PD⁃1/PD⁃L1免疫检查点抑制剂在肺癌临床研究中的进展

免疫治疗已经在肺癌治疗策略中占据重要地位,其中PD?1/PD?L1免疫检查点抑制剂成为该领域的研究热点。PD?1/PD?L1抑制剂可通过阻断PD?1/PD?L1通路重新激活宿主的抗肿瘤免疫应答,已有大量临床研究证明其可以显著改善多种类型癌症包括肺癌的临床终点。基于各项临床研究成果,目前已有4个PD?1/PD?L1抑制剂——Pembrolizumab、Nivolumab、Atezolizumab、Durvalumab经FDA批准用于非小细胞肺癌或小细胞肺癌的一二线治疗或巩固治疗。文章将对PD?1/PD?L1抑制剂在肺癌临床研究中的进展,包括单药或联合用药的疗效、安全性、疗效预测标志物等方面进行综述,旨在为肺癌免疫治疗的临床应用提供依据。     

人源抗c⁃Met抗体与rAGAP偶联物对卵巢癌细胞生物学特性的影响

目的：制备人源抗c?Met的全分子抗体（c?Met?IgG1）及其与重组东亚钳蝎镇痛抗肿瘤多肽（recombinant analgesic?antitumor peptide,rAGAP）偶联的新型抗体（c?Met?IgG1?rAGAP）,分析它们的生物学特性,检测其对卵巢癌细胞生物学行为的影响。方法：以本实验室保存的人源抗c?Met抗体基因为模板,构建c?Met?IgG1?rAGAP真核表达载体并转染真核细胞,表达并纯化抗体偶联物。通过亲和力检测、免疫荧光、流式细胞术等方法,评估c?Met? IgG1和c?Met?IgG1?rAGAP的生物学特性。通过CCK?8、划痕实验、Transwell侵袭实验检测抗体对卵巢癌细胞增殖、迁移和侵袭的影响。结果：成功制备出能够与c?Met蛋白特异性结合的c?Met?IgG1和c?Met?IgG1?rAGAP两种抗体;一系列实验证明了c?Met?IgG1和c?Met?IgG1?rAGAP均可抑制c?Met阳性的卵巢癌细胞HO8910的增殖、迁移、侵袭,且c?Met?IgG1?rAGAP对卵巢癌细胞的抑制作用要强于c?Met?IgG1,而在c?Met阴性的IOSE386细胞中并未观察到这些作用。结论：研究结果表明c?Met?IgG1?rAGAP可靶向作用于c?Met阳性的卵巢癌细胞并具有抗肿瘤活性,可为探索卵巢癌的分子靶向治疗奠定研究基础。     

洛铂对肝癌肿瘤免疫及PD⁃L1表达的影响

目的：探讨洛铂（lobaplatin,LBP）对肝癌肿瘤免疫及程序性死亡配体1（prag rammed cell death 1 ligand,PD?L1）调控表达的作用及机制。方法：①73例肝细胞癌患者随机分为对照组（n=33）和洛铂组（n=40）,两组均接受肝癌切除术,洛铂组术中腹腔灌注洛铂（50 mg）,比较两组患者手术前后外周血淋巴细胞亚群变化。②Hep3B肝癌细胞以洛铂（16 μmol/L）处理24 h,流式细胞术测定人白细胞抗原Ⅰ类分子（human leucocyte antigenI,HLA?Ⅰ）,抗原转运蛋白TAP?1、TAP?2表达。③Hep3B、SMCC?7721、HepG2肝癌细胞以洛铂（0、8、16 μmol/L）处理24 h,用Western blot、RT?qPCR测定其PD?L1、AKT、p?AKT表达情况。④将Hep3B肝癌细胞分为洛铂组（16 μmol/L）、AKT抑制剂组（洛铂16 μmol/L + MK2206 1 μmol/L）和对照组,处理24 h后Western blot测定PD?L1表达。结果：①洛铂组患者手术前后外周血CD4+、CD4+/CD8+比值升高,Treg细胞下降（P < 0.05）。对照组差异无统计学意义（P > 0.05）。②洛铂处理后,Hep3B肝癌细胞HLA?Ⅰ、TAP?1和TAP?2表达增高。③洛铂处理后,Hep3B、SMCC?7721、HepG2肝癌细胞PD?L1、p?AKT表达增加。④AKT抑制剂组Hep3B肝癌细胞PD?L1表达相比洛铂组下降。结论：洛铂可以提高肝癌患者抗肿瘤免疫,可能是通过上调肝癌细胞抗原呈递组件表达,增强肿瘤免疫原性导致。同时洛铂能够上调肝癌细胞PD?L1表达,其机制可能涉及AKT信号通路。     

