基于流式细胞术和K-mer分析的苦豆子基因组大小估测

目的 采用流式细胞术与K-mer分析方法对苦豆子基因组大小及杂合率进行估测,为其全基因组测序提供参考。方法 以大豆为内标,通过流式细胞仪检测大豆与苦豆子细胞DNA含量的倍数关系,计算苦豆子的基因组大小。采用二代测序技术进行苦豆子基因组调查测序,使用K-mer分析估测苦豆子基因组大小与杂合率。结果 采用流式细胞术测得苦豆子基因组大小约为1 749 Mb。K-mer分析结果表明,苦豆子基因组大小约为1 648 Mb,基因组杂合率为1.12%,杂合率较高。结论 苦豆子基因组大小约为1.7 Gb,杂合率较高,后续研究可采用三代PacBio进行80~100 X深度的测序开展全基因组测序研究。     

基于本草基因组学应用流式细胞术和高通量测序技术检测人参基因组大小

人参（Ginseng）是五加科植物人参（Panax ginseng C. A. Mey.）的干燥根和根茎。由于其基因组数据的缺乏制约了人参基础研究和产业发展。本实验以水稻（Oryza sativa ssp. Nipponbare）和大豆（Glycine max(L.) Merrill）为内参,通过流式细胞术检测人参基因组大小约为3.42 Gb;同时,分别构建人参基因组插入片段大小为250 bp和500 bp的鸟枪法（shotgun）文库,利用Illumina Hiseq X Ten平台进行双端PE 150高通量测序,过滤原始测序数据后获得183.82 Gb高质量数据,K-mer分析法预估人参基因组大小为3.35 Gb,测序深度为54.87 X。本研究采用流式细胞术结合K-mer分析法测定人参基因组大小,为人参全基因组测序以及本草基因组学的研究提供基础数据。     

川芎基因组survey测序及其特征分析

目的 利用流式细胞术和高通量测序技术,对川芎Ligusticum chuanxiong基因组大小和特征进行分析,为川芎全基因组精细测序和分子机制研究奠定基础。方法 以已知基因组大小的绿豆和陆地棉作为内标植物,用流式细胞术估算川芎基因组大小。利用高通量测序技术对川芎基因组进行survey分析,测算出川芎基因组大小、重复序列、杂合率和GC含量等,利用生物信息学对基因组进行预测、注释和基因家族鉴定。结果 估算出川芎基因组大小约为3058.37Mb,重复序列为79.79%,杂合率约2.16%,GC含量为36.32%,川芎基因组呈现高重复、高杂合、基因组庞大等特征。共预测到34864个基因,有30 737个基因在功能数据库中被注释,有53个基因注释到阿魏酸合成过程中。初步鉴定到2058个特异基因家族,2001个单拷贝基因。结论 初步获得了川芎基因组大小、基因组特征、功能基因及基因家族等信息,为进一步川芎全基因组精细测序提供了参考,为阐明川芎阿魏酸等药效成分生物合成提供了基因资源。     

药用黄芪基因组大小的研究

黄芪是一种著名的传统中药材,其包括蒙古黄芪和膜荚黄芪,本研究旨在检测蒙古黄芪、膜荚黄芪的基因组大小。实验选取蒙古黄芪和膜荚黄芪的新鲜叶子为实验材料,大豆品种William 82为标准植株,用LB01裂解液处理叶子,应用流式细胞仪测定蒙古黄芪、膜荚黄芪、William 82样品的PI发射的荧光强度,分别比较蒙古黄芪、膜荚黄芪峰与William 82的荧光强度均值的倍数关系,进而分别计算出蒙古黄芪的基因组大小约为1.46 Gb,膜荚黄芪的基因组大小约为1.52 Gb。本研究探索了流式细胞术测定黄芪基因组大小的方法,并发现膜荚黄芪的基因组大小大于蒙古黄芪的基因组大小,从基因组的角度进一步揭示了蒙古黄芪和膜荚黄芪在生物学上的差异,该研究也将有助于黄芪属植物确定合理的全基因组测序策略。     

