人体组织切片的Giemsa染色法诊断输入性疟疾

疟疾可根据流行病学史、临床表现以及实验室检查结果等进行诊断,疟原虫是疟疾的病原体.显微镜观察血涂片来检查疟原虫或疟原虫抗原阳性是实验室确诊疟疾的关键.利用人体组织切片查见疟原虫,取代血涂片镜检确诊疟疾在国内尚未见报道.笔者在法医病理鉴定中遇到1例,对组织切片进行了Giemsa染色,并尝试摸索最适宜的染色条件,清楚地显示了疟原虫在脑、肝脏组织深部血管内的形态及发育状况,现报道如下.     

疟原虫的形态学及快速免疫诊断研究与临床应用

疟疾的实验室诊断对于临床治疗至关重要,诊断失误会造成患者误诊、漏诊甚至死亡。血涂片的染色镜检是疟疾实验室诊断的金标准。本研究旨在对感染人体的4种疟原虫:恶性疟原虫P.falciparum、间日疟原虫P.vivax、以及卵形疟原虫P.ovale和三日疟原虫P.malaiae在红细胞中的各期形态进行系统梳理,以提高形态诊断过程中的准确率。本文对2018年疑似疟疾样本的快速检测试剂条(RDT)和镜检形态学检测结果进行比较。结果发现,虽然RDT检测快速、易于操作,但镜检仍然是疟疾确诊的金标准。同时定期形态学培训及质控考核应该成为疟疾检测实验室的常规工作。     

鼠约氏疟原虫yoelii株Pydyn基因的内含子序列分析

本研究测定并分析鼠约氏疟原虫 (Plasmodiumyoeliiyoelii)动力素蛋白基因 (Pydyn) 3′端内含子序列 ,比较约氏疟原虫yoelii虫株的Pydyn基因与约氏疟原虫 17XNL虫株基因组序列内含子间序列的多态性。方法 :应用PCR技术扩增约氏疟原虫动力素蛋白基因 (Pydyn)基因组 3′端序列 ,将其克隆入pGEM TEasy载体。阳性克隆经酶切和PCR鉴定正确后测序 ,并用分子生物学WINSTAR软件进行基因结构和同源性分析。结果 :用PCR方法成功扩增出约 80 0bp的Pydyn基因特定片段 ,阳性克隆经酶切及PCR扩增确定。基因序列分析表明 ,约氏疟原虫yoelii虫株的Pydyn基因含有 3个内含子 ,并且与约氏疟原虫 17XNL虫株基因组序列在内含子间存在着几个变异。结论 :确定了鼠约氏疟原虫动力素蛋白基因 (Pydyn) 3′端内含子序列 ,其内含子具有序列短且AT含量较高的特点 ,两末端的碱基具有一般真核基因内含子共有的剪接位点。多态性分析表明 ,将约氏疟原虫yoelii虫株的Pydyn基因的 3个内含子与人恶性疟原虫动力素基因Pfdyn内含子保守序列相比 ,Pydyn基因内含子上游下游序列具有一定的同源性。另外 ,约氏疟原虫yoelii虫株与约氏疟原虫 17XNL虫株的内含子间存在着多态性 ,存在着几个变异 ,这些变异属于点突变     

四川省2007-2014年急性弛缓性麻痹病例中埃可病毒6型的基因特征分析

目的 描述四川省急性弛缓性麻痹(acute flaccid paralysis,AFP)病例中埃可病毒6型(echovirus 6,E6)的基因特征.方法 对四川省2007-2014年AFP病例中分离到的11株E6进行全VP1区逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)扩增和核酸序列测定,进行序列比对和构建进化树.结果 从2889份AFP病例的粪便标本中分离出11株E6病毒.经测序鉴定为C2基因亚型10株,C4基因亚型1株.来源病例的临床诊断分别为:肠道病毒感染6例,周围神经炎l例,格林巴利综合征2例,肌炎2例.C4亚型与10株C2亚型VP1区核酸序列同源性为83.9％-85.2％,氨基酸同源性为96.5％-97.2％;10株C2亚型VP1区核酸序列同源性为94.0％-100.0％,氨基酸同源性为98.9％-100％.结论 2007-2014年四川地区AFP病例中分离到的E6为C2和C4基因亚型,其中以C2基因亚型为主.     

