胸腺肽α1对再生障碍性贫血患儿骨髓间充质干细胞tlr9/ido mRNA表达的调节作用

本研究旨在探讨胸腺肽α1（Tα1）对再生障碍性贫血（AA）患儿骨髓间充质干细胞（MSC）TOLL样受体9（TLR9）/吲哚胺二氧化酶（IDO）mRNA表达的调节作用。建立正常儿童和AA患儿骨髓MSC的体外培养体系,应用RT-PCR检测Tα1对正常儿童和AA患儿骨髓MSCtlr9/ido mRNA表达的影响。结果表明：正常儿童骨髓MSC不表达tlr9 mRNA和ido mRNA。AA患儿骨髓MSC明显表达tlr9 mRNA,不表达ido mRNA;Tα1与AA患儿骨髓MSC作用18小时后,明显下调tlr9表达和上调ido表达,且呈浓度和时间依赖关系。结论：Tα1能够上调AA患儿骨髓MSC ido mRNA的表达。     

儿童再生障碍性贫血骨髓间充质干细胞GATA-2基因表达的研究

目的 本研究旨在探索儿童再生障碍性贫血（AA）骨髓间充质干细胞（MSC）GATA-2基因的表达及意义.方法 采集38例AA患儿骨髓标本及20例正常儿童骨髓标本,分离骨髓单个核细胞后体外扩增培养骨髓基质细胞,实时定量PCR（QRT-PCR）方法检测AA儿童免疫抑制治疗前后GATA-2基因表达的变化.结果 AA儿童免疫抑制治疗前GATA-2基因表达水平明显低于正常对照组（P＜0.05）,免疫抑制治疗2年后对治疗有反应的AA儿童GATA-2表达水平高于发病时,且与正常对照组表达水平无统计学差异（P〉0.05）.结论 GATA-2基因的低表达可能影响AA患儿骨髓微环境的造血调控作用.     

再生障碍性贫血患者造血细胞凋亡与PML蛋白的关系

目的了解再生障碍性贫血患者血清对造血细胞凋亡的活性,及其对造血细胞PML蛋白表达和定位的影响。方法应用甲基纤维素半固体培养法,免疫荧光标记法及流式细胞技术分析12例再生障碍性贫血患者血清体外抑制正常人骨髓BFU-E、CFU-GM增殖及促进其集落细胞凋亡的作用,以共聚焦免疫荧光显微镜及流式细胞仪检测再生障碍性贫血患者血清与正常人骨髓造血细胞共同培养后,再生障碍性贫血患者血清对所形成集落细胞内的PML蛋白表达的影响。结果4例重型再生障碍性贫血(SAA)患者和8例非重型再生障碍性贫血(NSAA)患者血清在体外均可明显抑制正常人骨髓BFU-E、CFU-GM的增殖;SAA组、NSAA组和正常对照组血清作用后集落细胞内均表达一定量的PML蛋白,SAA组高于对照组。结论再生障碍性贫血患者血清具有诱导造血细胞凋亡的活性;再生障碍性贫血患者血清作用后PML蛋白在造血细胞内表达增加。     

骨髓间充质干细胞干预再生障碍性贫血患者树突状细胞的成熟分化

背景：骨髓间充质干细胞对再生障碍性贫血患者T细胞增殖的影响国内仅见少量报道,而骨髓间充质干细胞是否通过调节树突状细胞来影响再生障碍性贫血患者T细胞的增殖,国内未见报道,其机制值得深入研究.目的：观察骨髓间充质干细胞对再生障碍性贫血患者树突状细胞的免疫调节作用.方法：将培养第5天的再生障碍性贫血患者外周血单个核细胞来源的树突状细胞与第3代健康人骨髓间充质干细胞混合培养,加入脂多糖、肿瘤坏死因子促树突状细胞成熟,应用流式细胞仪检测骨髓间充质干细胞与未成熟、成熟树突状细胞共培养前后树突状细胞表面标志表达.结果与结论：未成熟的树突状细胞在脂多糖的刺激诱导下与骨髓间充质干细胞共培养前后,树突状细胞表面标志CD14,CD1a,CD83,CD80表达无变化（P〉0.05）;成熟树突状细胞与骨髓间充质干细胞共培养前后,树突状细胞表面标志CD14,CD1a,CD83,CD80表达降低（P〈0.05）.结果说明骨髓间充质干细胞可抑制再生障碍性贫血患者单核细胞来源的树突状细胞的发育和成熟,进而发挥调节再生障碍性贫血患者的免疫作用.     