基于流式细胞术和基因组survey分析的地黄基因组研究

目的地黄Rehmannia glutinosa是我国传统中药,具有较高的药用价值和经济价值。利用流式细胞技术和高通量测序技术,分析了地黄基因组大小和特征等信息,为绘制地黄全基因组精细图谱提供依据。方法将已知基因组大小的大豆Glycine max和辣椒Capsicum annuum作为对照,用流式细胞技术估算地黄基因组大小。然后利用高通量测序技术对地黄基因组进行survey分析,通过生物信息学分析获得了地黄全基因组重复序列比例、基因组杂合度以及GC含量等信息。结果根据流式细胞实验结果,地黄基因组大小介于大豆和辣椒之间,估算地黄基因组大小应在2.00~2.12 Gb。通过高通量测序,获得了132.79 Gb高质量的数据,总测序深度约为66.40×,估算地黄基因组大小为2.03 Gb。根据Kmer分布情况,估算地黄基因组重复序列比例为78.48%,杂合度为1.93%,GC含量为37.27%。从基因组基本结构特征上看,地黄基因组属于高重复、高杂合、大基因组的复杂基因组。结论获得了地黄基因组大小和特征等信息,这些信息将为绘制地黄全基因组的精细图谱奠定基础,也为阐明地黄有效成分的生物合成和调控途径提供依据。     

连翘基因组大小的流式细胞仪测定

目的采用流式细胞术测定连翘的基因组大小。方法摘取连翘新鲜嫩叶,以大豆品种William 82为内标,用GPB裂解液提取细胞核悬液,依次经过RNase和PI处理后,上流式细胞仪检测。结果变异系数均小于5%,表明数据可信,进而分析出连翘基因组大小约为0.74Gb。结论该研究探索了流式细胞术测定连翘基因组大小的方法,同时明确了连翘的基因组大小。     

比较桔梗科两种中药材基因组大小的研究

目的 比较中药材桔梗科植物党参和桔梗的基因组大小。方法 分别摘取党参和桔梗的新鲜嫩叶为实验材料,以蒙古黄芪作为党参的内标,以大豆作为桔梗的内标,采用裂解液(lysis buffer, LB)01制备各细胞核悬液,碘化丙啶染色,用流式细胞仪分别测定党参和桔梗的荧光强度。结果 估测出党参的基因组大小约为1.00 Gb;桔梗的基因组大小约为0.70 Gb。结论 桔梗科中药材党参基因组大小大于桔梗的基因组大小,相差约0.30 Gb,为同科的党参和桔梗之间的差异提供了重要支持。     

流式细胞术测定巴戟天基因组大小

目的估测广东省地道药材巴戟天(Morinda officinalis How)的基因组大小,为巴戟天基因组、种质资源评价等研究提供参考。方法选取番茄为内标植物,巴戟天嫩叶为实验材料。采用OTTO两步法制备细胞核悬液,用碘化丙啶(PI)进行细胞核染色,使用流式细胞仪测定番茄和巴戟天细胞核的荧光强度,计算巴戟天基因组大小。结果 OTTO两步法适合用于制备番茄和巴戟天核悬液,在流式细胞仪中成功检测到二倍体和四倍体的粒子团,流式细胞仪测定番茄细胞核平均荧光峰值为30 481,巴戟天细胞核平均荧光强度值为15 278,计算出巴戟天的基因组大小约为(451.11±37.16)Mbp。结论实验估测了巴戟天基因组的大小,所摸索的OTTO两步法可为其他药用植物提供借鉴。     

裸花紫珠基因组调研及SSR特征分析

裸花紫珠是海南省特色黎族药大品种,具有止血散瘀、消炎抗菌之功效。目前,裸花紫珠参考基因组信息缺乏。通过研究裸花紫珠的基因组大小、杂合率及SSR特征,可为裸花紫珠基因组精细测序的文库构建和SSR分子标记的开发提供依据。为此,该研究采用二代测序方法,基于K-mer分析手段来研究裸花紫珠基因组的大小及杂合率,在此基础上采用MISA工具分析其SSR特征。结果表明,裸花紫珠基因组大小约为822. 43 Mb,重复序列比例约71. 67%,杂合率约0. 85%,基因组的GC量约49. 20%。提示裸花紫珠为高杂合、高重复的复杂基因组。通过对基因组序列进行SSR特征分析,共鉴定了206 049个SSR,其中,单、双、三核苷酸重复基序占比较高,共198 993个,占96. 57%。在2～6核苷酸重复基序类型中分别是AT/AT,AAT/ATT,AGCC/CTGG,AAAAT/ATTTT,AGATAT/ATATCT的数量最多。该研究为裸花紫珠基因组精细测序的文库构建提供了参考,同时为其SSR分子标记开发和基因资源的保护和利用提供了分子依据。     