靶向PD⁃L1分子的 RNAi增强树突状细胞疫苗对胰腺癌治疗作 用的实验研究

目的：研究通过 RNA干扰敲减程序性死亡受体配体 1（programmed death receptor ligand 1,PD?L1）分子能否增强树 突状细胞疫苗对胰腺癌的治疗作用。方法：免疫组化法检测42例胰腺癌及对应胰腺组织中PD?L1的表达差异;纯化CD8+T细 胞和制备成熟的树突状细胞（DC）,将低表达PD?L1的Panc?1细胞Panc?1/PD?L1?RNAi、阴性对照Panc?1/LV?Control细胞以及野 生型Panc?1细胞分别与CD8+T细胞+DC疫苗共同培养,检测细胞上清中干扰素（IFN）?γ表达水平;3组肿瘤细胞分别建立人源 化严重免疫缺陷（severe combined immunodeficiency,SCID）小鼠胰腺癌皮下移植瘤模型,以 DC疫苗为治疗手段进行尾静脉注 射,观察肿瘤生长情况。结果：免疫组化实验显示,胰腺癌组织较胰腺组织中PD?L1高表达,差异有统计学意义（P＜0.001）。T 细胞反应实验显示,PD?L1敲减肿瘤细胞组与DC和CD8+T细胞共同培养的上清中IFN?γ表达水平明显高于其他2个对照组,差 异有统计学意义（P＜0.001）。人源化SCID小鼠体内荷瘤实验显示,敲减PD?L1表达与应用DC疫苗治疗胰腺癌皮下移植瘤具 有协同作用。结论：胰腺癌较胰腺组织中PD?L1高表达,敲减胰腺癌细胞PD?L1表达与应用DC疫苗治疗可能是胰腺癌免疫治 疗的有效策略。     

METTL3蛋白的表达水平对NSCLC患者PD⁃1抑制剂疗效的预测价值

目的：探讨甲基化转移酶3（methyltransferase?like 3,METTL3）联合程序死亡配体1（programmed death ligand 1,PD?L1）检测在非小细胞肺癌（non?small cell lung cancer,NSCLC）患者程序性细胞死亡蛋白1（programmed death cell protein 1,PD?1）抑制剂治疗效果和预后预测中的价值。方法：收集NSCLC患者原发病灶组织蜡块标本,免疫组织化学检测PD?L1、METTL3的蛋白表达情况,并分析其与NSCLC患者PD?1抑制剂治疗效果和预后间的联系。结果：符合入组标准的患者共228例;其中,METTL3蛋白的表达情况与病理类型、美国东部肿瘤合作组织（Eastern American Oncology Collaborative Group,ECOG）评分、治疗方案、治疗效果以及实体瘤疗效评价标准（response evaluation criteria in solid tumors,RECIST）等因素有关;METTL3蛋白高表达患者的中位无进展生存期（progression?free?survival,PFS）为12.33个月,METTL3蛋白低或无表达患者的中位PFS为6.50个月;在接受PD?1抑制剂治疗的NSCLC患者中,METTL3蛋白高表达患者有较长的PFS;METTL3蛋白高表达患者的中位总体生存期（overall?survival,OS）为23.54个月,METTL3蛋白低或无表达患者的中位OS为20.93个月,METTL3蛋白高表达与较长的OS相关。结论：METTL3蛋白可能为预测NSCLC PD?1抑制剂免疫治疗效果的标志物。     

