滇重楼丛枝菌根与次生代谢产物甾体皂苷的关系初探

目的:考察滇重楼根际丛枝菌根真菌的侵染率、孢子密度与其次生代谢产物甾体皂苷含量的相关性。方法:采用Phillips和Hayman染色法挑选滇重楼丛枝菌根,采用Gendemann湿筛倾析法获得AMF孢子并进行计数。同时,采用HPLC测定滇重楼中4种甾体皂苷(重楼皂苷Ⅰ,Ⅱ,Ⅵ,Ⅶ)的含量。结果:滇重楼根际丛枝菌根真菌侵染率与其孢子密度呈显著的正相关,而侵染率、孢子密度与其根茎总甾体皂苷含量呈一定的正相关。结论:丛枝菌根真菌是影响滇重楼活性成分含量的重要因素。     

接种不同AM真菌对滇重楼菌根侵染率和入药品质的影响

通过室温盆栽接种试验与室内分析相结合的方法,观察灭菌土壤条件下接种28种丛枝菌根(AM)真菌对药用植物滇重楼根系AM真菌侵染能力和入药质量的影响。结果显示,与对照组(CK)相比,接种外源AM真菌对滇重楼根系AM真菌的孢子密度、侵染率、侵染强度具有调控(增减)作用,增强根内菌丝的琥珀酸脱氢酶(SDH)和碱性磷酸酶(ALP)活性,从而提高滇重楼菌根生活力。AM真菌诱导子处理后,不同AM真菌对滇重楼根茎中不同甾体皂苷的影响有所差异,AM真菌的施用能够提高滇重楼的药用品质,但在实验期间未造成滇重楼甾体皂苷质量的变异。实验结果表明,滇重楼与AM真菌之间的共生关系具有一定的相互选择性,近明球囊霉Claroideoglomus claroideum和瑚状盾巨囊霉Racocetra coralloidea是最适宜滇重楼大田栽培时推广应用的优良接种菌剂。     

基于生物量和活性成分的滇重楼幼苗优良菌根真菌筛选

目的以菌根生活力、根茎生物量和活性成分为指标,筛选适宜滇重楼幼苗生长发育的优良丛枝菌根(arbuscular mycorrhizal,AM)真菌。方法以灭菌土壤为生长基质,采用室温盆栽试验,研究接种28种外源性AM真菌对滇重楼幼苗菌根生活力、根茎生物量和重楼皂苷产量(单株幼苗所含的重楼皂苷量、重楼皂苷含量与幼苗生物量的乘积)、根茎重楼皂苷与核苷含量的影响。结果接种的28种AM真菌与滇重楼幼苗均形成了共生体系并且发育良好,并能提高滇重楼幼苗菌根生活力,但具有偏好性。大多数AM真菌处理组能提高滇重楼根茎生物量,促进了滇重楼幼苗重楼皂苷和重楼核苷的积累,表现为重楼皂苷含量和产量的提高。菌根形成对滇重楼幼苗次生代谢的影响还表现在重楼皂苷和重楼核苷的器官分配上,菌根化滇重楼幼苗须根中4种重楼皂苷总量具有高于根茎的趋势,而根茎中9种核苷总量明显高于须根。结论本研究中不同AM菌株的表现,对进一步提高滇重楼幼苗生物量和品质的菌株筛选具有重要的借鉴作用,巨大巨孢囊霉Gigasporagigantea、美丽盾巨孢囊霉Scutellospora calospora、沾屑多孢囊霉Diversispora spurca、异配盾孢囊霉Dentiscutata heterogama、沙荒球囊霉Septoglomus deserticola、薄壁两性囊霉Ambispora leptoticha可望能作为培育滇重楼菌根化苗的理想菌株。     

