晶状体上皮细胞葡萄糖代谢的研究进展

糖尿病性白内障(DC)是影响糖尿病患者视力的重要原因,其发病机制尚未完全明确。研究表明,葡萄糖代谢紊乱可能是DC形成的重要机制。晶状体上皮细胞(LECs)是晶状体代谢最为活跃的成分,正常的葡萄糖代谢对维持晶状体透明至关重要。在高糖环境下,LECs发生葡萄糖代谢紊乱可能是DC发生发展的重要机制。本文就正常和高糖条件下LECs葡萄糖代谢的特点及其对LECs的影响进行综述,以期为DC的防治提供新的思路。     

水通道蛋白-1在高糖培养人晶状体上皮细胞中的表达

目的研究水通道蛋白-1（AQP-1）在糖尿病性白内障发病机制中的作用。方法从健康的供体眼中分离出人晶状体囊膜,用组织块培养法将人晶状体囊膜分别置于1g/L葡萄糖＋体积分数15%胎牛血清的DMEM培养液中（对照组）或4.5g/L葡萄糖＋15%胎牛血清的DMEM培养液中进行培养（高糖组）。培养3d、28d后观察2组人晶状体上皮细胞（LECs）的生长状态。采用免疫荧光技术和流式细胞术检测AQP-1在人LECs中表达的平均荧光强度,应用流式细胞术检测2组人LECs的凋亡和坏死情况,并进行比较。结果培养第3天2组LECs的生长形态近似,但培养28d高糖组坏死细胞增加。培养3d后高糖组人LECs的AQP-1免疫荧光表达较对照组明显增强,2组间平均荧光强度的差异有统计学意义（t=3.934,P=0.004）,但2组间LECs的凋亡率和坏死率差异均无统计学意义（t=1.681,P=0.131;t=1.064,P=0.318）。培养28d后高糖组人LECs的AQP-1免疫荧光表达较对照组弱,差异有统计学意义（t=3.069,P=0.015）,LECs凋亡率、坏死率较对照组升高,差异均有统计学意义（t=11.213,P〈0.01;t=15.778,P〈0.01）。结论 AQP-1的异常表达在糖尿病性白内障的发生发展中起重要作用。     

过氧化氢酶高表达抑制活性氧诱导的人晶状体上皮细胞凋亡

晶状体上皮细胞(lens epithelial cell,LEC)凋亡是除先天性白内障外各种类型白内障发生的共同分子机制,活性氧损伤是LEC凋亡的主要原因。本研究以过氧化氢为处理因素,探讨活性氧诱导LEC凋亡的机制;同时采用稳定转染的方法,提高LEC过氧化氢酶(catalase,CAT)的表达水平,观察其对活性氧诱导的LEC凋亡的抑制作用。     

谷胱甘肽和烟酸对高糖状态下人晶状体上皮细胞的影响

目的:评价还原性谷胱甘肽(GSH)和烟酸联合应用对蛋白质氧化应激、内质网应激(ER)、糖基化和聚合αβ晶状体蛋白的人晶状体上皮(HLE)细胞治疗高葡萄糖水平的影响。方法:培养HLE细胞并暴露于25 mmol/L葡萄糖中以促进高糖环境。各组细胞用三种不同的剂量组合进行联合治疗:10μmol/L GSH+2μmol/L烟酸,30μmol/L GSH+25μmol/L烟酸,100μmol/L GSH+25μmol/L烟酸。培养72h后,用ELISA法测定蛋白羰基(PCC)和葡萄糖反应蛋白(GRP78)的含量。培养2wk后,对糖基化终末产物(AGEs)进行检测,用Western Blot检测αβ晶状体蛋白的表达。所有数据分析均采用SPSS 18.0统计软件包。结果:与对照组相比,联合治疗组的PCC和GRP78水平没有显著降低(P>0.05)。相反,与对照组相比,GSH和烟酸联合治疗组的AGEs水平明显下降(P<0.05)。此外,高剂量葡萄糖给药后αβ晶状体蛋白表达增加,但GSH联合治疗组与GSH和烟酸联合治疗组αβ晶状体蛋白表达都有所降低。结论:结果表明,GSH和烟酸联合应用可抑制高血糖人HLE细胞蛋白质的聚合,防止糖基化,并且通过AGEs途径在预防糖尿病性白内障中发挥积极作用。     

