流行性乙型脑炎病毒E蛋白基因的克隆及高效表达研究进展

流行性乙型脑炎（Epidemic Encephalitis B）是乙型脑炎病毒（Encephalitis B Virus）,又称日本脑炎病毒（Japanese Encephalitis Virus,JEV）引起的中枢神经系统的急性传染病。我国是乙脑发病人数最多的国家。占世界总发病数的80％以上,病死率10％以上。幸存者中约有15.3％留有不同程度的后遗症。目前临床上没有针对病原的特效治疗,只能对症处理.     

载脂蛋白M基因启动子的克隆及荧光素酶报告基因载体的构建

目的为深入研究载脂蛋白M(ApoM)基因的表达调控机制,对ApoM基因启动子序列进行克隆,并构建不同长度启动子荧光素酶报告基因载体。方法在NCBI人类基因组数据库中截取并下载ApoM基因转录起始位点5’侧翼区约2kb的基因组序列设计PCR扩增引物,从健康外周血中扩增获得该片段,以此序列为基础进行亚克隆,分别获得6条5’端不等、3’端平齐的片段,最后插入pGL3-Basic表达载体。结果获得了6条长度差别约为200bpApoM启动子片段,并构建了不同长度的pGL3-ApoM真核表达载体。结论上述载体的成功构建及序列分析为进一步研究ApoM基因的启动子活性及基因表达调控奠定了基础。     

人白介素-15基因系列启动子克隆及其荧光素酶报告基因载体的构建

目的克隆人白介素-15(IL-15)基因系列启动子,构建IL-15基因启动子荧光素酶报告基因载体。方法通过PCR方法从HaCaT细胞基因组DNA中获得IL-15基因编码序列5′上游七段逐步缺失的IL-15启动子序列;双酶切后,分别重组到含萤火虫荧光素酶的报告基因pGL3-Basic载体上,构建IL-15基因系列启动子报告基因载体;用脂质体转染法将含最长启动子序列的报告基因载体转染至HaCaT细胞,并设置空白对照组和LPS组分别处理;24 h后采用双荧光素酶报告基因系统检测其启动子活性。结果经PCR方法扩增出七段逐步缺失的IL-15基因启动子片段,PCR及双酶切鉴定各重组体构建正确;瞬时转染HaCaT细胞后经报告基因检测得知所克隆最长序列具有启动子活性。结论成功构建了IL-15系列启动子报告基因载体,并在HaCaT细胞中初步活性分析得知所克隆IL-15基因调控系列内包含启动子核心区域,为进一步研究IL-15表达调控机制奠定了实验基础。     

小鼠对乙型脑炎减毒疫苗株SA14-14-2的免疫应答

中国使用的乙型脑炎（JE）减毒活疫苗株SA14-14-2是由野毒株SA14减毒而来。SA14-14-2株在小鼠中的神经毒力明显低于SA14株。本文作者将SA14和SA14-14-2株在BHK-21细胞内蚀斑纯化后再在C6/36细胞内传3代,分别得到SA(V）和SA(A）株。对4周龄ICR品系小鼠腹腔接种10~4空斑形成单位（PFU）SA(V）或SA（A）,于接种后不同时间取脑、脾和血液,用BHK-21细胞蚀斑法     

乙型脑炎病毒C蛋白编码基因重组质粒构建与表达

目的构建流行性乙型脑炎病毒(JEV)C蛋白编码基因重组子并鉴定。方法以JEV SA14-14-2株总RNA为模板,应用反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)方法扩增JEV C蛋白编码基因,克隆至pMD19-TSimple载体测序。为便于分析JEV C蛋白编码基因重组子在哺乳动物细胞中的表达,在JEV C蛋白编码基因5′端附加FLAG序列,并亚克隆至pcDNA 3.1(+)载体中,构建重组子pJc并经酶切及DNA测序分析。脂质体法将pJc转染中华仓鼠卵巢(CHO)细胞。免疫荧光检测转染的CHO细胞中JEV C蛋白分布与表达。结果 pJC经BamH I/EcoR I酶切释出的插入子片段(414bp)分别与预期结果相符合。所编码的融合蛋白主要分布于胞质,少量分布于胞膜。结论 pJC成功构建,转染的CHO细胞可表达JEV C蛋白。     