丛枝菌根真菌对滇重楼内源激素的影响

目的初步探索接种不同外源性丛枝菌根(AM)真菌对滇重楼Paris polyphylla var.yunnanensis幼苗内源激素水平变化规律。方法以灭菌土壤为生长基质,于室温盆栽条件下对滇重楼新鲜种子与28种AM真菌共培养后采样,采用HPLC测定和比较分析各处理组滇重楼根茎和须根内源激素玉米素核苷(ZR)、赤霉素(GA)、吲哚乙酸(IAA)和脱落酸(ABA)的量。结果接种外源性AM真菌能提高滇重楼幼苗菌根侵染率和成苗率,AM真菌对滇重楼幼苗根茎和须根中ZR、GA、IAA、ABA 4种激素量的变化表现出不同的规律,但具有偏好性。与对照组相比,整体上接种AM真菌处理组根茎中ZR、GA量呈现增长的趋势,IAA量变化规律不明显,而ABA量呈现减少的趋势,接种AM真菌处理组根茎中ABA/ZR、ABA/GA、ABA/IAA值呈现减少的趋势,但须根与根茎的变化趋势相反。结论 AM真菌能促进滇重楼幼苗的存活率,且不同AM真菌菌株影响滇重楼内源激素量。     

混合丛枝菌根真菌接种时期对滇重楼幼苗内源激素含量的影响

目的研究混合丛枝菌根(AM)真菌不同接种时期对滇重楼Paris polyphylla Smith var. yunnanensis幼苗内源激素含量的影响。方法室内盆栽法,分别将滇重楼种子、1年生苗、2年生苗接种混合AM真菌,于灭菌土壤基质中进行共生培养,采用高效液相色谱法测定内源激素玉米素核苷(ZR)、赤霉素(GA)、吲哚乙酸(IAA)和脱落酸(ABA)含量。结果混合AM真菌对不同时期,不同种源的滇重楼根状茎和根中内源激素ZR、GA、IAA、ABA含量变化的影响不尽相同。整体上,与对照组比较,野生种源和栽培种源滇重楼根状茎和根的ZR和GA内源激素含量均呈增加趋势,ABA含量均呈减少趋势。滇重楼根状茎和根中IAA/ABA、GA/ABA、ZR/ABA增大。结论 1年生苗期接种S2、S6型混合AM真菌,对促进滇重楼幼苗根状茎和根生长的综合效果最佳。     

不同丛枝菌根真菌组合对滇重楼光合生理和化学成分的影响

目的:研究接种不同丛枝菌根(AM)真菌组合对滇重楼幼苗的生长发育和入药品质的影响,为培育优质滇重楼药材提供参考.方法:通过室温盆栽接种试验方法,在灭菌栽培土壤中分别接种9组不同AM真菌组合,以不接种为空白组,观察不同AM真菌组合对滇重楼幼苗的根系侵染率、光合参数、生理指标及化学成分等的影响.结果:接种外源AM真菌组合显...     

AM真菌对滇重楼光合参数及生理指标的影响

通过室温盆栽接种试验与室内分析相结合的方法,观察灭菌土壤条件下接种28种丛枝菌根(AM)真菌对滇重楼光合参数和生理生化指标的影响。结果表明,滇重楼与AM真菌形成了良好的共生关系。AM真菌诱导处理后,不同AM真菌对滇重楼叶片的光合参数和生理生化指标的影响有所差异,AM真菌的施用能够提高滇重楼叶肉细胞的光合作用强度,提高滇重楼叶片可溶性蛋白和可溶性糖含量及保护酶活性,增强了滇重楼抗不利环境的能力,促进了滇重楼的生长,而滇重楼与AM真菌之间存在一定的相互选择性。从综合接种效应来看,瑚状盾巨囊霉Racocetra coralloidea、美丽盾巨孢囊霉Scutellospora calospora、近明球囊霉Claroideoglomus claroideum、透明盾巨孢囊霉S. pellucida和明球囊霉Rhizophagus clarus是最适宜滇重楼大田栽培时推广应用的优良备选菌株。     