黄体酮诱导骨髓间质干细胞分化为神经元样细胞实验研究

目的：体外定向诱导大鼠骨髓间质干细胞(MSC)分化为神经元样细胞。方法：通过贴壁法分离大鼠MSC，体外扩增培养，黄体酮定向诱导。MSC分化为类神经元样细胞。光镜下观察细胞形态，免疫细胞化学检测神经细胞特异性抗原标志。结果：大鼠骨髓间质干细胞可通过贴壁法成功分离并可在体外大量扩增。黄体酮诱导3h后大部分MSC转变为神经元样细胞，出现胞体和突起，免疫细胞化学染色NSE、Nestin呈阳性、GFAP阴性。结论：大鼠骨髓间质干细胞可在体外诱导分化为神经元样细胞。     

成人和胎儿骨髓间充质干细胞的比较研究

目的 比较成人和胎儿骨髓间充质干细胞（MSC）的表型和生物学性状差异，为临床选择使用MSC提供实验依据。方法 取正常人和胎儿骨髓单个核细胞，在SF培养基中进行MSC培养，测定生长曲线。电镜观察MSC形态，利用流式细胞仪进行SMC表型测定和细胞周期分析；SA方法测定Ⅰ，Ⅲ型胶原和vWF因子表达。通过碱性磷酸酶染色，苏丹黑染色及骨钙蛋白和脂蛋白酯酶mRNA的表达等来检测细胞向成骨，成脂肪细胞分化情况。结果 从成人和胎儿骨髓中可培养出MSC，并保持多向分化潜能。两者在细胞形态，生长特性，表面抗原表达等方面是相似的。胎儿骨髓MSC的扩增潜力及多向分化能力明显强于成人MSC。成人骨髓MSC的粘附功能则强于胎儿。结论 从成人及胎儿骨髓中可分离培养出MSC，在体外有效扩增且保持其低分化状态和多向分化能力。胎儿MSC较成人MSC更原始，具有更大的多向分化和体外扩增潜能，可作为组织工程的种子细胞；而成人MSC支持造血，促进造血功能恢复和重建造血的功能则强于胎儿，具有更广泛的临床移植应用前景。     

骨髓间充质干细胞对再生障碍性贫血患者T细胞的免疫抑制

背景：骨髓间充质干细胞对再生障碍性贫血患者T细胞增殖的影响国内报道较少,而骨髓间充质干细胞是否通过抑制T细胞增殖实现对再生障碍性贫血患者的免疫调节目前尚无定论。目的：观察人骨髓间充质干细胞对再生障碍性贫血患者T细胞的免疫调节作用。方法：体外分离培养、扩增人骨髓间充质干细胞并通过形态学特征以及流式细胞术进行表面标志鉴定,将骨髓间充质干细胞分别与正常人和再生障碍性贫血患者外周血提取的T淋巴细胞共培养7d。应用ELISA法检测各培养上清液中T淋巴细胞分泌的白细胞介素2、γ-干扰素、白细胞介素4及白细胞介素10水平。结果与结论：再生障碍性贫血组患者培养上清液中T淋巴细胞分泌的白细胞介素2、γ-干扰素水平明显高于正常人（P〈0．05）,白细胞介素4、白细胞介素10低于正常人（P〈0．05）。骨髓间充质干细胞可下调白细胞介素2、γ-干扰素表达,同时上调白细胞介素4、白细胞介素10表达,从而调节再生障碍性贫血患者的免疫紊乱。     