韩国儿童初免和加强免疫乙型脑炎病毒SA14-14-2株疫苗后的免疫应答

乙型脑炎病毒（ＪＥＶ）ＳＡ１４－１４－２株减毒活疫苗由中国研制，为评价其在中国以外地区的使用效果，作者对韩国儿童初次和加强免疫该疫苗后的免疫应答进行了研究。研究对象为乙型脑炎低流行区的１～３岁儿童，对８４名儿童接种由中国成都生物制品研究所生产的ＳＡ１４－１４－２疫苗，滴度为６．８ｌｏｇ＿（１０）ｐｆｕ／０．５ｍｌ，其中６８名儿童为初免，１６名儿童有ＪＥＶ灭活疫苗接种史或ＪＥＶ接触史。另外，以２５名接种过２剂灭活疫苗（中山株）的儿童作为对照。采集所选对象免疫前和免疫后４周的静脉血，用蚀斑减少中和试…     

单剂SA14-14-2疫苗预防乙型脑炎效果的病例对照研究

自 1 98 8年乙型脑炎 ( JE)减毒活疫苗( SA1 4 - 1 4 - 2 )在中国批准生产以来 ,约 1 .2亿儿童在 1、2、6岁接种了 3针该疫苗。一项病例对照研究表明 :SA1 4 - 1 4 - 2疫苗在该人群中免疫 2剂的保护率为 98% ,而单剂效果仅为 80 % ( 4 4%～ 93% )。但另一些研究结果表明 :单剂 SA1 4 - 1 4 - 2疫苗在儿童中能诱导较高的抗体阳转率。本研究旨在进一步证实后一种研究结果。　　作者以 JE高度流行的亚洲国家——尼泊尔为研究地区 ,该国于 1 999年 7月 1 1～ 2 4日进行了预防 JE免疫活动。对 1～ 1 5岁儿童皮下注射了 1剂冻干 SA1 4 - 1 4…     

乙型脑炎病毒及疫苗研究进展

乙型脑炎病毒是黄病毒科中致病性最强的病毒之一,目前对该病毒的分子生物学研究进展较快.现阶段国内外主要使用三种类型疫苗,即鼠脑纯化灭活疫苗、原代地鼠肾细胞灭活疫苗和原代地鼠肾细胞减毒活疫苗.灭活疫苗和减毒活疫苗各有利弊.基因工程疫苗(包括载体重组活疫苗、嵌合减毒活疫苗、病毒样颗粒、亚单位疫苗及DNA疫苗)成为乙型脑炎疫苗发展的方向.     

HMGN2重组表达质粒的构建及其抗乙型病毒性肝炎的病毒活性

目的：构建HMGN2重组表达载体并观察高迁移率蛋白HMGN2分子的抗乙型病毒性肝炎的病毒作用。方法用基因克隆的方法,构建pET -32 a-c （＋）-HMGN2重组表达质粒;用亲和层析的方法,纯化His-HMGN2融合蛋白, Tricine-SDS-PAGE电泳、Western blotting对纯化得到的HMGN2分子进行分子鉴定。以HBV DNA转染的细胞株HepG2.2.15细胞为模型,用ELISA检测HBV表面抗原（HBsAg）及e抗原（HBeAg）,用实时荧光定量PCR法检测HBV DNA的含量。结果成功构建了pET-32a-c（＋）-HMG17重组表达质粒,其表达的融合蛋白可显著抑制HBeAg和HBsAg的表达,降低HBV DNA拷贝数。结论 HMGN2在体外细胞培养中有直接抗HBV的活性。     