三岛柴胡基因组Survey分析及SSR位点挖掘

柴胡是我国传统中药材,主要用于治疗感冒及保肝护肝等。三岛柴胡是日本栽培品种,在我国和韩国等国家地区亦有种植。在大规模全基因组深度测序之前,需要进行低覆盖度的基因组Survey测序,以评价基因组的大小及复杂程度,确定适合该植物全基因组测序研究策略。该研究采用二代高通量测序技术(Illumina Hiseq 2000)进行了三岛柴胡的Survey测序分析,并对所获得基因组序列进行了SSR分析,利用Primer 3设计SSR特异引物并随机选择33对引物以三岛柴胡DNA为模板,进行PCR扩增,对PCR体系以及最佳退火温度进行筛选。共获得了288. 64 G基因组数据,估计基因组大小为2 119. 58Mb,测得基因组数据深度为138×,杂合率为1. 84%,重复序列比例为83. 89%,推测三岛柴胡基因组属于复杂基因组。采用K-mer=41初步组装,得到contig N50 224 bp,总长896. 97 Mb,scaffold N50 313 bp,总长922. 67 Mb。三岛柴胡基因组序列数据中,共检测到91 377条SSR序列,分布于70 809条独立基因。主要类型为二核苷酸重复,存在49 680条,占比70. 16%。在合成的33对引物中,有21对引物成功扩增出目标条带。研究结果为后续大规模基因组测序、开发鉴定柴胡种质和性状定位的SSR分子标记奠定了基础。     

基于Illumina高通量测序技术的草豆蔻基因组研究

目的对药食同源植物草豆蔻Alpinia katsumadai进行基因组调研分析,完善草豆蔻基因组遗传信息。方法研究采用Illumina高通量测序技术,基于K-mer分析手段来研究草豆蔻基因组的大小及杂合度,利用MISA方法分析可能的SSR分子标记。结果草豆蔻的基因组大小为1.60 Gb,基因组杂合度为0.44%,重复序列比例为72.72%;在基因组序列中,进行SSR分子标记分析,共鉴定出了364 395个SSR,其中,单、双、三核苷酸重复模体的比例较高,分别占比64.25%、24.05%、10.31%;从测序得到的350 bp文库中,随机取10 000条单端reads,与NT库进行BLAST比对,发现草豆蔻的近缘物种艳山姜Alpinia zerumbet和小豆蔻Elettaria cardamomum上的reads数分别占比对上NT库reads数的12.89%和12.36%。结论通过对草豆蔻植物的基因组大小、杂合度调查及SSR分子标记分析表明,草豆蔻物种基因组属于高重复、大基因组的复杂基因组,这为草豆蔻的资源保护和遗传多样性分析及品种选育提供了遗传信息支撑。     

刺果甘草全基因组Survey及叶绿体基因组特征分析＊

目的 基于基因组Survey分析对刺果甘草Glycyrrhiza pallidiflora Maxim.基因组大小和杂合率进行估计，并通过叶绿体基因组序列特征对其在甘草属Glycyrrhiza L.中的系统发育位置进行研究。方法 使用二代测序技术对刺果甘草进行测序，采用K-mer方法对测序reads进行分析，估算刺果甘草基因组大小和杂合率，使用生物信息学方法进行叶绿体基因组组装、注释和系统发育分析。结果 Survey分析结果显示其基因组大小约为577.82 Mb，杂合度约为0.31%，重复序列比例约为53.72%。叶绿体基因组长度为127，267 bp，不具有典型的四分体结构，总GC含量为34.32%，包含110个基因，其中76个蛋白质编码基因，30个tRNA基因和4个rRNA基因。系统发育分析表明，刺果甘草与圆果甘草G. squamulosa Franch.亲缘较接近。结论 刺果甘草存在低杂合和重复序列较多的特点，为了更好地对全基因组进行序列拼接和组装，可尝试采用三代测序结合二代测序的分析策略进行基因组组装；刺果甘草叶绿体全基因组比对和系统发育分析，为后续开展甘草属遗传多样性研究和分子鉴定标记筛选提供了重要依据。     