广州市吸毒强戒人员HIV-1基因亚型分布的初步研究

目的分析吸毒人群HIV感染者中HIV-1的基因序列特征,初步确定其感染的基因亚型和各亚型的流行趋势。方法在Genbank中查找HIVgag基因的序列,设计巢式PCR引物。从全血中提取样本的基因组DNA,进行巢式PCR,对PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳和测序,所获序列与国际参考株序列进行比对,确定基因型或亚型。结果对36例HIV-1感染者样本进行扩增,PCR共检测出29例阳性样本,27例测序成功,其中16例为CRF08-BC重组亚型、7例为CRF07-BC重组亚型、4例为CRF01-AE重组亚型,15例阴性对照均无目的条带。结论在广州吸毒强戒人员HIV-1型中以CRFBC亚型为主,其次为CRF01-AE亚型。应加强对HIV-1毒株亚型的监测,以制定更好的防治策略。     

福建省HIV-l流行毒株的基因序列测定和亚型分析

目的　通过DNA序列分析 ,确定福建省HIV 1流行毒株的亚型。方法　从福建省HIV 1抗体阳性者中选择 9例经性接触感染HIV 1者 ,采集其全血分离周围血淋巴细胞 (PBMCs)提取DNA作为PCR扩增的模板 ,设计合成 3对套式引物扩增HIV 1前病毒DNA的C2～V3区用于测序。所测序列与HIV 1中的 6个亚型的 10个国际标准或参考序列进行比较 ,确定被检标本的型别。结果使用PCR技术对 9份福建HIV 1阳性感染者PBMC样品进行扩增 ,获得HIV 1膜蛋白 (env)基因的核酸片段 ,并对其约 2 47bp核苷酸序列进行了分析、比较 ,证实 9份样品中 7份为E亚型 ,其余 2份分别为B和C亚型毒株。E亚型各株间序列存在一定差异 ,组内基因离散率为 6 2 8± 2 40。结论　福建省目前HIV 1的流行株主要为E亚型 ,流行株的来源较为复杂 ,株间序列差异不仅与感染时间有关 ,也和感染地点不同等因素有关 ,这些特点不同于我国其他一些省份发现的经血传播的HIV 1B或C亚型 ,其流行时间不长 ,株间序列差异不大     

淮安市经异性性传播的HIV感染者中HIV-1病毒基因亚型特征分析

目的 了解淮安市经异性性传播HIV感染者中HIV-1病毒基因亚型分布及其流行特征.方法 从60名异性性传播HIV-1感染者血液中提取DNA或RNA,用巢式PCR或RT-PCR方法扩增gag、env基因区片段,测定序列并分析.结果 60份标本中,确定了48份标本的基因亚型,发现有4种HIV-1亚型和重组型.其中CRF01_AE亚型占62.5％,CRF07_BC亚型占22.9％,CRF08_BC亚型占6.3％,B亚型占6.3％.结论淮安市异性性传播感染HIV者中,流行着CRF01_AE、CRF07_BC、CRF08_BC、B亚型这4种亚型病毒株,CRF01_AE为主要流行亚型.     

mtLSU-巢式PCR检测实验大鼠卡氏肺孢子虫的实验研究

目的对mtLSU-巢式PCR方法检测大鼠卡氏肺孢子虫的应用价值以及基因序列进行评价。方法采用地塞米松免疫抑制法诱导大鼠感染肺孢子虫;实验组10只,对照组1只;诱导至第7周时收集实验组及对照组大鼠肺组织和支气管肺泡灌洗液（BALF）标本,采用mtLSU-巢式PCR方法对人源与鼠源肺孢子虫共有的基因进行扩增和序列测定,同时采用镜检法对实验组大鼠肺组织和肺泡灌洗液标本进行检测,评估两种方法的敏感性。结果采用mtLSU-巢式PCR方法对实验感染大鼠肺组织和BAL进行检测,卡氏肺孢子虫DNA阳性率分别为100%（10/10）、90%（9/10）。而GMS染色镜检法检测的阳性率分别为80%（8/10）、60%（6/10）。所测Wistar大鼠卡氏肺孢子虫mtLSU基因序列长度为155bp,与GenBank的大鼠源肺孢子虫（U20170）及人源肺孢子虫（DQ473446）同源性均为100%（154/154、155/155）。结论 mtLSU-巢式PCR方法应用于大鼠卡氏肺孢子虫检测敏感性高,特异性强;获得与人源耶氏肺孢子虫相同的Wistar大鼠卡氏肺孢子虫mtLSU的基因序列。     

