淡豆豉炮制中产γ-氨基丁酸微生物在不同pH值和不同温度下产酶能力比较研究

目的阐明淡豆豉炮制中微生物调控γ-氨基丁酸(γ-amino butyric acid,GABA)的形成机制。方法采用Berthelot比色法、福林酚法测定枯草芽孢杆菌、鸟肠球菌、屎肠球菌、解淀粉芽孢杆菌、黑曲霉、黄曲霉、溜曲霉、桔青霉、极细支孢霉、白腐菌、米根霉、鲑色锁掷酵母菌12种微生物在不同pH值和不同温度条件下产谷氨酸脱羧酶(glutamicacid decarboxylase,GAD)、蛋白酶(中性蛋白酶、碱性蛋白酶、酸性蛋白酶)能力。结果 12种微生物在pH 5～7、28～37℃时产GAD和蛋白酶酶活较高。其中黄曲霉产GAD酶活最高,为41.97 U/h,最适pH 7、温度28℃;其次是鲑色锁掷酵母菌、黑曲霉、米根霉、枯草芽孢杆菌,酶活分别为29.04、25.78、22.42、19.43 U/h。枯草芽孢杆菌产中性蛋白酶活最高,为24.80 U/mL,最适pH 7、温度37℃;其次是解淀粉芽孢杆菌、米根霉、鸟肠球菌,酶活分别为16.86、12.51、9.18 U/mL。解淀粉芽孢杆菌产碱性蛋白酶活最高,为13.29U/m L,最适pH7、温度34℃;其次是枯草芽孢杆菌、米根霉,酶活分别为8.86、6.20 U/mL。12种微生物产酸性蛋白酶能力普遍较差。结论所选的12种微生物产酶最适pH值、温度与淡豆豉自然炮制基本一致,其中真菌有较强的产GAD能力,细菌有较强的产中性蛋白酶能力,淡豆豉高富集GABA是多菌种共同作用所致。     

淡豆豉炮制过程中产γ-氨基丁酸微生物的筛选和鉴定

课题组前期发现淡豆豉中存在较高含量的γ-氨基丁酸(GABA),该研究对淡豆豉炮制过程中不同时间点的样本进行产GABA微生物的筛选和鉴定,为研究淡豆豉炮制机制奠定基础。按2010年版《中国药典》制备淡豆豉,获取淡豆豉炮制过程中不同时间点的样本;用选择性培养基分别对不同时间点样本中的细菌、真菌进行培养、分离纯化,挑选优势菌种;将各优势菌分别接种在指定的液体培养基中进行培养,制备各优势菌发酵液;采用薄层色谱法对各菌株发酵液GABA进行定性初筛,对初筛中有GABA斑点的发酵液采用该实验室已建立的柱前在线衍生-高效液相色谱法进行定量检测,从优势菌中筛选产GABA的微生物;应用16S rDNA,18S rDNA序列分别对产GABA的细菌和真菌进行PCR扩增、对扩增产物进行测序,测序结果通过NCBI同源性比对、MEGA 7.0软件构建系统发育树进行分子生物学鉴定。该实验筛选并鉴定出9种产GABA微生物,分别是枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis,屎肠球菌Enterococcus faecium,鸟肠球菌Enterococcus avium,溜曲霉Aspergillus tamarii,黄曲霉Aspergillus flavus,黑曲霉Aspergillus niger,极细支孢霉Cladosporium tenuissimum,桔青霉Penicillium citrinum,白腐菌Phanerochaete sordida。该研究首次从淡豆豉中筛选出9种产GABA微生物,多种产GABA的优势微生物在淡豆豉GABA的形成中可能起重要作用。     

酶法水解海蛇蛋白的工艺研究

目的以海蛇全体干品为原料,海蛇水解蛋白得率为指标,优选酶法水解海蛇蛋白的工艺。方法对比研究了温度、酶量、时间、固液比对木瓜蛋白酶、枯草杆菌中性蛋白酶、胰蛋白酶、碱性蛋白酶酶解海蛇蛋白的影响,以正交试验优化酶解条件。结果枯草杆菌中性蛋白酶水解海蛇蛋白的得率约为42%,其最佳条件为温度50℃,pH值7.0,固液比1∶9(g/ml),酶量3000 U/3g(原料),时间7 h。木瓜蛋白酶、胰蛋白酶、碱性蛋白酶酶解得率分别为36.2%、38.8%、38.8%。结论枯草杆菌中性蛋白酶水解海蛇蛋白的得率最高。     