不同丛枝菌根真菌对滇重楼幼苗根际土壤养分的影响

目的:阐明不同丛枝菌根(arbuscular mycorrhizal,AM)真菌与滇重楼共生培养条件下,AM真菌对滇重楼幼苗根际土壤养分,AM真菌侵染率及根茎总皂苷的影响。方法:通过室温盆栽接种试验与数据分析相结合的方法,分析滇重楼实生苗接种外源性AM真菌后处理组与不接种对照(CK)组根系侵染率、根际土壤养分和根茎总皂苷含量的变化,以及根际土壤因子与其侵染率和总皂苷含量的关系。结果:与CK组相比,接种AM真菌处理组根系侵染率显著增强(P0.05),处理组滇重楼根际土壤中易提取球囊霉素含量、总球囊霉素含量、全氮含量较CK组显著提高,速效钾含量和pH较CK组显著降低;接种AM真菌后滇重楼根际土壤全磷、速效磷、速效氮、铵态氮、硝态氮、速效钾、有机质含量与CK组相比变化较大,改善了土壤养分状况,提高了滇重楼根茎总皂苷含量。结论:接种AM真菌能够改善滇重楼根际土壤养分含量,有助于根际土壤养分转化,促进滇重楼生长,提高药材的入药品质。     

滇重楼总皂苷含量和菌根侵染率与土壤因子的关系

目的:通过滇重楼总皂苷含量和AM菌根侵染率与根际土壤性质的相关研究和通径分析,探讨土壤因子在滇重楼品质形成中的作用.方法:测定了25个主要分布区滇重楼根茎总皂苷含量、土壤理化性质和养分状况、根系AM菌根侵染率,并应用相关分析和通径分析研究了滇重楼总皂苷含量和菌根侵染率与土壤因子的关系.结果:在自然条件下,滇重楼根系能与AM真菌形成良好的共生关系,侵染率在36.41％～83.37％.总皂苷与脲酶活性、碱性磷酸酶活性、有机质含量呈显著正相关,与土壤容重呈显著负相关.AM菌根侵染率与碱解氮呈显著正相关.通径分析结果表明,滇重楼总皂苷含量主要受其根际土壤碱解氮的影响,其次为土壤有机质和脲酶活性.而菌根侵染率主要受土壤pH制约,其次为碱解氮、脲酶活性和速效磷.结论:滇重楼品质形成与土壤因子密切相关,通径分析更能反映土壤因子对滇重楼总皂苷含量和菌根侵染率的贡献.     

田间施加丛枝菌根真菌剂对滇重楼根际土壤理化性质的影响

目的:探究田间条件下接种丛枝菌根(arbuscular mycorrhiza,AM)真菌对滇重楼(Paris polyphylla var.yunnanensis)根际土壤的影响,为指导滇重楼的规范化栽培,培育优质的滇重楼品种提供参考。方法:通过小规模的大田接种试验与室内分析相结合的方法,观察滇重楼根际土壤结构受田间接种菌根真菌所带来的影响,采用土壤农化法对各土壤指标进行测定。结果:接种外源AM真菌处理组对滇重楼根系AM真菌的侵染率以及侵染强度等方面具有调控作用;添加AM真菌后,土壤pH基本不受影响,有机质、速效氮、速效磷、速效钾含量增加;真菌的数量下降,细菌、放线菌的数量增加;根际土壤酶活性增加。相关性分析结果表明,各土壤理化指标之间存在显著正相关,特别是细菌数量与3种磷酸酶均极显著的相关性(r=0.849,0.800,0.804,P0.01)。结论:2种混合菌剂的施加能使滇重楼根际土中微生物数量、酶活性增加,各土壤因子之间具有一定的协同作用。在3个大田试验点中,贵州安顺和重庆万州的效果更为理想,这为大规模的推广大田栽培滇重楼提供理论和实践基础。     