人HOXA1 3'-非翻译区荧光素酶报告基因载体的构建及鉴定

目的:针对人同源异型盒A1(HOXA1)基因的3'端非翻译区(3'-untranslated region,3'-UTR)构建HOXA1的荧光素酶报告基因载体,对其克隆进行鉴定并挑选出正确的克隆,为后续功能研究提供基础。方法:PCR扩增包含HOXA1 3'-UTR的DNA片段,克隆至荧光素酶载体psiCHECK-2,构建HOXA1 3'-UTR荧光素酶报告基因载体,经Not I和Xho I双酶切后测序进行鉴定。结果:克隆获得的DNA片段大小及序列与GenBank报道的一致,且插入方向正确。结论:成功构建了含hURAT1基因3'UTR区的荧光素酶报告载体,可用于后续功能研究。     

乙型脑炎减毒活疫苗SA14-14-2在BHK21细胞上传代后的基因序列研究

目的：研究乙型脑炎减毒活疫苗SA14-14-2在BHK₂₁细胞上传代后的病毒基因序列,以深入控制乙型脑炎减毒活疫苗的安全性。方法：将乙型脑炎减毒活疫苗SA14-14-2在BHK₂₁细胞上连续传代,选取第二代病毒（P2）、第五代病毒（P5）、第十五代病毒（P15）提取RNA,反转录为cDNA后,进行各代病毒全基因序列分析,分析与乙型脑炎病毒毒力密切相关的关键位点基因是否发生改变。结论：乙型脑炎减毒活疫苗SA14-14-2在BHK₂₁细胞上传5代后,病毒E蛋白上关键基因第279位（E279）氨基酸由甲硫氨酸（M）突变为赖氨酸（K）。     

sTRAIL基因的克隆及其在大肠杆菌中的表达

克隆TRAIL基因的95-281位(sTRAIL)，构建表达载体，建立原核表达体系，优化诱导表达的条件。分离人外周血淋巴细胞，提取总RNA，RT-PCR，克隆sTRAIL的cDNA，构建原核表达载体，优化IPIG诱导的条件。结果：(1)克隆了TRAIL基因95-281位的cDNA，DNA测序结果与报道的一致。(2)构建了sTRAIL基因的原核表达载体，酶切结果与预期的一致。(3)转化宿主菌，优化IPIG诱导条件，发现3mmol/L，诱导3～4h表达最好。sTRAIL基因的克隆及表达为下游中试发酵及纯化奠定了上游的基础，也为研究TRAIL抗肿瘤的机制提供了可能。     

乙型脑炎减毒活疫苗病毒群体的异质性分析

 目的  通过观察疫苗病毒群体中病毒个体的遗传和生物学特征,分析SA14-14-2株乙型脑炎减毒活疫苗病毒的均一性,为疫苗病毒的遗传稳定性提供实验证据。 方法   对3批疫苗病毒连续进行3次蚀斑纯化后,各挑选8个蚀斑纯化株,扩大培养一代。比较24个病毒纯化株的包膜（envelope,E）蛋白基因序列、单斑培养病毒滴度以及蚀斑特征。 结果   24个纯化株中共有6个病毒株（25%）的E蛋白核苷酸发生变化,其中2株（8.3%）的核苷酸变异导致其编码氨基酸发生改变,这些变异占总核苷酸变异数的28.6%。动物实验表明,这2个纯化株没有引起小鼠神经毒力变化。在所有24个纯化株中,我国2010年版药典规定的影响疫苗病毒遗传稳定性的8个E蛋白关键位点的氨基酸均未发生改变。24个纯化株病毒的蚀斑大小和形态以及单斑培养滴度均无明显差异。 结论   疫苗病毒具有典型的准种群体多样性特征,但在群体病毒中未检测到E蛋白氨基酸位点为野生型病毒位点的个体病毒,因此,疫苗病毒具有很好的减毒群体特征和遗传稳定性。     

我院近2年抗感染药物应用分析

目的了解我院抗感染药物应用趋势,为临床合理用药及药品的科学管理提供参考.方法利用药库微机信息系统所提供的数据,统计各类抗感染药物消耗金额及排序,并加以分析.结果抗感染药物中消耗金额位于前3位的分别是头孢菌素类、青霉素类、喹诺酮类.结论上述3类药物在未来抗感染药物应用中仍将占据主要地位,其中喹诺酮类药物的应用将会进一步增加.     