荧光定量聚合酶链反应检测GATA-1、GATA-2、过氧化物酶体增殖物激活受体γ和干细胞因子基因在再生障碍性贫血患者及正常人骨髓间充质干细胞中的表达

背景:GATA-1、GATA-2、过氧化物酶体增殖物激活受体γ和干细胞因子基因在骨髓造血及成脂调控机制中起重要作用。目的:观察GATA-1、GATA-2、过氧化物酶体增殖物激活受体γ和干细胞因子基因在再生障碍性贫血患者及正常人间充质干细胞中的表达。方法:收集6例再生障碍性贫血患者及6位正常人骨髓液各10mL,Ficoll贴壁法分离培养骨髓单个核细胞,达70%~80%融合后扩增传代。取传至第3代的间充质干细胞,应用流式细胞仪进行鉴定。提取总RNA,比较各组基因与内参基因之间的差别。荧光定量聚合酶链反应检测GATA-1、GATA-2、过氧化物酶体增殖物激活受体γ和干细胞因子基因在再生障碍性贫血患者及正常人间充质干细胞中的表达量。结果与结论:与正常人间充质干细胞相比,再生障碍性贫血患者间充质干细胞的GATA-2和干细胞因子基因表达量降低(P=0.012,0.039),过氧化物酶体增殖物激活受体γ基因表达量升高(P=0.035);两组GATA-1基因表达量差异无显著性意义。提示GATA-2、干细胞因子基因的异常表达可能影响AA患者骨髓微环境的造血调控作用;过氧化物酶体增殖物激活受体γ基因的异常表达可能解释再生障碍性贫血患者骨髓易成脂的原因。     

急性白血病儿童骨髓间充质干细胞的生物学特点的初步研究

本研究探讨密度梯度离心法加贴壁法方式培养白血病儿童骨髓间充质干细胞（mesenchymalstemcell,MSC）的条件并观察其体外增殖能力、生长曲线、多向分化等生物学特性。通过密度梯度离心、贴壁法分离白血病患儿的MSC,观察细胞的形态变化及生长曲线、流式细胞术测定其CD29、CD105、CD45、CD34、CD14、HLA—DR等表达,通过成脂、成骨诱导研究其多向分化能力。结果表明：密度梯度离心法联合贴壁法可以培养出白血病儿童骨髓来源的MSC,初诊白血病儿童骨髓来源的MSC培养成功率为57．1％,缓解白血病儿童骨髓来源的MSC成功率为41．2％,接种密度越大成功率越高,初诊白血病儿童的MSC形成集落数目较多且生长较快。形态学观察显示,骨髓间充质干细胞接种24小时即贴壁,呈集落生长,形态多样;3天后贴壁细胞增殖,逐渐以梭形细胞为主;2—3周细胞基本达80％-90％融合,第3代后细胞呈均匀一致的长梭形。细胞传代后3天内处于潜伏期,3天后进入生长期,8天后进入平台期。检测第2代后细胞免疫表型显示,MSC的CD29、CD105表达率达95％以上,CIM5、CD34、CD14、HLA．DR极低表达或不表达。MSC能成功诱导成脂肪细胞及成骨细胞,油红O染色和茜素红染色为阳性。在合适的条件下冻存对细胞影响不大。结论：①白血病患儿骨髓培养出的贴壁细胞是MSC,骨髓含量在1ml以上且方法得当可以培养出MSC;②初诊的白血病患儿的骨髓相对容易培养出骨髓间充质干细胞,形成的集落较缓解期白血病患儿多,增长速度较快;⑧白血病儿童来源的MSC具有MSC的共同生物学特性。     

荧光定量聚合酶链反应检测GATA-1、GATA-2、过氧化物酶体增殖物激活受体γ和干细胞因子基因在再生障碍性贫血患者及正常人骨髓间充质干细胞中的表达

背景：GATA-1、GATA-2、过氧化物酶体增殖物激活受体γ和干细胞因子基因在骨髓造血及成脂调控机制中起重要作用。目的：观察GATA-1、GATA-2、过氧化物酶体增殖物激活受体γ和干细胞因子基因在再生障碍性贫血患者及正常人间充质干细胞中的表达。方法：收集6例再生障碍性贫血患者及6位正常人骨髓液各10mL,Ficoll贴壁法分离培养骨髓单个核细胞,达70%~80%融合后扩增传代。取传至第3代的间充质干细胞,应用流式细胞仪进行鉴定。提取总RNA,比较各组基因与内参基因之间的差别。荧光定量聚合酶链反应检测GATA-1、GATA-2、过氧化物酶体增殖物激活受体γ和干细胞因子基因在再生障碍性贫血患者及正常人间充质干细胞中的表达量。结果与结论：与正常人间充质干细胞相比,再生障碍性贫血患者间充质干细胞的GATA-2和干细胞因子基因表达量降低（P=0.012,0.039）,过氧化物酶体增殖物激活受体γ基因表达量升高（P=0.035）;两组GATA-1基因表达量差异无显著性意义。提示GATA-2、干细胞因子基因的异常表达可能影响AA患者骨髓微环境的造血调控作用;过氧化物酶体增殖物激活受体γ基因的异常表达可能解释再生障碍性贫血患者骨髓易成脂的原因。     