高温胁迫对滇重楼生理指标的影响

目的探究滇重楼对高温抗性适应能力,为滇重楼在中南地区规模化引种栽培提供依据。方法以滇重楼生长健壮苗为实验材料,在25℃/20℃(昼温/夜温)、33℃/28℃(昼温/夜温)、39℃/34℃(昼温/夜温)的不同温度条件下连续胁迫处理7 d,测定其叶片生理指标,并进行显著性与相关性分析。结果随着温度的升高与胁迫时间的持续延长,在33℃/28℃与39℃/34℃下处理7 d后,滇重楼叶相对含水量明显下降,分别比对照(25℃/20℃)低17.38%、58.25%;相对电导率与丙二醛(MDA)含量均持续上升,其中39℃/34℃处理下上升幅度最大,电导率比对照高3.59倍,MDA含量比对照高2.55倍;39℃/34℃处理下可溶性糖含量逐渐下降,比对照低33.25%;可溶性蛋白含量均呈波浪状变化,33℃/28℃处理组波动幅度较大,7 d后上升为对照的1.32倍;处理组超氧化物歧化酶(SOD)活性均先升高后下降,39℃/34℃处理组4 d后达到峰值,比对照高2.35倍;处理组过氧化物酶(POD)活性均逐渐上升,39℃/34℃处理组4 d后上升为对照的2.33倍,之后变化幅度逐渐减缓。结论温度对滇重楼的各项生理指标均有明显的影响,温度为25℃/20℃条件下,植物生长状态良好,为适宜生长温度,33℃/28℃温度条件下,长时间的持续胁迫处理会引起植株叶片损伤,39℃/34℃持续高温胁迫则会严重损伤植株生理活性与形态结构,严重时甚至会导致植株死亡。     

滇重楼的化学成分研究

目的研究滇重楼Paris polyphylla var.yunnanensis根茎中的化学成分。方法利用正相硅胶柱色谱、葡聚糖凝胶Sephadex LH-20、反相制备色谱等手段进行分离纯化,并通过1H-NMR、13C-NMR、ESI-MS等波谱技术进行结构鉴定。结果从醋酸乙酯层中分离得到了7个化合物,分别鉴定为豆甾醇-3-O-β-D-葡萄糖苷(Ⅰ)、1-O-(β-D-葡萄糖基)-(2S,3S,4E,8E)-2-[(2′R)-2′-羟基十六酰氨基]-4(E),8(E)-十八二烯-1,3-二醇(Ⅱ)、β-蜕皮激素(Ⅲ)、薯蓣皂苷元-3-O-α-L-呋喃阿拉伯糖基(1→4)-[α-L-吡喃鼠李糖基(1→2)]-β-D-葡萄糖苷(Ⅳ)、薯蓣皂苷元-3-O-α-L-吡喃鼠李糖基(1→4)-[α-L-吡喃鼠李糖基(1→2)]-β-D-葡萄糖苷(Ⅴ)、薯蓣皂苷元-3-O-α-L-吡喃鼠李糖基(1→4)-α-L-吡喃鼠李糖基(1→4)-[α-L-吡喃鼠李糖基(1→2)]-β-D-葡萄糖苷(Ⅵ)和偏诺皂苷元-3-O-α-L-呋喃阿拉伯糖基(1→4)-[α-L-吡喃鼠李糖基(1→2)]-β-D-葡萄糖苷(Ⅶ)。结论化合物Ⅱ为首次从该属植物中分离得到。     

基于SSR分子标记的滇重楼遗传多样性研究

目的研究滇重楼Paris polyphylla var.yunnanensis自然居群的遗传多样性,为滇重楼资源的保护和合理利用提供数据。方法采用SSR分子标记对滇重楼5个不同居群共115份样品进行遗传多样性分析。结果筛选出8对可用SSR引物,多态位点百分率(PPB)为100%,多态信息量(PIC)为0.745 6。在居群水平和物种水平上,观测等位基因数(N_a)分别为8.425 0和17.750 0,有效等位基因数(N_e)分别为4.960 9和7.500 7,观测杂合度(H_o)分别为0.295 5和0.294 8,期望杂合度(H_e)分别为0.654 8和0.774 4,Shannon’s信息指数(I)分别为1.520 1和2.038 6。遗传分化系数(F_(st))为0.172 8,基因流(N_m)为1.196 6。利用UPGMA聚类分析,将5个居群分为2类。结论滇重楼遗传多样性水平较高,居群内和居群间具有一定的遗传分化。对保护和发展滇重楼资源提出若干措施,为滇重楼的保护和科学可持续利用提供参考。     