应用巢式RT-PCR扩增HA和NA基因片段并测序鉴定甲型H1N1流感病毒

目的 建立一种利用巢式RT-PCR特异扩增HA和NA基因片段并测序鉴定甲型H1N1流感病毒的技术.方法 设计两套共7条特异引物,通过巢式RT-PCR分别扩增甲型H1N1流感病毒HA和NA基因片段并测序,所得序列与人感染甲型流感病毒主要HA和NA亚型序列进行进化树分析以对结果作进一步鉴定,蛋白序列比对后分析其特征.结果 4例甲型H1N1流感患者流感病毒HA和NA基因RT-PCR扩增均分别得到442 bp和543 bp片段产物.核苷酸序列进化分析表明,该4例患者HA和NA序列分别与2009年爆发的甲型H1N1流感病毒HA及NA序列聚集在一起,与季节性H1、H2、H3、人禽流感H5亚型及季节性N1、N2、人禽流感N1亚型特异分开.蛋白序列分析表明,4例患者流感病毒HA蛋白裂解位点附近氨基酸序列均为PSIQSR↓GLF,不具有高致病性流感病毒的特性,NA蛋白第275位氨基酸为His,未出现H275Y的耐药变异.结论 本方法能特异扩增甲型H1N1流感病毒HA和NA基因片段,测序后可用于甲型H1N1流感病毒的进一步鉴定;同时,得到的序列也可用于流感病毒致病力及耐药性的分析.     

山东省HCV分离株C区及NS5区核苷酸序列分析及其基因分型

目的 研究山东省丙型肝炎病毒（HCV）流行株的基因型别,方法 用反转录套式聚合酶链反应（PCR）方法分别扩增山东省HCV流行株C区（432bp)NS5区（319bp)的两个基因片段,将其克隆人T载体上并自动测序,进行同源性分析及基因型别鉴定。结果 4株HCVC区基因片段有3株为1b基因亚型,1株为2a基因亚型,10株NS5区的基因片段分析均为1b基因亚型,并且与GenBank中多个1b亚型代表株核苷酸序列同源性达90%以上,结论 山东省HCV流行株以1b亚型为主,兼有2a亚型,同一亚型中也有较大的变异,NS5区1b亚型中基因散率可达5%以上。     

不同基因型HCV膜区（E2）基因克隆及亲、疏水性分析

目的 研究丙型肝炎病毒（HCV）不同基因型膜区序列变异及其变异规律。方法 克隆不同基因型HCV的膜区基因,序列测定,核苷酸和氨基酸序列比较和分析。结果 不同基因型膜区基因相似性不同,从同一血清样本获得的不同克隆间,其同源性核苷酸大于99．2％,氨基酸大于99．9％。相同亚型核苷酸和氨基酸同源性大于80％。同型基因核苷酸和氨基酸同源性分别为（63．9－75．0）％和（64．9－72．8）％。异型基因同源性核苷酸为（59．4－67．0）％,氨基酸为（56．5－66．3）％。氨基酸序列变化在某些部位有一定保守性。不同基因HCV高变区（HVR）的亲水性和疏水性变化小于其下游3′端区域。结论 HCV基因变化可能有一定规律性。     

我国间日疟原虫地理株SSUrDNA特定序列的比较分析

用已设计的一对特异引物和建立的双温度点聚合酶链式反应（ＰＣＲ）技术，分别从我国安徽、福建、海南、四川及云南五省疟区采集的间日疟患者血样ＤＮＡ抽提物中，扩增出长约６４０个碱基对（ｂｐ）的ＤＮＡ片段，经限制性酶切鉴定，证实为间日疟原虫小亚单位核糖体核糖核酸基因（ＳＳＵｒＤＮＡ）目的片段。将其分别与载体Ｍ１３ｍｐ１８和Ｍ１３ｍｐ１９连接、克隆，以双脱氧末端终止法测序，并分析比较。结果表明，同一地区二份样本序列完全相同，国内间日疟原虫地理株间及其与已报道的国外虫株克隆间，该序列显示出高度的同源性，但亦存在由个别碱基置换，插入或缺失所表现出的差异。     