抗人双特异性蛋白磷酸化酶Dusp23单克隆抗体的制备及鉴定

目的制备高亲和力、高特异性的抗人双特异性磷酸化酶23(Dusp23)单克隆抗体,并对其生物学特性进行鉴定,为Dusp23功能的研究奠定基础。方法以纯化的原核表达Dusp23为免疫原,免疫BALB/c小鼠,待免疫小鼠血清效价满足融合需要,取其脾细胞与Sp2/0细胞融合,经多次筛选及克隆化建立可稳定分泌抗Dusp23单克隆抗体的杂交瘤细胞株,将细胞株打入BALB/c小鼠腹腔制备腹水,用ProteinG亲合层析柱纯化所得腹水获得纯化抗体,ELISA及Western-blot检测抗体的效价和亲和力,并用亚型鉴定试纸条鉴定单克隆抗体的亚型。利用纯化后的两株单克隆抗体对临床收集的肝癌组织标本进行免疫组化分析。结果筛选到2株(N012和N013)可以稳定分泌人双特异性磷酸化酶23(Dusp23)单克隆抗体的细胞株,并对其进行纯化和鉴定,两株杂交瘤细胞培养上清效价分别为1:5120和1:2560,腹水效价分别为1:25600和1:12800,以肝癌细胞HepG2和重组Dusp23蛋白为抗原,利用纯化后的两株抗体Western-blot鉴定结果均在预期位置出现阳性条带。两株杂交瘤细胞分泌抗体的亚型鉴定N012和N013均为Ig...     

人源抗HER2单链抗体/轻链恒定区/鱼精蛋白截短体融合蛋白的基因构建、表达及活性鉴定

目的:构建人抗HER2单链抗体(ScFv)/人轻链恒定区(Ck)/鱼精蛋白截短体(tP)融合蛋白基因,在大肠杆菌中表达、纯化并分析该融合蛋白的活性.方法:设计引物扩增人抗HER2单链抗体e23sFv基因和轻链恒定区编码序列(Ck),连接成ScFv/Ck片段,人工合成tP序列,连接于ScFv/Ck末端,构建成ScFv/Ck/tP融合基因,将其克隆入原核表达载体pET32a后,在大肠杆菌BL21(DE3)LysS中诱导表达,表达产物经SDS-PAGE和Western Blot鉴定后,用Ni-NTA螯合层析介质纯化.细胞ELISA分析ScFv/Ck/tP融合蛋白抗原亲合活性,凝胶迁移实验检测ScFv/Ck/tP融合蛋白与DNA的结合活性.结果:成功构建了人抗HER2 ScFv/Ck/tP融合基因,经IPTG诱导后在大肠杆菌中实现了可溶性表达.表达的ScFv/Ck/tP融合蛋白保持了与抗原的结合活性,同时具有结合DNA的能力.结论:ScFv与Ck,tP融合后,同时具有抗原和DNA结合活性,为该ScFv用于HER2阳性肿瘤的靶向基因治疗奠定了基础.     

CD3/CD19双特异性单克隆抗体的制备、鉴定及其再导向的研究

目的制备ＣＤ３／ＣＤ１９双特异性单克隆抗体（ＢｓＡｂ）并研究其生物学作用。方法采用杂交－杂交瘤技术制备ＢｓＡｂ，以双亚类ＥＬＩＳＡ和细胞结合试验确证ＢｓＡｂ的存在，再用５１Ｃｒ释放试验证实ＢｓＡｂ的再导向细胞毒效应。结果获得３株ＣＤ３／ＣＤ１９四源杂交瘤细胞，其中１株已成为稳定分泌ＣＤ３／ＣＤ１９ＢｓＡｂ的四源杂交瘤细胞株。细胞毒试验表明ＣＤ３／ＣＤ１９ＢｓＡｂ上清、ＣＤ３／ＣＤ１９纯化抗体以及ＣＤ３／ＣＤ１９化学交联ＢｓＡｂ都能增强ＣＤ３激活杀伤细胞（ＣＤ３ＡＫ细胞）对Ｎａｌｍ－６靶细胞的杀伤作用（Ｐ＜０．０５～０．００１）。结论ＣＤ３／ＣＤ１９ＢｓＡｂ具有显著的再导向激活Ｔ细胞杀伤特异肿瘤靶细胞的功能，提示该ＢｓＡｂ有临床应用的潜在价值。     