不同生长年限滇重楼的生物量分配与异速生长研究

目的 比较不同产地和生长年限栽培滇重楼Paris polyphylla var. yunnanensis生物量和性状差异,并对植株生物量积累和生长发育规律进行异速生长分析。方法 使用Pearson相关分析研究滇重楼根茎生物量与采集地经纬度、气候因子间的相关性;单因素方差分析（One-Way ANOVA）与独立样本T检验用于样品间植物性状的差异显著性比较;利用标准化主轴回归分析（standardized major axisregression）对滇重楼的生物量积累和生长发育规律进行异速生长研究。结果 研究表明12个不同产地的5年生滇重楼根茎生物量平均值在1.19～19.73 g,不同产地之间具有显著差异（P<0.05）,但该差异与产地经纬度、年均温度、年均降水量之间不存在显著相关性（P>0.05）。滇重楼植株的根茎生物量均随生长年限增加而增加,种植5年后根茎生物量一直呈现快速积累趋势。相同生长年限植株中,云南省元阳县样品根茎生物量显著高于姚安县样品（P<0.05）,并且数值具有更高的变化范围。滇重楼植株的总生物量、株高、叶生物量、叶长、叶宽、叶面积均随生长年限增加而增...     

滇重楼内生真菌米曲霉中1个新的聚酮类化合物

目的研究滇重楼内生真菌米曲霉Aspergillus oryzae次生代谢产物的化学成分,以期发现新的化合物。方法采用液体发酵方式发酵,萃取后运用硅胶及大孔吸附树脂等多种色谱技术进行分离纯化,并根据理化性质和波谱数据鉴定化合物的结构。结果从滇重楼内生真菌米曲霉发酵产物中分离鉴定了3个化合物,分别鉴定为3-氨基-4,5-二羟基-4,6-二甲基-2-(2-甲基丁酰)环己-2-烯酮(1)、12-N-甲基-环-(L-色氨酰-L-苯丙氨酰)(2)和二聚色氨酸素(3)。结论化合物1为新的聚酮类化合物,命名为米曲霉聚酮A。     

滇重楼鲨烯环氧酶基因的克隆及原核表达研究

目的克隆滇重楼Paris polyphylla var.yunnanensis三萜皂苷生物合成途径中的关键酶鲨烯环氧酶(squalene epoxidase,SE)基因,并进行原核表达。并用Real-time PCR法检测cDNA样本中SE1基因和SE2基因的相对量。方法以滇重楼根为材料提取总RNA并反转录为cDNA。以cDNA为模板,根据转录组数据中的2组SE基因全长序列设计特异性引物,对SE基因进行克隆后转入到pEASY-T1 Simple Cloning Vector中,经测序鉴定正确后,构建pEASY-E1-SE表达载体,利用Art Media protein Expression/Amp+培养基自动诱导表达。Real-time PCR法检测cDNA样本中SE1和SE2基因的相对量。结果获得了2条滇重楼SE基因,命名为ppSE1和ppSE2。ppSE1的全长为1 932 bp,开放阅读框(ORF)为1 578 bp,编码525个AA;ppSE2的全长为1 828 bp,ORF长为1 548 bp,编码515个氨基酸。荧光定量PCR结果显示ppSE1基因和ppSE2基因在茎和叶中的表达具有显著差异,ppSE1的表达在叶中最为显著。酶切和测序结果表明,原核表达载体pEASY-E1-SE构建成功;SDS-PAGE分析显示,在BL21(DE3)表达感受态细胞中成功诱导表达了SE基因的2种融合蛋白。结论克隆了滇重楼的SE基因,获得了在体外具有生物学活性的SE蛋白。ppSE1基因和ppSE2基因在滇重楼中具有不同的表达模式,在滇重楼次生代谢产物的合成中起着不同的作用。