幽门螺杆菌尿素酶B基因的限制性片段长度多态性分型和生物信息学分析

目的：对不同来源野生型幽门螺杆菌（Hp）菌株的尿素酶B基因进行限制性片段长度多态性（RFLP）分型和生物信息学分析。方法：采用HaeⅢ单酶切法对国内临床分离的Hp菌株、动物模型适应株及国际标准Hp菌株尿素酶B（ureB）基因进行RFLP分型，同时进行基因测序和序列同源性对比及进化树分析等生物信息学研究。结果：HaeⅢ单酶切结果显示，14株Hp 1．7kb ureB基因均呈现出2～5种带型，可分为五组，其中两种国际标准株NCTC11637、NCTC11639和三种临床分离野生株拥有相同的RFLP带型，其他国内临床分离株和动物适应株分属于四种不同的RFLP带型组。ureB基因序列同源性比对表明，各种Hp菌株间核苷酸序列同源性均〉96．6％，氨基酸序列同源性均〉98％，其中CCS9801、CCS9806、M3及M10菌株之间的核苷酸和氨基酸序列同源性为100％。核苷酸序列进化树分析显示，2株国际标准株与国内临床分离株及动物适应株分处于不同进化分支，为平行进化关系；而在氨基酸序列进化树中转变为非平行关系。结论：不同Hp菌株尿素酶B在基因和蛋白质水平均高度保守和同源。     

漳州市肠道病毒71型分离株的VP1区基因特征分析

目的了解漳州市肠道病毒71型分离株的VP1区基因特征。方法对2010年漳州市的5株肠道病毒71型分离株进行VP1区基因全长序列测定,测序结果利用DNASTAR软件进行核苷酸、氨基酸序列分析和同源性比较,并用Mega4．0软件构建系统发生树。结果5株肠道病毒71型分离株的VP1区核苷酸序列全长均为891bp,且与2008年安徽阜阳流行株Fuyang．Anhui．P．R．C-17．08-2的VP1区核苷酸序列同源性和氨基酸序列同源性最高,分别为98．2％-98．8％和99．7％-100．0％。5株肠道病毒71型分离株间的核苷酸序列同源性为97．2％-99．8％．氨基酸序列同源性为99．3％～100．0％。氨基酸在98位和218位这两个位点发生了特异性变异。VP1区基因遗传进化分析表明,漳州市所有分离株均属于C4基因亚型的C4a进化分支。结论5株肠道病毒71型分离株均属于C4基因亚型的C4a进化分支．与2004年以来的中国大陆EV71病毒流行的基因型完全-致。     

2004年宁波大学流感爆发病毒株的血凝素基因分析

目的了解宁波地区流行性感冒(流感)病毒株的变异情况。方法采集2004年5月宁波大学流感爆发期间病人的含漱液进行病毒分离、鉴定，并对其中1株病毒的血凝素重链区进行了核苷酸和氨基酸序列分析。结果在9份样品中共分离到流感病毒3株，经血清学试验鉴定为甲3型。与2002年宁波市流感病毒流行株的核苷酸同源性为98．2％-98．3％，氨基酸同源性为96．7％-97．3％；与2003年流行株的核苷酸同源性为98．7％，氨基酸同源性为97．6％；与参考株A／Sydney／05／1997的核苷酸同源性为95．9％，氨基酸同源性为92．7％；与参考株A／Wuhan／359／1995的核苷酸同源性为94．6％，氨基酸同源性为91．2％。结论2004年宁波大学流感爆发的病毒为甲3型。其HA1区序列更接近2003年流行毒株，与A／Sydney／05／1997毒株的同源性要高于A／Wuhan／359／1995。该爆发流行的毒株可能是在宁波以前流行毒株的基础上进化而来的。     

恶性疟原虫子孢子表面蛋白2基因的克隆与序列分析

目的：克隆恶性疟原虫海南株(FCC1／HN)子孢子表面蛋白2(PfSSP2)基因，并进行序列分析。方法：根据PfSSP2基因已知序列设计合成一对引物，用PCR技术从FCC1／HN株基因组DNA中扩增出PfSSP2基因，并克隆入pMD-18T测序载体。用双脱氧链末端终止法测序，用DNAstar软件辅助分析基因结构及进行同源性比较。结果：PCR扩增得到特异的FCC1／HN株PfSSP2基因序列，酶切及PCR鉴定获得了正确的pT-PfSSP2重组质粒。测序表明，所克隆的PfSSP2基因大小为1680bp，编码559个氨基酸残基。序列分析表明，我国恶性疟原虫FCC1／HN株与国外的3D7、DD2、FCR3、HB3A、K1、Thai814、Thai838、Thai842、Thai947及7G8株PfSSP2的氨基酸序列在33个位点存在氨基酸替代，1处氨基酸序列增加；各株间PfSSP2的氨基酸序列同源性都在95.7％以上。结论：克隆了恶性疟原虫FCC1／HN株PfSSP2基因。序列测定及同源性分析表明，恶性疟原虫不同分离株间有高度的同源性。     