病毒肽/HLA-A2复合物与抗转铁蛋白受体单链抗体融合蛋白的构建、表达及鉴定

目的 制备抗转铁蛋白受体单链抗体与病毒肽/HLA-A2的融合蛋白.方法 利用重组DNA技术将HLA-A2基因和转铁蛋白受体单链抗体(TfRscFv)基因,用柔性的linker(Gly-4-Ser)3连接并克隆到原核表达载体pET28a(+)上,转化大肠埃希菌BL21(λDE3)菌株,获取重组子,经IPTG诱导表达目的 蛋白.将纯化的目的 蛋白和β 2微球蛋白(β 2m)与HLA-A2限制性的乙肝病毒(HBV)核心抗原肽HBcAg 18-27在体外进行稀释复性,形成HBcAg 18-27/HLA-A2/TfRscFv融合蛋白.利用ELISA和微球结合试验检测融合蛋白的空间构象.结果 构建的融合蛋白基因具有正确的序列,经IPTG诱导后以包涵体形式表达的蛋白分子量正确,体外稀释复性后的融合蛋白具有正确的HLA-A2空间构象.结论 成功构建了HBcAg 18-27/HLA-A2/TfRscFv融合蛋白,为进一步将该融合蛋白通过其单链抗体加载到肿瘤细胞表面从而诱导乙肝病毒肽特异性细胞毒性T淋巴细胞杀伤肿瘤细胞奠定了物质基础.     

PD-L1蛋白的表达、纯化与鉴定

目的克隆人PD-L1的基因,纯化Flp-In CHO系统表达PD-L1蛋白.方法用RT-PCR方法制备PD-L1基因,以哺乳细胞高效表达质粒载体pSec/WG为载体构建重组PD-L1/pSec/WG质粒,重组体用载体上的通用引物为测序引物,鉴定克隆的正确性.再将鉴定过的重组质粒用脂质体法转化转染Flp-In CHO细胞收集上清,G蛋白亲和层析法纯化蛋白.用免疫印迹法鉴定转化细胞所分泌上清的PD-L1基因的表达.结果正确构建了PD-L1/pSec/WG重组质粒,并且在转化细胞所分泌的上清中检测出了PD-L1基因的表达.亲和层析法成功纯化出PD-L1蛋白,分子量为40×10 3.结论成功地构建了PD-L1/pSec/WG重组质粒,纯化出PD-L1蛋白,可进行下一步mAb制备,进一步研究其功能.     

抗前列腺癌/抗CD3双特异性单链抗体的构建及表达

目的 构建并表达抗前列腺癌／抗人CD3双特异性单链抗体,观察其生物学活性及临床意义。方法 利用PCR方法及分子生物学基因克隆技术,构建抗前列腺癌／抗人CD3双特异性单链抗体融合基因,测序正确后,利用EcoRⅠ和HindⅢ酶切位点,将融合基因亚克隆入真核表达载体进行表达,表达产物纯化后,利用流式细胞仪进行生物学活性测定。结果 经酶切、测序分析证实插入的基因片段大小为1．5kb,序列与设计完全一致;SDS-PAGE和Western印迹实验证明：表达产物分泌于细胞培养上清,相对分子质量为6l000;流式细胞仪结果显示：双特异性单链抗体与PBMC和PC-3细胞的阳性结合率分别为54．1％和53．7％。结论 抗前列腺癌／抗人CD3双特异性单链抗体具有较好的生物学活性,为进一步的体内实验奠定了基础。     