狗脊微波炮制过程中指标成分与粉末颜色关联性分析

目的研究狗脊Cibotium baronetz(L.)J.sm.微波炮制过程中指标成分含有量与粉末颜色的相关性。方法采用Adobe Photoshop软件获取各炮制品色度值(L、a、b),采用HPLC法测定狗脊微波炮制过程中原儿茶酸、5-羟甲基糠醛的含有量变化,并考察指标成分含有量与色度值的相关性。结果随着炮制时间的延长,温度逐渐升高,原儿茶酸、5-羟甲基糠醛含有量逐渐升高,当温度高于215℃时,其含有量逐渐降低。原儿茶酸、5-羟甲基糠醛含有量与色度值L值呈负相关,与色度值a值呈正相关。结论狗脊微波炮制品粉末颜色与指标成分含有量之间具有一定相关性,可作为微波炮制过程中监测炮制品质量评价的依据。     

基于文献的淡豆豉发酵过程成分转化分析

该文通过系统检索并梳理大豆与淡豆豉已报道的成分基础上,对两者在发酵过程所发生的成分转化进行深入分析,对其成分转化的类型与可能机制进行了探讨,为淡豆豉的炮制工艺、药效成分及质量标准研究提供依据.经过分析可知,大豆发酵成淡豆豉的过程中,其营养物质(蛋白质、糖类、脂质等)、生物活性物质(异黄酮、皂苷、γ-氨基丁酸等)及其他物...     

再闷过程影响淡豆豉炮制工艺研究

目的 优化淡豆豉的发酵炮制工艺,明确再闷过程是淡豆豉发酵炮制中不可缺少的重要环节。方法 按《中国药典》2010年版制法结合古法炮制,以总异黄酮及大豆苷元和染料木素质量分数为考察指标,结合成品性状（色泽、气味、皱缩程度以及断面和硬度）为感官指标,优化炮制过程中再闷前（包括蒸煮时间、发酵温度、发酵时间）和再闷过程（包括再闷温度、再闷时间）的炮制工艺参数。结果 优化的炮制工艺为黑大豆在吸尽药液后蒸煮1.5 h,（30±2）℃条件下发酵6～8 d至黄衣上遍;洗去黄衣后,置于容器内,用水密封,进入再闷过程：置于温度为（30±2）℃的培养箱内再闷12～15 d。再闷期间每3天倒出,翻动,稍晾干,反复4～5次,最后略蒸,干燥。经过再闷的淡豆豉其品质较未经再闷过程的淡豆豉具有明显优势,其成品具有芳香气味,色泽光亮,质地柔软,断面为棕黑色,表皮皱缩;总异黄酮及大豆苷元和染料木素质量分数也达到最高值。结论 再闷过程是淡豆豉发酵炮制中不可缺少的重要环节,是影响淡豆豉主要化学成分量和成品性状改变的关键因素,优化后的淡豆豉炮制工艺将为指导淡豆豉规范化生产、研究淡豆豉的发酵炮制机制奠定基础。     

淡豆豉炮制工艺的优化研究

目的:优化淡豆豉的炮制工艺,明确工艺参数,为淡豆豉的规范化生产和质量控制提供依据。方法:采用单因素试验,以淡豆豉中大豆苷元、染料木素和异黄酮的含量为指标,考察桑叶和青蒿用量比例、药汁拌入大豆时的相对密度、蒸煮时间、发酵温度、发酵时间、再闷时间和略蒸时间;采用正交试验,以总黄酮含量为指标,考察桑叶和青蒿煎煮时间、煎煮次数、加水量,从而规范淡豆豉的炮制工艺。结果:最佳炮制工艺为取桑叶90g、青蒿100g,加入约生药量18倍水煎煮3次,每次1h,药液相对密度为1.10～1.12g/cm3,拌入1kg大豆中,蒸煮1.5h,发酵温度为(30±2)℃,发酵6～8d。结论:优化的炮制工艺适合淡豆豉的炮制加工。     