昆明小鼠对伯氏疟原虫的易感性和组织病理研究

目的探讨昆明小鼠对伯氏疟原虫（Plasmodium berghei）的易感性及其感染后的组织病理变化。方法 6周龄昆明小鼠腹腔接种1×106个感染伯氏疟原虫的红细胞,观察小鼠的生存时间及临床症状。感染后第2天开始每天采尾静脉血制作薄血膜片,Giemsa染色,计数血虫率。感染后第4天开始经肛门测小鼠体温。小鼠临死时取脑、肺、肝和脾组织,经10%中性福尔马林固定24h以上,脱水、包埋后制成4μm厚石蜡切片,苏木素-伊红染色,显微镜下观察各组织的病理变化。结果昆明小鼠腹腔接种感染伯氏疟原虫后的生存时间为8～21d;小鼠感染后第2天外周血可检出疟原虫,小鼠临死前血虫率达高峰;肉眼观察肝、脾体积增大,颜色变深,显微镜下见大量疟色素沉着,肝实质组织可见少量灶性炎性细胞聚集;脑和肺组织见感染疟原虫红细胞沉积在微血管壁,引起脑血管堵塞、大脑皮层出血灶和肺水肿、肺泡腔内炎性细胞渗出。结论昆明小鼠对伯氏疟原虫易感性较高,脑、肺、肝和脾组织均呈现出典型的疟疾病理特征,可作为研究疟原虫致病机制的动物模型。     

恶性疟原虫GLURP基因的体外扩增，克隆及序列分析

通过体外扩增 ,克隆恶性疟原虫海南 (FCC1 HN)株GLURP基因 ,测定其基因序列 ,了解该基因的结构及在FCC1 HN株与其它分离株间的序列差异。根据GLURP基因已知序列设计合成 3对引物 ,用PCR技术从FCC1 HN株基因组DNA中扩增 3个部分序列重叠的GLURP基因片段 ;并分别克隆入测序用PMD 18T载体。用双脱氧链末端终止法测定GLURP基因序列 ,应用软件辅助分析基因结构及进行同源性比较。恶性疟原虫FCC1 HN株GLURP基因全长 3711bp ,编码 12 36个氨基酸。FCC1 HN株与F32株GLURP基因核苷酸序列同源性为 96 2 7% ;编码氨基酸序列同源性为 95 78%。本文为继续进行FCC1 HN株GLURP抗原的免疫原性和保护性研究奠定基础。     

PCR方法对单细胞SRY基因扩增效率的对比研究

目的探讨单细胞基因扩增时,巢式PCR和引物预扩增(PEP)-巢式PCR两种扩增方法对SRY基因脱扣的影响程度;并应用PEP-巢式PCR方法对单个卵裂球细胞进行SRY基因诊断。方法获取单个正常男女淋巴细胞,随机分为巢式PCR组和PEP-巢式PCR组。同时扩增SRY基因和ZP3基因位点。选用IVF-ET后冻存的4个胚胎,处理后获取单个卵裂球11个,用PEP-巢式PCR扩增,鉴定其性别。结果单个淋巴细胞经巢式PCR和PEP-巢式PCR方法扩增后,其基因扩增成功率分别为92.39%,98.91%;性别诊断正确率分别为86.00%,98.00%;SRY基因的脱扣率分别为16.67%,2.38%。两者有统计学检验均有显著性差异(P<0.05。对单个卵裂球应用PEP-巢式PCR方法进行SRY基因和ZP3基因扩增后,有3个胚胎的8个卵裂球被诊断为男性,而另外1个胚胎的3个卵裂球被诊断为女性。结论1.行单细胞基因扩增时,PCR扩增方法会影响等位基因脱扣的发生率。2.对性连锁遗传病进行植入前遗传学诊断时,采用PEP-巢式PCR方法扩增SRY基因和ZP3基因对单个细胞对进行性别鉴定时,可以有效地降低SRY基因脱扣的发生率,提高性别诊断的特异性和敏感性,能够用于单细胞的性别诊断,可用于性连锁遗传病的植入前遗传学诊断。     

吉林省延边州1例输入性登革热病例的诊断与病毒溯源分析

采集吉林省延边州1例输入性登革热疑似病例全血样本,通过实时荧光RT-qPCR方法进行实验室确诊,再通过基因扩增和测序,鉴定其基因型,分析病毒溯源。结果显示,该病例全血样本登革病毒核酸检测阳性,确诊为登革热,经基因扩增和序列分析,其病毒基因序列与引起2017年越南登革热暴发疫情的登革病毒Ⅰ型基因序列同源性为99%。经系统进化分析,该基因序列与越南登革病毒株101-TN-056和111-HD-004基因序列处于同一个分枝。结果表明,该病例为输入性登革热病例,为登革病毒Ⅰ型感染,病毒来源于越南。     