PD1:PD-L1/PD-L2通路在结核感染中的免疫作用

PD-1：PD-L1／PD-L2通路在肿瘤和某些感染性疾病中发挥免疫抑制作用,而在结核病中的免疫作用尚不明确。结核菌感染后,免疫细胞上PD-1：PD-L1／PD-L2通路高表达,体外实验显示：用该通路的抗体阻断后保护性T细胞增强,而体内免疫作用不明确。PD-1与配体PD-L1结合后可能发挥免疫抑制作用,其中 PD-L1表达受Th1细胞因子调控;PD-1与配体PD-L2结合后可能发挥免疫保护作用,其中PD-L2表达受Th2型细胞因子调控。利用Cas9-CRISPR基因敲除方法分别敲除特定免疫细胞上PD-1、PD-L1和PD-L2,可研究PD-1、PD-L1和PD-L2在结核感染中免疫作用及机制,为结核病的防控提供理论依据。     

胃癌组织中nm23-H1、c—Met和survivin蛋白表达及临床意义

目的探讨胃癌组织中nm23-H1、c—Met、survivin蛋白表达及其临床意义。方法对50例胃癌蜡快标本,运用S-P免疫组化技术检测nm23-H1、c-Met、survivin蛋白表达情况。并分析各基因表达与胃癌组织的分化程度、浸润深度、淋巴结转移、TNM分期及转移和复发之间的关系。结果nm23-H1、c—Met、survivin蛋白表达率分别为46％、72％、80％,胃癌TNM分期、淋巴结转移与nm23-H1蛋白低表达有密切关系,c—Met蛋白的高表达与胃癌TNM分期、淋巴结转移有密切关系,survivin蛋白的高表达与胃癌分化程度、TNM分期、淋巴结转移有密切关系,nm23-H1蛋白表达与survivin表达呈负相关,c-Met蛋白的表达与survivin表达呈正相关。结论nm23-H1蛋白低表达和c—Met、survivin高表达对于早期诊断和预后分析有重要指导意义,据其表达开展有选择性地基因治疗应有一个良好的应用前景。     

抗PD-1/PD-L1治疗在肿瘤治疗中的研究进展

 程序性死亡蛋白-1(programmed death protein-1, PD-1)和程序性死亡配体-1(programmed death-ligand 1, PD-L1)是一对免疫共抑制分子。以PD-1/PD-L1为靶点的药物重新激活了机体自身的抗肿瘤免疫并且在多种肿瘤中取得了良好而持久的疗效。然而,如何预测患者是否对治疗敏感及如何联合其他治疗提高抗PD-1/PD-L1治疗的反应率目前尚无定论。本文主要综述了PD-1/PD-L1通路的作用机制、抗PD-1/PD-L1治疗的研究进展,并探讨了预测抗PD-1/PD-L1疗效的生物标记物及联合免疫治疗的进展。     

人抗HBsAg单链抗体-Tat融合基因的构建、表达及表达产物的活性鉴定

目的: 构建人抗HBsAg单链抗体-Tat蛋白转导结构域(ScFv-Tat)融合基因,在大肠杆菌中进行表达,并分析ScFv-Tat融合蛋白的活性及内化情况. 方法: 设计引物扩增人抗HBsAg单链抗体基因,克隆入含有蛋白转导结构域Tat序列的原核表达载体pTAT-HA,在大肠杆菌BL2l(DE3)LysS内诱导融合蛋白表达. 表达产物用SDS-PAGE及Western blot鉴定,用亲和层析柱纯化. 间接ELISA和ELISA竞争抑制实验分析ScFv-Tat融合蛋白的亲和活性,将纯化蛋白与HBsAg阳性或阴性肝癌细胞共孵育后,免疫细胞化学染色分析ScFv-Tat融合蛋白的结合及内化情况. 结果: 成功地构建了人抗HBsAg单链抗体-Tat融合蛋白的原核表达载体,在IPTG诱导下获得了表达,表达的ScFv-Tat融合蛋白具有与HBsAg结合的活性,并且能够特异性内化入HBsAg阳性肝癌细胞. 结论: 单链抗体与Tat蛋白转导结构域融合后,实现了ScFv-Tat融合蛋白的特异性内化,为该单链抗体的进一步应用奠定了基础.     