淡豆豉炮制中黄曲霉毒素产毒株的筛选鉴定和产毒能力测定

目的 对淡豆豉炮制过程中产黄曲霉毒素(aflatoxins,AFTs)的微生物(简称产毒菌)进行筛选鉴定、定量分析和产毒能力测定.方法 运用紫外荧光法初筛淡豆豉炮制中各样本的产毒菌并菌落计数;对初筛菌株的18S rDNA序列进行PCR扩增、测序,测序结果经NCBI同源性比对、MEGA7.0软件构建系统发育树进行分子生物...     

基于多指标响应曲面法优选醋炙香附炮制工艺及炮制终点量化研究

目的将饮片质量评价的主观经验与其化学成分含量的客观指标相结合,多指标、综合评价醋炙香附的最佳炮制工艺,并对炮制终点的判断进行量化。方法基于Box-Behnken设计醋炙香附炮制工艺,通过德尔菲评价对醋香附不同炮制品的外观性状进行打分,以德尔菲评价的总得分为主观评价指标,以粗纤维、α-香附酮、圆柚酮、总黄酮、5-羟甲基糠醛(5-HMF)、总挥发油的含量为客观评价指标,采用CRITIC权重赋值法将主客观指标相结合,响应面法优选醋炙香附最佳炮制工艺。通过测定饮片的物性参数与色度,建立物性参数、色度与化学成分含量之间的相关性,找到与其内在化学成分含量相关性最多的指标,并用其量化炮制终点。结果醋炙香附的最佳炮制工艺:加米醋25%,使用带刻度的喷壶均匀喷洒在药材表面,每次喷洒5 mL,喷洒12次,闷润8 h至药材内无白心,140℃炮制7 min。pH值、氧化值均与色度L~*、b~*、ΔE~*(L~*为亮度,b~*为黄蓝色度值,ΔE~*为总色值)值具有显著负相关,吸水率与L~*、b~*、ΔE~*值具有显著正相关;粗纤维含量与pH值、氧化值呈显著负相关,与相对密度呈显著正相关;α-香附酮含量与pH值、...     

白术清炒过程中颜色变化与5-羟甲基糠醛的相关性分析及拐点研究

目的：研究白术清炒过程中颜色变化与5-羟甲基糠醛(5-HMF)的相关性,并通过其炮制过程中各指标的动态变化分析炮制拐点。方法：清炒法炮制白术,运用薄层扫描仪、MATLAB软件评估白术生品及炮制品的颜色值,测定氧化值,HPLC法测定5-HMF含量,SPSS21.0软件分析颜色与5-HMF含量的相关性并建立回归模型。结果：相关性分析显示,色调H与亮度Ⅰ呈极显著正相关,与氧化值、5-HMF含量均呈极显著负相关;饱和度S与亮度Ⅰ呈显著负相关,与氧化值呈极显著正相关;亮度Ⅰ与氧化值、5-HMF含量均呈极显著负相关;氧化值与5-HMF含量呈极显著正相关。5-HMF含量与颜色值的回归模型为Y₍(5-HMF))=24.928-43.398X₍(H)),R²=0.908,拟合度高,模型有效。结论：白术清炒过程中其颜色与5-HMF含量显著相关,依据其颜色变化预测炮制过程中5-HMF的含量具有可行性,并且依据各指标动态变化可分析炮制拐点,为白术清炒过程中炮制程度的判断提供参考依据。     

多指标综合评价玉竹蜜蒸炮制工艺研究

目的 优选玉竹蜜蒸炮制工艺.方法 兼顾多糖、皂苷、黄酮、醇提物、水提物和水分各指标的量及抗氧化活性,研究蜜润时间、料液比(炼蜜-玉竹)、蜜蒸时间、蜜蒸温度对各指标的影响,采用多指标综合评分法,利用正交试验优化玉竹的蜜蒸炮制条件.结果 在蜜润时间为2h,料液比(炼蜜-玉竹)为1∶4,蜜蒸时间1h,蜜蒸温度70℃条件下,综合得分为84.07,与未炮制玉竹相比,多糖、皂苷、醇提物、水提物的量分别提高了32.02％、206.95％、55.60％、48.78％,水分和黄酮的量稍有下降.结论 该方法有效提高了玉竹各指标的提取率,提高了玉竹的利用价值.     