膜荚黄芪法呢基焦磷酸合酶基因密码子偏性分析

目的法呢基焦磷酸合酶(farnesyl pyrophosphate synthase,FPS)是调控黄芪甲苷生物合成途径关键酶,为该基因外源表达选择合适的宿主,进而为提高黄芪甲苷产量提供理论依据。方法以长白山膜荚黄芪为植物材料,克隆了FPS基因的编码序列。运用EMBOSS及Codon W等在线软件分析了FPS基因的密码子偏好性,并将其与玉米、青蒿等7种植物FPS基因及大肠杆菌基因组密码子偏好性进行比较。结果膜荚黄芪FPS基因偏好于以A或T碱基结尾的密码子,与大肠杆菌Escherichia coli基因组共有22个密码子存在差异。结论进一步提高膜荚黄芪FPS基因在大肠杆菌中的表达水平,需对其密码子进行优化。     

黄芪生态型与品质的相关性研究

目的测定鞭杆芪、直根芪、二叉芪和鸡爪芪4种生态型黄芪中黄芪甲苷及黄酮类成分的量,分析生态型与质量之间的相关性。方法采用超高效液相色谱(UPLC)法测定黄芪中黄酮类及黄芪甲苷量。对所测数据进行主成分分析(PCA)和聚类分析(CA)。结果 4种生态型黄芪的黄酮类成分及黄芪甲苷量高低顺序为鞭杆芪>直根芪>二叉芪>鸡爪芪;PCA分析结果表明4种生态型黄芪彼此可以很好地区分;CA结果显示直根芪与鞭杆芪聚为一支,表明直根芪与鞭杆芪质量相近,较好;而二叉芪与鸡爪芪聚为一支表明两者质量相近,较差。结论 4种生态型黄芪的质量优劣顺序鞭杆芪>直根芪>二叉芪>鸡爪芪,黄芪的质量与生态型紧密相关。     

膜荚黄芪的转录组测序质量评估及其SSR位点信息分析的研究

该实验采用Roche 454 GS FLX测序仪获得黄芪的转录组数据,使用454 Sequencing System Software分析软件进行转录组从头拼接;利用MISA工具筛选了黄芪转录组测序获得的9 893条unigenes,对其SSR位点信息进行了分析。结果表明,进行测序所得的reads的平均长度为413 bp,约86%的reads参与了拼接,拼接的N50长度为1 205 bp,所测得的unigene数量基本涵盖了全部转录组信息;黄芪转录组搜索到1 729个SSR位点,SSR的发生频率为9.24%,SSR在黄芪整个转录组中出现的频率为13.42%,SSR的平均距离为7.97 kb。一共发现核心重复序列127种,占优势的是二核苷酸型中的TG/AC型,出现的频率占总SSR位点的4.25%。黄芪转录组的测序结果揭示了黄芪转录组的整体表达特征,并得到大量黄芪转录组unigene序列,并且黄芪转录组SSR位点出现频率高,类型多样,多态性潜能高。     