地塞米松对人晶状体上皮细胞中波形蛋白表达的影响

目的 探讨地塞米松(dexamethasone,Dex)对人晶状体上皮细胞系(human lens epithelial cells,HLEC)中波形蛋白表达的影响以及波形蛋白表达变化在糖皮质激素性白内障形成中的作用.方法 对HLEC进行传代培养,应用DMEM和DMEM+1μmol·L-1Dex作用于HLEC 7 d,采用实时PCR和Western-blot从基因水平和蛋白水平检测波形蛋白的表达变化,采用免疫荧光染色法检测波形蛋白在细胞中的分布及表达变化.结果 实时PCR结果显示,Dex组较对照组波形蛋白mRNA表达减少,组间差异有统计学意义(P＜0.05).Western-blot检测结果显示,Dex组较对照组波形蛋白含量减少,组间差异有统计学意义(P＜0.05),提示Dex可降低波形蛋白的表达.免疫荧光染色结果显示Dex组较对照组波形蛋白表达减少,与Western-blot检测结果一致.结论 Dex可诱导HLEC中波形蛋白表达减少,从而引起HLEC异常的增殖和分化,最终导致糖皮质激素性白内障的形成.     

miR-15a对高糖诱导人晶状体上皮细胞氧化应激损伤的促进作用及其机制

目的:探讨微小RNA15a(miR-15a)对高糖诱导的人晶状体上皮细胞(LECs)抗氧化应激能力的调控作用及其可能的作用机制。方法:收集糖尿病性白内障(DC)患者晶状体前囊膜组织标本及健康供体前囊膜组织标本各26个,采用实时荧光定量PCR法和Western blot法分别检测组织中miR-15a和沉默信息调节蛋白1(...     

高糖培养人晶状体上皮细胞创伤后Cyclin D1的表达

目的：观察高糖培养的人晶状体上皮细胞在创伤刺激后Cyclin D1的表达情况。

方法：采用MTT法观察不同浓度葡萄糖对体外培养的人晶状体上皮细胞(HLEB3)作用24h后细胞增殖活性的影响,确定最适葡萄糖作用浓度。将HLEB3细胞分为高糖预处理组(高糖培养基预处理24h后再更换高糖培养基培养)和非高糖预处理组(正常培养基培养24h后再更换高糖培养基培养),根据更换高糖培养基时是否进行划伤处理将细胞分为对照组和划伤组,分别采用qRT-PCR和Western blot法检测各组细胞创伤后不同时间点Cyclin D1 mRNA和蛋白的表达情况。

结果：一定浓度范围的葡萄糖能够增强细胞增殖活性,25.5mmol/L葡萄糖处理时细胞活性最强。高糖预处理细胞Cyclin D1表达在一定时间范围内呈时间依赖性表达下调; 非高糖预处理细胞Cyclin D1表达呈不规律性,在12h和48h处表达上调; 划伤处理可在一定程度上刺激细胞Cyclin D1表达上调。

结论：葡萄糖对人晶状体上皮细胞活性及Cyclin D1表达的影响呈现不规律性,创伤处理可在一定程度上上调细胞Cyclin D1的表达。     

高糖对人视网膜色素上皮细胞Na-K-ATP酶表达的影响

目的 观察高糖对人视网膜色素上皮（RPE）细胞Na-K-ATP酶基因与蛋白表达的影响。方法 采用ARPE-19细胞，培养4周后分为高糖组（葡萄糖浓度30mmol／L）与对照组（葡萄糖浓度7mmol／L），继续培养2周、4周，RT-PCR法检测Na-K-ATP酶α1、Na-K-ATP酶β1的mRNA表达水平的变化，Western blot法检测Na-K-ATP酶β的蛋白表达情况。结果 高糖抑制Na-K-ATP酶α1与β1的mRNA表达，2周、4周时α1与β-actin光密度比值分别为0．17、0．23，对照组分别为0．37、0．36；β1与β-actin光密度比值分别为0．69、0．41，对照组分别为0．98、0．83；Na-K-ATP酶β蛋白表达水平较对照组降低，2周、4周时与β-actln的比值分别为0．51、0．25，对照组分别为0．65、0．68。结论 高糖环境下人RPE细胞Na-K-ATP酶基因与蛋白表达水平降低，可能参与了黄斑水肿的发生。     

高糖对人晶状体上皮细胞凋亡的作用

目的:研究不同浓度的高糖(HG)对人晶状体上皮细胞凋亡的作用。方法:用不同浓度的HG诱导人晶状体上皮细胞凋亡,处理组:DMEM+HG;对照组:DMEM。用四甲基偶氮唑盐(MTT)比色法检测人晶状体上皮细胞的生长活性;原位末端核苷标记(TUNEL)法检测细胞凋亡的凋亡指数(AI),并在电镜下观察TUNEL染色阳性细胞的形态及分布。结果:HG可抑制人晶状体上皮细胞生长,诱导细胞的凋亡,并呈剂量及时间依赖性,HG诱导组细胞凋亡率明显高于正常组(P<0.01)。TUNEL染色法在电镜下观察到HG诱导24h后,TUNEL染色阳性细胞核固缩或碎裂呈棕黄色,细胞大小不一;而TUNEL染色阴性细胞着色均匀,大小均一。结论:高糖具有促使人晶状体上皮细胞凋亡形成的作用,尤其是在120~150mmol/L浓度范围内。     