酪蛋白抗凝血肽的制备及其体外抗凝血、溶栓作用研究

目的研究抗凝血肽的制备、分离方法及其体外抗凝血、溶栓效果。方法用木瓜蛋白酶、菠萝蛋白酶、中性蛋白酶和碱性蛋白酶对酪蛋白进行4酶混合水解制备抗凝血肽,以固定化凝血酶对抗凝血肽进行萃取,用新西兰兔进行体外抗凝血、溶栓实验。结果实验确定的抗凝血肽制备条件为酪蛋白质量浓度15%,水解每克酪蛋白的木瓜蛋白酶、菠萝蛋白酶、中性蛋白酶和碱性蛋白酶用量分别为1 500、2 400、1 000、1 250 U,水解温度50℃,pH 7.0,水解时间4 h。固定化凝血酶萃取抗凝血肽的初始浓度6 ATU/mL,萃取温度30℃,pH 5.0,萃取时间30 min。反萃取温度30℃,pH 7.6,反萃取时间40 min。抗凝血肽经高效体积排阻色谱分析,主要成分分子大小与马尿酰-组氨酰-亮氨酸相当。体外抗凝血时间超72 h,溶栓时间24 h。结论酪蛋白抗凝血肽主要成分为3肽,体外抗凝血及溶栓实验效果良好。     

乌灵菌粉的镇静作用及其机理研究

 目的:研究真菌中药乌灵菌粉对小鼠的镇静安眼作用及其机制?方法:以常规的药理试验方法检测本药在戊巴比妥钠协同下对小鼠睡眠的影响;以同位素掺入法研究作用机理?结果:乌灵菌粉在戊巴比妥钠协同下有明显的促睡眠作用,并使自主活动减少?同时服药小鼠脑内谷氨酸(Glu)和γ-氨基丁酸(GABA)的含量及GABA受体的结合活性均高于对照,药物还能提高谷氨酸脱羧酶(GAD)的活性?结论:乌灵菌粉可能是通过促使Glu,GABA进入脑内,提高GAD活性及激活GABA受体而实现其镇静作用?     

针刺不同腧穴对失眠大鼠下丘脑γ-氨基丁酸和γ-氨基丁酸A受体的影响

目的:通过比较针刺不同腧穴对失眠大鼠脑内γ-氨基丁酸(gamma-aminobutyric acid,GABA)和γ-氨基丁酸A受体(gamma-aminobutyric acid A receptor,GABAAR)阳性表达的影响,探讨针刺不同腧穴对失眠大鼠脑内神经递质的调整作用。方法:将70只大鼠随机分为模型对照组、空白对照组、"神门"组、"内关"组、"三阴交"组、"足三里"组、"申脉-照海"组,每组10只。大鼠腹腔注射氯苯丙氨酸制造失眠模型,各治疗组针刺相应腧穴。用免疫组织化学法检测大鼠下丘脑GABA、GABAAR的阳性细胞数。结果:同空白对照组比较,模型对照组GABA、GABAAR阳性细胞数及爬竿时间明显下降(P<0.05)。与模型对照组比较,各针刺组大鼠下丘脑内GABA和GABAAR阳性细胞数量增多,同时爬竿时间延长(P<0.05)。各针刺组之间比较,"申脉-照海"组和"神门"组的疗效明显高于"足三里"组、"三阴交"组和"内关"组(P<0.05)。结论:针刺"申脉-照海"神门"内关"足三里"和"三阴交"均可提高下丘脑GABA和GABAAR,针刺可能通过此作用起到安神镇静的作用,改善机体免疫能力,达到治疗失眠的目的。治疗失眠常用穴申脉、照海和神门的调整作用较好。     