低危骨髓增生异常综合征患者间充质干细胞的生物学特性的实验研究

骨髓增生异常综合征的发病机制至今尚未明确，有研究表明MDS患者骨髓基质微环境功能的异常与其发病有关。间充质干细胞是造血微环境的重要成分，本研究拟探讨低危MDS患者间充质干细胞（MSC）的生物学特性及功能．采集低危MDS患者的骨髓标本，分离、培养和扩增MSC，观察细胞形态，进行免疫表型、成骨分化能力鉴定，检测其增殖能力及对体外造血的支持功能；用实时定量RT—PCR法测定MSC中相关细胞因子及化学趋化因子的表达，并与健康供者的MSC进行比较。结果表明：培养低危MDS患者的MSC呈典型的成纤维细胞样，细胞表达SH2（CD105），SH3（CD73），Thy—1（CD90），CD34及CD45均为阴性，诱导后可向成骨细胞分化。其体外扩增能力与与健康供者相比无显著差异（P〉0．05），但体外支持造血功能较后者显著减低（P〈0．05）。实时定量PT—PCR显示SDF—1在低危MDS患者MSC中显著高表达（P〈0.01）。结论：间充质干细胞的功能异常与低危MDS患者骨髓微环境的造血调控失常相关，这为MDS发病机制的认识及治疗提供了新的思路，值得进一步探讨。     

人骨髓间充质干细胞对异体B淋巴细胞的免疫调节作用

目的 研究人骨髓问充质干细胞（MSC）体外对B淋巴细胞的免疫调节作用。方法 从人骨髓中分离培养MSC，通过观察细胞形态和流式细胞术检测细胞表面标志进行鉴定。用加速器辐射去除MSC增殖分化能力。检测加入骨髓MSC前后B淋巴细胞增殖能力变化，并对其进行凋亡分析；比较Transwell非接触培养与直接接触培养中，MSC对活化B淋巴细胞增殖的作用；观察骨髓MSC作用前后，活化B淋巴细胞分泌免疫球蛋白IgG、IgA和IgM的能力，以及B淋巴细胞表面免疫分子的表达。结果 ①MSC不能刺激B淋巴细胞增殖；MSC抑制LPS活化的B淋巴细胞增殖，其抑制作用与浓度呈依赖性。②MSC不能诱导B淋巴细胞凋亡；Transwell非直接接触培养组中MSC抑制B淋巴细胞增殖的作用较直接接触培养组的作用弱，提示MSC抑制B淋巴细胞增殖的作用包括物理性接触抑制和非接触抑制。③骨髓MSC抑制活化的B淋巴细胞分泌免疫球蛋白IgG、IgM和IgA；MSC作用下，B淋巴细胞表面HLA-DR、CIMO、CD80和CD86的表达无显著改变。结论 骨髓MSC在体外可抑制B淋巴细胞增殖和分泌功能，具有一定的免疫调节能力。     