2种类型膜荚黄芪主要药效成分含量及关键酶基因表达量差异研究

目的以2年生2种类型膜荚黄芪Astragalus membranceus(绿茎有毛膜荚黄芪、紫茎有毛膜荚黄芪)根、茎、叶为实验材料,探究其主要药效成分含量及其生物合成途径中关键酶基因表达量的差异,为药材膜荚黄芪资源合理利用及其优良品种选育选育提供科学的理论参考。方法使用HPLC检测膜荚黄芪根、茎、叶中黄芪甲苷与毛蕊异黄酮葡萄糖苷的含量,使用紫外分光光度计检测膜荚黄芪根、茎、叶中总皂苷含量,采用实时荧光定量PCR检测其根中皂苷生物合成过程中关键酶乙酰辅酶A乙酰基转移酶(AATC)、3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A合酶(HMGS)、3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶(HMGR)、异戊二烯焦磷酸异构酶(IDI)、法尼基焦磷酸合酶(FPS)、鲨烯合酶(SS)、鲨烯环氧酶(SE)、环阿尔庭烷合酶(CAS)基因的表达量。结果紫茎膜荚黄芪根中黄芪甲苷含量始终高于绿茎膜荚黄芪;在生殖生长期时,绿茎膜荚黄芪根中毛蕊异黄酮葡萄糖苷含量高于紫茎膜荚黄芪,而枯萎期二者变化浮动较大;绿茎膜荚黄芪根中总皂苷含量普遍高于紫茎膜荚黄芪。AACT、FPS、HMGS基因表达量与绿茎膜荚黄芪总皂苷含量呈显著相关(P0.05),IDI基因表达量与总皂苷含量呈极显著相关(P0.01),说明这4个基因在绿茎膜荚黄芪总皂苷合成中具有重要影响;HMGR基因与紫茎膜荚黄芪总皂苷呈显著相关(P0.05),其他基因与紫茎膜荚黄芪皂苷含量均有相关性,但未达到显著水平。结论探究了2种类型黄芪3种主要药效成分的动态变化和皂苷类化合物关键酶基因的表达,为黄芪皂苷类化合物合成生理生态机制的明晰、膜荚黄芪资源合理利用及优良品种选育提供了科学的理论依据。     

黄芪饮片miRNA谱及热力学的稳定性研究

目的为更好了解药用黄芪微小RNA(mi RNA)被机体摄入和吸收的情况,试图建立黄芪mi RNA谱,为今后黄芪饮片药理学研究奠定基础。方法以经干燥、高温和微波处理的黄芪煎煮液为样本,采用高通量深度测序方法以获取未知的mi RNA序列。结果经测序得到药用黄芪9 931 049个小RNA读数。经与mi RBase 21数据库所有植物种类潜在发卡型结构比对,分析和构建了黄芪饮片煎煮液mi RNA谱,并确定了1个保守的mi RNA和9个新发现的mi RNA。经进一步生物学信息分析,发现12种I类小干扰性RNA(small interfering RNAs,si RNAs)序列,其5’端对热力学不稳定,3’端种子区域对热力学高度稳定。结论首次揭示了经热力学处理后黄芪饮片的mi RNA谱,I类si RNAs是潜在的可利用的植物药的生物化学分子,有助于今后中药在表观遗传学方面的深入研究。     

蒙古黄芪和膜荚黄芪水溶性蛋白表达

目的:蒙古黄芪和膜荚黄芪都为药用黄芪,二者亲缘关系近,成分相似,药用价值尚未区分。该研究旨在建立蒙古黄芪和膜荚黄芪的水溶性蛋白表达谱,了解两种黄芪之间存在的差别。方法:样品采用水超声提取和丙酮沉淀的方法得到黄芪水溶性蛋白成分,质谱级胰酶酶解后的肽段经nano ESI-LC-MS/MS分析,采用Proteome Discoverer 1. 4软件比对豆科蛋白数据库鉴定蛋白,再使用非标记定量软件SIEVE分析蒙古黄芪与膜荚黄芪水溶性蛋白质表达的差异。最后运用生物信息学方法分析2种黄芪共有蛋白的分类、分子功能、参与的生物过程和信号通路。结果:蒙古黄芪鉴定特异性蛋白有920个,膜荚黄芪鉴定的特异性蛋白有717个,2种黄芪中共同表达的蛋白有472个,其中二者的差异表达蛋白有21个,如PR-10蛋白,NDK-1蛋白,谷蛋白A2,磷脂酶D等蛋白在两种黄芪中差异表达。蒙古黄芪高表达蛋白14个,膜荚黄芪高表达蛋白7个。结论:蒙古黄芪和膜荚黄芪的水溶性蛋白表达谱存在显著差异,特异性蛋白、差异表达蛋白和共同表达的蛋白可为今后两种黄芪的鉴别、药理作用机制的研究和寻找作用靶点提供参考。