pCEP4/hIL-17真核表达载体的构建及表达

目的构建pCEP4/hIL-17载体及在真核细胞中表达hIL-17/mFc融合蛋白;初步研究IL-17生物学特性。方法采用RT-PCR的方法克隆hIL-17CDS段基因序列;将测序正确的hIL-17序列插入pCEP4质粒构建pCEP4/IL-17真核表达载体,转染中华仓鼠卵巢(CHO)细胞后,筛选阳性表达细胞株;并用RT-PCR、ELISA和Western blot等法鉴定IL-17基因的mRNA和蛋白表达;流式细胞术分析纯化的蛋白对Raji细胞表达的hIL-17受体的结合能力;以体外实验验证其促炎症作用。结果成功构建了pCEP4/hIL-17重组载体,并在CHO细胞中稳定表达;所获得hIL-17重组蛋白能稳定结合Raji细胞上的IL-17受体;体外刺激HeLa细胞,能明显促进IL-6等炎症因子的分泌。结论稳定表达hIL-17重组蛋白的CHO细胞系的建立,为进一步研究hIL-17的生物学功能奠定了良好的基础。     

我院1999年～2000年抗感染药物应用分析

目的分析抗感染药物的应用现状和发展趋势,以引导临床合理用药.方法对我院1999年～2000年抗感染药物种类、用量、金额和DDDs等进行归类统计、比较和分析.结果我院抗感染药物用药金额占全部药品金额的7.9%,β内酰胺类药物在用量、金额、DDDs排序中均列第1位;合资、进口药品分别为国产药品金额的7.8倍和5.6倍.结论分析结果对我院合理应用抗感染药物有一定的参考价值     

沙樱桃黄酮对小鼠Hep、U14抑制作用及其机制探讨

目的　探讨沙樱桃黄酮对Hep、U1 4肿瘤的抑制作用及其机制。方法　BALB/c小鼠右前肢腋皮下接种Hep或U1 4瘤细胞 ,2 4h后ip沙樱桃黄酮或结合 5 Fu ,对抑瘤率以及免疫功能进行测定。结果　沙樱桃黄酮 1 0 0mg·kg- 1 ·d- 1 或结合 5 Fu(1 0 0mg·kg- 1 ·d- 1 )ip后 ,对Hep、U1 4肿瘤的抑制率分别为 34 1 1 %、32 1 4 %和 50 73 %、47 2 2 % ;对小鼠网状内皮系统吞噬功能、免疫器官的重量及血清溶血素生成值均有明显的提高且均有统计学意义 (P <0 0 5)。结论　沙樱桃黄酮的抑瘤作用机制可能通过对免疫系统的保护作用来实现的     

重组真核质粒pEGFP-C2-hG3BP-Domain(1～5)的构建及表达

目的:将人类G3BP(Ras-GTPase activating protein SH3 domain binding protein)蛋白Domain(1～5)基因片段分别定向连入pEGFP-C2质粒,使G3BP蛋白各功能片段与绿色荧光蛋白在HeLa细胞内融合表达。方法:以重组质粒pEGFP-C1-G3BP为模板,PCR法扩增出目的基因,利用EcoRⅠ和BamHⅠ双酶切法将目的片段连接到pEGFP-C2载体上,再将构建成功的pEGFP-C2-hG3BP-Domain(1～5)重组质粒转染入HeLa细胞内,以荧光显微镜及Western印迹法检测绿色荧光蛋白与目的蛋白的融合表达情况。结果:以单/双酶切及基因测序法鉴定构建的重组质粒均无误,荧光显微镜及Western印迹结果均检测到绿色融合蛋白的表达。结论:重组pEGFP-C2-hG3BP-Domain(1～5)质粒成功构建并表达。     

我院内、外科抗感染药应用分析

目的为临床合理应用抗感染药提供参考。方法抽查2000年9月～2000年11月我院内、外科病区各1个,用限定日剂量计算抗感染药的消耗,对抗感染药的应用情况进行统计分析。结果用量排序前几位的是β－内酰胺类抗感染药、喹诺酮类抗感染药及其它类抗感染药中的磷霉素。结论大多数抗感染药的药物利用指数小于1,但合理用药意识还需进一步增强。