多发性骨髓瘤骨髓间充质干细胞生物学特性分析

为了研究多发性骨髓瘤（multiple myeloma，MM）病人骨髓间充质干细胞（mesenchymal stem cells，MSC）的病理生物学特性，以探讨MSC在MM骨损伤发生中的作用，取11例初治MM病人和5例正常人骨髓，用贴壁法体外分离培养MSC。应用流式细胞术分析MM骨髓MSC表型，MTT法检测MSC增殖能力，组织化学染色测定细胞向成骨细胞和脂肪细胞分化能力。应用酶联免疫吸附实验（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）测定细胞培养上清液中白介素-6（interleukin-6，IL-6）和干细胞生长因子（stem cell factor，SCF）浓度。收集MSC培养上清作为条件培养液，按梯度浓度加入人SKO007骨髓瘤细胞系培养体系中，MTT法测定细胞增殖能力差异。结果表明：与正常人骨髓MSC比较，MM患者骨髓MSC的表型无改变，均一表达CD29、CD73、CD166和HLA-ABC，不表达CD45和CD31；MM患者骨髓MSC增殖和分化能力正常，且具有相似的成骨和成脂肪分化功能；MM骨髓MSC分泌IL-6和SCF的水平均明显高于正常；MM来源的MSC培养上清显著促进SKO007细胞的增殖。结论：MM患者骨髓MSC的增殖分化功能正常，MM时骨损伤可能与MSC分化功能无关，而IL-6和SCF高表达为骨髓瘤细胞提供了必要的生存信号。     

富血小板血浆优化培养间充质干细胞的实验研究

目的探讨以人富血小板血浆(PRP)取代动物血清培养可供临床应用的间充质干细胞(MSC)的新方法。方法骨髓标本取自行全髋关节置换术的造血功能正常患者的近端股骨。有核细胞2×10~5/cm~2接种于25 cm~2培养瓶中培养 MSC,比较含12.5% 胎牛血清(FCS)和12.5% 马血清的完全 Dexter 培养液,含10.0% FCS 的α-MEM 培养液和含5% PRP 的α-MEM 培养液三种培养体系的扩增效果。有核细胞1×10~6与采自健康供者髂骨的相同数量的骨髓细胞分别接种于25 cm~2培养瓶,14 d 后计数成纤维细胞集落(CFU-F)。结果从近端股骨中分离和扩增的细胞呈典型的成纤维样细胞形态,表型鉴定 CD34、CD45阴性,SH2(CD105)、SH3(CD73)、Thy-1(CD90)阳性,体外诱导可向成骨细胞分化。其中含5% PRP 的培养体系较其他两种传统培养方法具有显著增强的 MSC 扩增效果且不改变细胞表型及分化功能;来源于近端股骨的骨髓细胞 CFU-F 较常规髂骨穿刺物显著增高(分别为89±17和16±5,P<0.01)。结论建立以 PRP 取代 FCS 的培养体系,并采用取自外科手术中近端股骨的骨髓标本可在体外高效扩增可备临床细胞治疗应用的 MSC。     

Cell–cell interaction between vocal fold fibroblasts and bone marrow mesenchymal stromal cells in three‐dimensional hyaluronan hydrogel

Mesenchymal stromal cells (MSCs) are multipotential adult cells present in all tissues. Paracrine effects and differentiating ability make MSCs an ideal cell source for tissue regeneration. However, little is known about how interactions between implanted MSCs and native cells influence cellular growth, proliferation, and behaviour. By using an in vitro three‐dimensional (3D) co‐culture assay of normal or scarred human vocal fold fibroblasts (VFFs) and bone marrow‐derived MSCs (BM‐MSCs) in a uniquely suited hyaluronan hydrogel (HyStem–VF), we investigated cell morphology, survival rate, proliferation and protein and gene expression of VFFs and BM‐MSCs. BM‐MSCs inhibited cell proliferation of both normal and scarred VFFs without changes in VFF morphology or viability. BM‐MSCs demonstrated decreased proliferation and survival rate after 7 days of co‐culture with VFFs. Interactions between BM‐MSCs and VFFs led to a significant increase in protein secretion of collagen I and hepatocyte growth factor (HGF) and a decrease of vascular endothelial growth factor (VEGF), monocyte chemotactic protein‐1 (MCP‐1) and interleukin‐6 (IL‐6). In particular, BM‐MSCs significantly upregulated matrix metalloproteinase 1 (MMP1) and HGF gene expression for scarred VFFs compared to normal VFFs, indicating the potential for increases in extracellular matrix remodelling and tissue regeneration. Application of BM‐MSCs‐hydrogels may play a significant role in tissue regeneration, providing a therapeutic approach for vocal fold scarring. Copyright © 2013 John Wiley & Sons, Ltd.     