陕西省2010-2012年柯萨奇病毒A组16型VP1基因特征分析

目的 对陕西省2010-2012年来源于手足口病（hand,foot and mouth disease,HFMD）病例的科萨奇病毒A组16型（Coxsackievirus A16,CVA16）毒株的VP1基因特征进行分析,以阐明其分子流行病学特征.方法 利用特异性引物对分离鉴定为CVA16的21株病毒进行VP1编码区扩增.对阳性产物进行序列测定,并用MEGA软件进行序列的生物信息学分析.结果 根据亲缘性分析,本研究的CVA16分别属于B1a和B1b基因亚型,其中仅2011年分离自宝鸡市的10株属于B1a基因亚型,分离自其他4个地市的11株则属于B1b基因亚型.B1a和B1b基因亚型内核苷酸序列同源性分别为99.9％ ～100％和92.93％ ～ 100％.不同基因亚型毒株间核苷酸序列差异为8.43％～9.45％.结论 2010-2012年,属于B1a和B1b基因亚型的CVA16在陕西省共同循环,其中B1b基因亚型流行范围较广,可能为陕西省的优势亚型.     

惠州市重症手足口病病原谱及EV71型VP1区基因特征分析

目的分析惠州市手足口病重症病例的病原谱构成,了解惠州市肠道病毒71型分离株的VPl区基因特征．为科学防治手足口病提供科学依据。方法采集300例重症手足口病（HFMD）患者标本,采用实时荧光RT-PCR检测肠道病毒核酸,并对肠道病毒7l型（EV71）和柯萨奇病毒A16型（CoxA16）进行分型检测;选择8株EV71分离株进行VPl区基因全长序列测定,测序结果利用DNASTAR软件进行核苷酸、氨基酸序列分析和同源性比较。并用Mega5．0软件构建亲缘性进化树。结果通过实时荧光RT-PCR特异性检测,EV71阳性结果154份,阳性率为51．33％;CoxAl6阳性结果38份,阳性率为12．67％。测序结果表明,8株EV71之间的VPl基因核苷酸同源性为96．9％～99．2％。氨基酸同源性为99．3％～100％。VPI区基因遗传进化分析表明。8株EV71分离株与c4基因亚型的代表株处于同一分支,均属于C4基因亚型的C4a进化分支。结论惠州市手足口病疫情主要病原EV71病毒均属于C4a基因亚型,与2004年以来的中国大陆EV71病毒流行的基因型一致,未产生明显的抗原漂移及变异。     

一例输入性非典型肺炎患者病原体的分离鉴定及其变异性研究

目的 对一例输入性非典型肺炎病例的病原体进行分离鉴定，研究其变异情况，为该病的诊断和防治提供依据。方法 用Vero E6细胞对病人的咽拭标本进行分离培养，并对分离物使用电镜、间接免疫荧光(IFA)、巢式PCR及S基因核苷酸序列测定等方法进行分析。结果 在该病人的咽拭标本中，成功地分离到一株冠状病毒(R69)，将部分S基因测序并与不同地区非典型肺炎病人分离株进行比较，表明分离到的毒株为一种新型冠状病毒。结论 目前存在冠状病毒的变异株，病毒核苷酸序列与广东省原发性SABS病人分离到的冠状病毒有所不同。     

北京市密云县野栖鼠感染田鼠巴贝西虫的检测

针对2012年6月于北京市密云县辖区捕获的15只野栖鼠,检测其巴贝西虫感染状况。通过制备薄血涂片及采集心、肺组织样本提取基因组,结合镜检及聚合酶链式反应确定感染阳性样本,对巴贝西虫核糖体小亚基编码基因虫种特异片段进行扩增并测序,通过序列对比及进化树构建对野栖鼠感染的巴贝西虫进行同源性分析及虫种鉴别。本次检测的野栖鼠中1份社鼠Niviventerconfucianus血液镜检阳性,对应的心、肺组织样本检测到巴贝西虫虫种特异DNA片段,同源进化分析表明,该虫株与我国浙江、福建、台湾地区的田鼠巴贝西虫分离株具有高度同源性,属于田鼠巴贝西虫Babesiamicroti。北京市密云县野栖鼠首次被证实存在感染田鼠巴贝西虫的情况。