电针对慢性情绪应激焦虑大鼠中枢单胺递质与γ-氨基丁酸失平衡的调节作用

目的:研究电针对慢性情绪应激(chronic emotional stress,CES)焦虑大鼠中枢单胺类神经递质与γ-氨基丁酸(γ-aminobutyric acid,GABA)失平衡的调节作用.方法:采用不可预知的情绪应激刺激方法,刺激大鼠21d,建立CES焦虑模型.电针"百会"、"三阴交"穴治疗21d,运用荧光分光光度法测定大鼠海马、大脑皮质单胺神经递质5-羟色胺(5-HT)、去甲肾上腺素(NE)和多巴胺(DA)的含量,用免疫组化法检测两脑区GABA的表达.结果:模型组较空白组大鼠海马和大脑皮质5-HT、NE和DA的含量明显升高、GABA平均光密度(AOD)值明显降低(P<0.05,或P<0.01);电针可降低模型大鼠两脑区单胺递质含量、上调其GABA表达(P<0.05或P<0.01).结论:电针抗焦虑作用可能与调节两类神经递质间的失平衡相关.     

淡豆豉炮制至“黄衣上遍”过程中微生物菌群动态变化的初步研究

目的:初步研究淡豆豉发酵炮制至"黄衣上遍"过程中微生物菌群种类和数量的动态变化,为探讨淡豆豉炮制机制奠定基础。方法:参照2010年版《中国药典》按本实验室优化的炮制工艺制备淡豆豉(制备工艺见文章中)。取发酵炮制至"黄衣上遍"过程中不同时间点的样品,分别用细菌、霉菌和酵母菌选择性培养基培养并分离纯化,进行菌落计数;同时对分离纯化的微生物用肉眼和镜检观察进行菌种的初步鉴定。结果:淡豆豉炮制至"黄衣上遍"过程中,随着炮制时间的延长,细菌、酵母菌、霉菌数量呈现上升趋势,各菌群在发酵前4 d均有明显上升,细菌菌落数量由1×103.2CFU/mL增长到1×1010.6CFU/mL,霉菌菌落数量由1×102.1CFU/mL增长到1×109.8CFU/mL,酵母菌菌落数量由0增长到1×108.8CFU/mL;发酵4 d以后,各菌群的数量变化平缓;发酵过程中细菌数量明显高于霉菌和酵母菌,优势细菌主要为革兰阳性杆菌、霉菌主要为曲霉和毛霉、酵母菌主要为子囊菌酵母。结论:淡豆豉炮制是多菌种混合发酵的过程,其种类、数量随着发酵时间不同发生了明显变化。     

不同发酵条件对淡豆豉中总异黄酮含量及蛋白酶活力的影响

目的:建立淡豆豉中总异黄酮的含量测定方法,研究不同发酵条件对淡豆豉中总异黄酮及蛋白酶活力的影响。方法:采用UV法,以染料木素为标准品,在最大吸收峰261 nm处测定黑豆、自然发酵的淡豆豉、米曲霉发酵的淡豆豉、黑曲霉发酵的淡豆豉中总异黄酮含量;以福林法测定蛋白酶活力。结果:黑豆中的总异黄酮的含量为7.77mg·g~(-1),自然发酵淡豆豉总异黄酮为8.08 mg·g~(-1),米曲霉发酵淡豆豉总异黄酮为8.87 mg·g~(-1),黑曲霉发酵淡豆豉总异黄酮含量为10.99 mg·g~(-1)。平均加样回收率100.09%,100.34%,99.76%,99.87%,相对标准偏差为为1.10%,1.28%,1.22%,1.24%。酶活力测定结果为:黑豆190.7 U·g~(-1)、自然发酵淡豆豉309.4 U·g~(-1),米曲霉发酵淡豆豉474.9 U·g~(-1),黑曲霉发酵淡豆豉500.0 U·g-1。结论:UV法作为检验淡豆豉中异黄酮含量的一种手段,方法简便、准确、重现性好。单一菌种发酵淡豆豉异黄酮含量和酶活力均高于黑豆和自然发酵淡豆豉。     