PCNA在不同年龄组人晶状体上皮细胞中的表达

目的　检测不同年龄组人晶状体上皮细胞增殖细胞核抗原 (PCNA)表达 ,探讨白内障术后残留晶状体上皮细胞的增殖与后囊混浊的关系及儿童后发性白内障高发的原因。方法　按年龄段分为小儿组 (<12岁 )及老年组 (5 1～80岁 )。在白内障手术时环形撕囊后获取晶状体中央区前囊膜 ,用免疫组化染色及真彩色医学图像分析系统检测PCNA的表达及积分光密度值 ,取其均值进行统计学分析。结果　定性检测小儿组 10张切片中 7张阳性 ,2张可疑 ,1张阴性。老年组 2张可疑 ,8张阴性。定量检测 (积分光密度值 )小儿组为 2 89± 0 5 7,老年组为 2 13± 0 63 (P <0 0 5 )。结论　小儿组晶状体上皮细胞PCNA的表达明显高于老年组 ,提示可能为小儿后发性白内障高发的重要因素。通过PCNA表达的检测可能为判断后囊混浊高危眼提供依据     

晚期糖基化终产物对人晶状体上皮细胞TTase表达的影响

目的：观察晚期糖基化终产物对人晶状体上皮细胞硫醇转移酶表达及活性的影响。
　　方法：将体外人晶状体上皮细胞用 AGEs-BSA 浓度为1.5mg/mL,胎牛血清体积分数为10%的DMEM培养液培养,同时设定相同浓度的BSA对照组及空白对照组,分别于0,1,2,3,4 d收集细胞,测定晶状体上皮细胞内ROS含量、TTase 活性, qRT-PCR 检测 TTase mRNA 表达情况, Western blot检测TTase蛋白质表达。
　　结果：与对照组相比, AGEs-BSA干预后,细胞内ROS含量呈时间依赖性增高,差异有显著统计学意义(P<0.01), BSA干预后ROS的表达与对照组无显著差异。 AGEs可诱导TTase的 mRNA表达逐渐增高,2 d时达到峰值,约为正常对照组的5.06倍( P<0.01);而BSA处理组和对照组TTase的mRNA表达差异无统计学意义( P>0.05)。与TTase的mRNA表达类似, TTase活性升高,在3 d达到峰值,为正常对照组的2.01倍( P<0.01)。 Western blot检测发现,TTase蛋白质表达逐渐增加,从3d开始TTase表达与对照组相比差异有统计学意义(P<0.05)。
　　结论：AGEs可能是通过诱导人晶状体上皮细胞发生氧化应激,致使TTase表达上调,活性增强。     

PUMA介导氧化应激诱导的人晶状体上皮细胞凋亡

目的探讨PUMA在氧化应激诱导的人晶状体上皮细胞(human lens epithelialcell,HLEC)凋亡中的作用。方法体外培养的HLEC-B3,用50μmol·L-1H2O2刺激不同的时间后,Hoechst33258染色,凋亡细胞呈核固缩、碎裂形态,计数细胞凋亡率;采用West-ern blot方法检测PUMA及Caspase-3蛋白的表达水平。采用RT-PCR方法检测PUMAmRNA表达水平;设计合成针对人PUMA基因的小干扰片段(siPUMA1、siPUMA2)和一条阴性对照,用lipofectamine2000转染细胞后,验证干扰有效性,观察其对氧化应激诱导的HLEC凋亡的影响。结果 H2O2刺激HLEC4h、8h、12h后,细胞凋亡率分别为3.30%±0.25%、27.16%±0.31%、48.14%±0.57%,凋亡相关蛋白Caspase-3发生时间依赖的表达上调。H2O2可诱导PUMA mRNA及蛋白质表达上调。干扰PUMA的表达能减少H2O2诱导的细胞凋亡,H2O2处理HLEC-B312h后细胞凋亡率为48.24%±0.84%,而敲除PU-MA的表达后细胞凋亡率显著降低为13.72%±1.06%(siPUMA1)和17.56%±0.51%(siPUMA2)。结论 PUMA介导了H2O2诱导的HLEC凋亡,可能在白内障的发生发展中发挥重要作用。     

