表达。结果目的基因片段长度为2037bp，与阴道毛滴虫病毒T1株（U08999）的同源性最高为82．9％，构建原核表达载体pET—Cap2037；IPTG诱导后，SDS—PAGE显示表达产物的大小约75kDa。结论成功克隆出阴道毛滴虫病毒衣壳蛋白基因序列，与TVV—T1株序列有82．9％的同源性，经IPTG诱导，SDS-PAGE分析表明，75kDa蛋白基因在大肠杆菌BL21（DE3）中得到高效表达。     

弓形虫棒状体蛋白18的原核表达及免疫分析

目的 克隆刚地弓形虫ROP18基因,进行原核表达及重组蛋白的免疫分析。方法 提取弓形虫RH株基因组DNA,经PCR获得ROP18基因片段,经双酶切分别连入原核表达载体pET-28a(+)和pET-32a(+),构建重组表达载体pET28a-ROP18和pET32a-ROP18,并转化大肠杆菌BL21(DE3)。IPTG诱导表达后,收集菌体进行SDS-PAGE电泳及Western-blot检测。结果 PCR得到约1 665 bp目的基因片段,单、双酶切及PCR鉴定结果显示成功构建重组表达载体pET28a-ROP18和pET32a-ROP18;经IPTG诱导后,ROP18基因在大肠杆菌中高效表达;SDS-PAGE电泳及Western-blot分析显示,pET28a-ROP18在相对分子质量约60 kD的位置出现目的蛋白条带,pET32a-ROP18在相对分子质量约83 kD的位置出现目的蛋白条带,均与理论值相符;Western-blot结果显示重组蛋白与弓形虫慢性感染小鼠血清具有特异免疫反应性。结论 成功克隆和表达了ROP18基因,所表达的重组蛋白具有免疫效应,为其功能研究奠定基础。     

德国小蠊变应原Bla g2的克隆、表达及其免疫学特性鉴定

目的获得大量具有良好IgE结合活性的Bla g2重组变应原,以用于变态反应性疾病特异性诊断及免疫治疗的研究。方法提取德国小蠊总RNA,采用RT-PCR的方法扩增Bla g2片段,产物连接进入pMD18-T载体。挑取重组子,用NdeⅠ和NotⅡ双酶切后将目的片段亚克隆入pET24a(+),经IPTG诱导表达后,通过Ni2+亲和层析柱对重组变应原进行纯化,并采用Western-blot检测其免疫学结合活性。结果扩增出编码328个氨基酸的长度为984个碱基对的核苷酸片段,序列分析结果和GenBank上的基因序列(U28863)完全一致。重组变应原在E.coliBL21 star中得到高效表达,具有良好的反应原性。结论成功构建了德国小蠊变应原Bla g2的原核表达载体,并纯化出具有免疫原特性的重组蛋白,为进一步开展Bla g2蛋白和重组疫苗研究奠定了基础。