人抗HBsAg单链抗体/鱼精蛋白截短体融合蛋白基因的构建、表达及活性鉴定

目的:构建人抗HBsAg单链抗体(ScFv)/鱼精蛋白截短体(truncated protamine, tP)融合基因,在大肠杆菌中进行表达纯化并分析ScFv/tP融合蛋白的活性. 方法:设计引物扩增人抗HBsAg ScFv HBs15基因,在其3'端引物引入tP的编码基因,PCR扩增获得ScFv/tP融合基因,将其克隆入原核表达载体pET-32a后,在大肠杆菌BL2l(DE3)LysS内诱导表达. 表达产物经SDS-PAGE及Western blot鉴定后,用Ni-NTA螯合层析介质纯化. 间接ELISA分析ScFv/tP融合蛋白的亲和活性,凝胶迁移阻滞实验检测ScFv/tP融合蛋白与DNA结合的情况. 结果:成功获得人抗HBsAg ScFv/tP融合基因,经IPTG诱导后在大肠杆菌中表达,表达的ScFv/tP融合蛋白不仅保持了与HBsAg结合的能力,同时具有DNA结合活性. 结论:ScFv与tP融合后,同时具有与抗原和DNA结合的活性,为该ScFv的进一步应用奠定了基础.     

食管鳞状细胞癌(ESCC)中PD-1/PD-L1/PD-L2的表达与临床因素及预后的相关性

 目的 检验程序性细胞死亡分子1（programmed cell death-1,PD-1）/PD配体1（PD ligand-1,PD-L1）/PD配体2（PD-L2）在食管鳞状细胞癌（esophageal squamous cell carcinoma,ESCC）患者中的表达,并评估其与临床特征及预后的关系。方法 收集2007年1月至12月在复旦大学附属中山医院胸外科接受手术治疗的325例食管肿瘤患者的临床数据,通过免疫组织化学染色分析石蜡包埋的肿瘤样品及部分对应的癌旁组织中PD-1、PD-L1和PD-L2的表达,用免疫反应评分并分析其与临床特征及预后的关系。结果 PD-1、PD-L1、PD-L2三者阳性表达率分别为12.0%、52.6%、32.9%,PD-L（P<0.001）、PD-L1（P<0.001）、PD-L2（P=0.023）在癌旁组织和癌组织中的表达有差别。PD-L1的阳性表达与T分期（P<0.001）、术后分期（P=0.006）相关,PD-L2的阳性表达与T分期（P<0.001）、术后分期（P=0.002）及淋巴结转移（P=0.044）相关,与其他临床因素的相关性无统计学意义。PD-1（P=0.500）、PD-L1（P=0.058）、PD-L2（P=0.096）单阳性与患者生存状况均无明显关联。但三者表达均阴性的患者预后要显著优于仅其中一个因子表达阳性（HR=1.669）或二个以上因子表达阳性的患者（HR=1.606）。结论 PD-L1和PD-L2与ESCC患者的多个临床特征有关。虽然PD-1、PD-L1、PD-L2各自与患者预后之间无统计学意义关联,但表达均阴性的患者预后相对较好。     

共刺激分子PD-L1、PD-L2和B7-H4在人子宫颈癌的表达及意义

目的:研究共刺激分子程序性死亡配体1 (Programmed death ligand 1,PD-L1)、程序性死亡配体2(Programmed death ligand 2,PD-L2)和B7-H4在人子宫颈癌的表达及其与临床病理特征的关系.方法:采用免疫组织化学PV -6000法检测PD-L1、PD-L2和B7-H...     

PD-1/PD-L1信号通路在多系统疾病中的研究进展

PD-1属于免疫球蛋白超家族成员,其以单体形式存在于细胞表面,通常与配体结合后,ITSM区的酪氨酸发生磷酸化,蛋白酪氨酸磷酸酶分子则被招募使下游的效应分子去磷酸化,转导负性信号,从而发挥负性调节作用,抑制T细胞的增殖和细胞因子的产生.在正常情况下,PD-1/PD-L1信号通路可以诱导和维持外周组织的免疫耐受,对防止组织的过度炎症反应以及自身免疫性疾病的发生具有积极作用,而在不正常的情况下,如血液系统疾病、免疫系统疾病和心血管系统疾病时,此信号通路也发挥着重要的调节作用.