过氧化氢对人晶状体上皮细胞增生及VEGF表达的影响

目的:研究不同浓度的过氧化氢(H2O2)对体外培养的人晶状体上皮细胞增生及VEGF表达的影响。方法:体外培养的人晶状体上皮细胞系SRA01/04,在培养液中分别加入浓度为1,10,100nmol/L;1,10,100μmol/L和1mmol/L的过氧化氢处理40min,对照组无过氧化氢,随后在正常培养液中继续培养,在0,6,12和24h用MTT方法检测晶状体上皮细胞的增生活力;在24h用ELISA方法检测培养液上清中血管内皮生长因子(VEGF)的含量。结果:在培养液中加入1nmol/L~10μmol/L浓度的H2O2处理组,晶状体上皮细胞增生率(A值)随浓度较对照组明显增加,其中以10nmol/L最为明显;而100μmol/L,1mmol/L处理组,晶状体上皮细胞出现生长抑制。ELISA检测结果显示,1nmol/L~10μmol/L的过氧化氢刺激后,VEGF水平均高于对照组,且呈浓度依赖性,峰值出现在10nmol/L和10μmol/LH2O2处理组。结论:低浓度(1nmol/L~10μmol/L)的H2O2可以促进晶状体上皮细胞增殖,并使VEGF分泌增加;提示VEGF可能作为一种氧化应激产物,对晶状体上皮细胞起到保护、免受损伤的作用。     

晶状体上皮细胞凋亡与过氧化氢诱导白内障形成研究

目的 探讨晶状体上皮细胞凋亡与皮质性白内障形成的关系。方法用200μmol／L过氧化氢(H2O2)诱导离体兔晶状体白内障形成,TUNEL法检测H：0：作用1,6,18,24,48h的晶状体上皮凋亡细胞,同时测定晶状体超氧化物歧化酶(SOD)活性。结果H2O2作用1h,晶状体保持透明,未发现凋亡上皮细胞。随着作用时间的延长,凋亡上皮细胞数量逐渐增多,晶状体逐渐变混浊。SOD活性早期无变化,18h后逐渐降低。结论晶状体上皮细胞凋亡是皮质性白内障形成的细胞学基础,其发生先于晶状体抗氧化机制的变化。     

Quercetin对晶状体上皮细胞HSP70、HSP27表达的调节作用

目的研究大鼠眼钝挫伤后晶状体上皮细胞(LECs)热休克蛋白(HSP)70、HSP27的表达,并给予喂饲Quercetin(HSP阻滞剂),观察Quercetin对LECsHSP70及HSP27表达的调节。方法SD大鼠48只,随机分成拍打组和Quercetin组,每组各24只24眼,右眼为实验眼。拍打组:20g铁球20cm高度拍打眼球100次。Quercetin组:给大鼠喂饲Quercetin(100mg/kg),2-3h后再拍打眼球。RT-PCR检测LECsHSP70、HSP27基因表达。结果钝挫性眼外伤可造成LECsHSP70基因表达的增强,拍打眼球后1hHSP70表达开始升高,3h后达到高峰,24h后降至正常。Quercetin组HSP70基因表达随时间亦出现相应的提高,但与拍打组相比其峰值下降,差异有非常显著性意义。两组HSP27基因表达均无明显改变。结论钝挫性眼外伤中LECsHSP70表达的增强提示HSP70可能在钝挫性外伤性白内障形成过程中对晶状体变性蛋白起保护作用,预先喂饲Quercetin可抑制LECsHSP70基因的表达,其作用机制可能发生于HSP转录水平。     

晶状体上皮细胞凋亡与硒性白内障关系的实验研究

目的 探讨晶状体上皮细胞凋亡与亚硒酸钠诱发的硒性白内障形成的关系。方法 给ＳＤ大鼠注射亚硒酸钠后１,３,７天剥取日状体吓膜。用流式细胞仪（ＦＣＭ）计数晶状体上皮细胞凋亡百分率,ＤＮＡ片断凝胶电泳检测晶状体上皮细胞核提取物,并应用透射电镜观察晶状体上皮细胞凋亡的开矿学变化。结果 给药后第１天晶状体上皮细胞凋亡百分率即显著增高,第３天达高峰,以后逐渐下降。而晶状体混浊程度持续加重,给药后第７天形成典型     

氧化性白内障中晶状体上皮细胞内Ca2+浓度的变化

目的 通过测定过氧化氢诱发的白内障中晶状体上皮细胞内Ca^2 浓度的变化，探讨Ca^2 浓度的改变在氧化性白内障发生机制中的作用。方法 用过氧化氢诱发实验组离体培养的大鼠晶状体产生白内障，用Fura-2／AM荧光标记法测定晶状体上皮细胞胞浆内Ca^2 的浓度，并与对照组正常晶状体相比。结果 经过氧化氢作用的实验组，6、12和24h时，晶状体上皮细胞胞浆内Ca^2 浓度与对照组相比明显升高，差异有显著性(P=0．001，0．000，0．000)。结论 本研究证实过氧化氢作用于大鼠晶状体后，其上皮细胞内Ca^2 浓度明显升高，从而为Ca^2 依赖的蛋白水解酶如钙蛋白酶等的激活创造必要条件。