Comparison of ex vivo expansion culture conditions of mesenchymal stem cells for human cell therapy

BACKGROUND: Mesenchymal stem cells (MSCs) are multipotent stem cells. Based on their properties, several clinical trials have been designed to explore their potential therapeutic effect. Fetal calf serum (FCS, commonly used for in vitro expansion) is an undesirable source of xenogeneic antigens and bears the risk of transmitting contaminations. As an alternative for FCS, platelet lysate (PL) and both autologous and allogeneic human serum have been proposed. The aim of this study is to compare the culture of bone marrow (BM)-derived MSCs in the presence of different serum supplements to determine the effect on cell growth, differentiation potential, and immunologic function.
STUDY DESIGN AND METHODS: MSCs from BM of healthy volunteer donors were grown in the presence of 10% FCS supplemented with 1 ng/mL basic fibroblast growth factor (bFGF), 10% human serum supplemented with 1 ng/mL bFGF, 5% PL, and PL 5% supplemented with 1 ng/mL bFGF (PL plus bFGF).
RESULTS: MSCs that expanded in either medium showed a comparable morphology, phenotype, and proliferative and differentiation capacity. While the presence of MSCs in vitro significantly decreased CD3/CD28-mediated T-cell activation, this effect was significantly higher in MSCs cultured with human serum. Production of interferon-γ was inhibited by cocultured media with MSCs while MSCs also induced a significant inhibition of cell cycle in T cells.
DISCUSSION: In conclusion, PL or autologous serum could offer an alternative to the use of FCS in MSC expansion for clinical use maintaining the same growing potential, phenotype, immunomodulatory properties, and differentiation potential.     

Colony-stimulating activity of fetal liver cells: synergistic role of stem cell factor in bone marrow recovery from aplastic anemia

Previously, we and others have shown that fetal liver infusion (FLI) leads to autologous hematopoietic improvement in 40-54% of patients with aplastic anemia. However, whether this recovery was spontaneous or the effect of the infused liver cells was not clear. To dissect the role of FLI in autologous hematopoietic recovery, the colony-supporting potential of fetal liver-conditioned medium (FLCM) was evaluated in bone marrow (BM) cells of normal adult and aplastic anemia patients. In both cases, each sample of FLCM supported the growth of colony-forming cells in semi solid culture medium. The FLCM was assayed for the presence of four principal colony-stimulating cytokines, namely stem cell factor (SCF), granulocyte-macrophage colony-stimulating factor (GM-CSF), interleukin-3 (IL-3), and erythropoietin (Epo). While GM-CSF, IL-3, and Epo were present in insignificant amounts or were altogether absent, 50-635 pg/ml of SCF was found in 8 of the 13 FLCM samples tested. Preliminary results of bioneutralization assay indicated the possible role of SCF, secreted by the FL cells, in colony-supporting activity of aplastic anemia and normal BM cells. Overall, our in vitro study implicates the paracrine role of infused FL cells in regenerating autologous hematopoiesis in aplastic anemia patients.     

Inhibitors of Erythropoiesis

Abstract

Background: It has been questioned whether bone marrow-derived mesenchymal stromal cells (MSCs) from patients with ischemic heart disease are suitable for use in regenerative stem cell therapy. We compared MSCs from patients with chronic coronary artery disease (CAD) and MSCs from young healthy donors with respect to phenotype, proliferation and endothelial differentiation capacity. Methods: MSCs from 16 young healthy donors and 15 elderly CAD patients were isolated, expanded by ex-vivo cultivation for two cell passages and characterized by flow cytometry, real time PCR and angiogenesis assay. Results: MSCs from healthy donors and CAD patients expressed the same surface markers and had similar proliferation capacity. In both groups VEGF-stimulation significantly increased the expression of the endothelial genes thrombospondin 1, Tie-2 and von Willebrand Factor and induced the capacity to form ring structures on extracellular matrix. Discussion: MSCs from young healthy donors and CAD patients proliferate equally well, express the same surface markers and increase in endothelial gene expression and ring structure formation capacity in the angiogenesis assay upon VEGF-stimulation. MSCs from CAD patients do not seem to be inferior to MSCs from young healthy donors thus indicating that autologous MSCs may be suitable for cell therapy in CAD patients.