创伤后应激障碍样大鼠不同脑区GAT1、KCC2、GAD67、GABA的蛋白表达情况

目的研究创伤后应激障碍(PTSD)样大鼠海马、前额叶皮质、杏仁核各脑区的GAT1、KCC2、GAD67、GABA的蛋白表达情况。方法使用SPS方法建立创伤后应激障碍样大鼠模型,分为模型组和正常组。应用Western blotting检测各组海马、前额叶皮质、杏仁核各脑区的GAT1、KCC2、GAD67、GABAAα2的表达,进行图像分析和统计学处理。结果模型组大鼠AMY组织GABA受体GABAAα2显著减少(P<0.05)。在AMY区中,模型组GAD67的蛋白表达显著下降(P<0.0 1)。结论 SPS造模法影响GABA的合成环节及其受体,打破了大脑兴奋-抑制功能平衡状态,这为未来治疗创伤后应激障碍的选择提供可能的治疗靶点。进而为以后中医从"痰气胶结"的探讨创伤后应激障碍提供可靠的生理病理学依据。     

淡豆豉与黑大豆降糖作用比较

目的:探讨淡豆豉和黑大豆对糖尿病小鼠的降糖作用.方法:淡豆豉和黑大豆用醇回流法提取.四氧嘧啶腹腔注射建立糖尿病小鼠模型,正常组和模型组灌胃自来水,大豆异黄酮组(55mg/kg.d)、黑大豆组(18.5g生药/kg.d)、淡豆豉组(18.5g生药/kg.d)连续灌胃21天,取血清测定生化指标.结果:与正常组相比,模型组血糖、果糖胺、游离脂肪酸、MDA明显升高,pH、SOD明显降低.与模型组相比,淡豆豉组MDA、血糖和果糖胺明显降低,SOD明显升高;黑大豆组MDA显著降低,SOD明显升高;各组pH值明显升高.结论:淡豆豉对糖尿病小鼠有降糖和抗氧化作用,黑大豆降糖作用不明显.     

灵芝补气安神功效对动物焦虑行为影响的实验研究北大核心CSCD

目的:观察灵芝水煎液及其粗多糖对动物焦虑行为的抗焦虑作用及机制。方法:建立装置焦虑模型小鼠和心气虚焦虑装置大鼠模型,除正常对照组、焦虑模型对照组,大小鼠分别灌胃地西泮2.5 mg/kg、灵芝水煎液2、4、6 g/kg、灵芝粗多糖0.04、0.08、0.12 g/kg,末次给药后1 h,观察大、小鼠于高架十字迷宫(EPM)实验中开臂进入次数百分比(OE%)、开臂滞留时间百分比(OT%)及明暗箱(LDT)实验中穿梭次数;行为学实验结束后取大鼠血及大、小鼠脑组织,ELISA法测定小鼠脑组织中小鼠γ-氨基丁酸(GABA)、谷氨酸(GLU)、5-羟色胺(5-HT)的含量;试剂盒测定大鼠脑组织中GABA、GLU含量,γ-氨基丁酸转氨酶(GABA-T)、谷氨酸脱羧酶(GAD)、谷氨酰胺合成酶(GS)活力,血清超氧化物歧化酶(SOD)活力、丙二醛(MDA),血浆环磷酸腺苷(cAMP)、环磷酸鸟苷(cGMP)、心钠素(ANP)含量;免疫组化法观察海马γ-氨基丁酸受体α1(GABAARα1)阳性表达。结果:随心气虚造模时间延长,各组大鼠体质量明显降低,19 d起,各给药组大鼠体质量降幅逐渐减小,22 d起各给药组大鼠体质量均大于心气虚焦虑模型组;灵芝水煎液及粗多糖均可显著升高大、小鼠的OE%、OT%、穿梭次数和脑组织中GABA含量,降低GLU含量及GLU/GABA的比值;降低小鼠脑中5-HT含量;降低大鼠脑中GABA-T活性;升高大鼠脑中GAD、GS活力,血清SOD活力、血浆cAMP含量,降低血清MDA、血浆cGMP、ANP含量,增强海马GABAARα1受体阳性表达;等质量灵芝饮片的水提取物、多糖提取物,表现出相似的抗焦虑效果。结论:灵芝水煎液及其粗多糖对动物焦虑行为有明显抗焦虑作用,抗焦虑主要活性部位可能为灵芝多糖。作用机制与通过调节GLU/GABA-Gln代谢环路中相关酶的活力,升高GABA含量和上调下游GABA/GABAARα1信号通路的表达,纠正兴奋-抑制性神经递质的失衡有关。