湖南狂犬病毒P基因和M基因分子遗传特征

目的了解湖南省狂犬病毒的分子流行病学特征以及其与疫苗株的差异。方法对4株湖南狂犬病病毒P和M基因同时进行了RT-PCR扩增、克隆和测序。结果同源性分析表明，4株湖南街毒P和M基因核苷酸同源性分别为97．3％-99．4％和98．4％-99．8％；与其它I型狂犬病病毒和疫苗株核苷酸同源性比较，P基因分别为78．4％-90．2％和81．8％-86．8％；M基因的分别为81．8％-92．1％和84．7％-90．6％。4株野毒P和M基因氨基酸同源性分别为98．0％-99．3％和98．5％-99．0％。结论4株病毒P基因和M基因的核苷酸序列及推导的氨基酸序列与我国现用的人用及兽用疫苗株存在一定差异。进化关系表明，4株病毒均为基因I型狂犬病毒；与我国宁夏分离株最近；与其它I型毒株分离自菲律宾和泰国等东南亚的毒株亲缘关系较近；而与翼手目的毒株关系最远。     

丙型肝炎病毒Ns_3基因区部分序列的PCR克隆和鉴定

选取HCV－1、HCV－J、HCV－BK、台湾株HCV、中国河北株HCV序列的同源性部分，设计Ns3区部分序列的PCR引物．应用RT－PCR技术，从丙型肝炎患者血浆中扩增一长为448bp的cDNA片段作为目的基因，与经过限制性酶切的pUcI9载体连接，构建重组质粒pUHCV－Ns3．分别或混合应用HCV序列特异的引物和载作序列特异的通用引物，以PCR扩增重组质粒，结果扩增产物的分子量均与预期大小一致．限制性酶切位点分析结果也证实，克隆的基因是HCV的Ns3区部分序列的目的基因．克隆序列的特异性和插入方向同时得到了鉴定．     

扬州地方株HPV16 L1基因的克隆及序列分析

目的：了解扬州地方株HPV16L1基因结构特点,为研制HPV16疫苗奠定基础。方法：从感染HPV16的宫颈癌组织中提取DNA,用PCR技术获得HPV16L1基因,以pGEM-Teasy为克隆载体构建重组质粒pGEM-T-L1,进行限制性核酸内切酶及核苷酸序列分析。结果：扬州地方株与德国标准株在核苷酸序列上有7处不同,其中4处由于核苷酸的改变,其编码氨基酸也相应发生变化,与标准株的同源性为99．7％;扬州地方株与中国株之间也存在1至2处核苷酸不同,但未造成氨基酸序列改变,其同源性为99．9％。结论：扬州地方株HPV16L1基因与标准株、中国株之间均存在差异,但与后者的差异极小,未造成氨基酸改变。     

广东流行的三株登革1型病毒包膜蛋白基因的序列测定与分析

目的通过对广东省不同地区、不同流行期间分离的三株登革1型病毒(DVI)的结构蛋白E基因进行序列测定及分析．了解各流行株之间的遗传差异，追踪其可能的传染来源：方法应用RT-PCR技术扩增病毒的结构蛋白E基因，克隆到PMD18-T载体．转化JM109宿主菌，挑取阳性克隆进行鉴定及序列测定，应用计算机软件与国内外参考及流行株进行同源性分析．并绘制基因系统发生树：结果3株DVI病毒E基因序列长度均为l485bp，编码495个氨基酸，核苷酸序列同源性在91％～98％之间、推测的氨基酸序列同源性在94％～99％之间：GD23／95与A88核苷酸(氨基酸)同源性为95％(98％)，与其他株的同源性相对较低，2株属同一基因型；GD14／97和GD05／99与Cambodia共享序列非常接近．3株同属另一基因型。结论广东省1997、1999和1995年流行的登革热可能来自境外不同的疫源地。     

人巨细胞病毒地方分离株的鉴定及其UL83序列分析

目的鉴定从合肥市某医院先天性脑瘫患儿尿标本中分离的4株人巨细胞病毒（HCMV）毒株并对其UL83基因序列进行分析，为HCMV感染的预防及pp65蛋白疫苗的研制提供参考依据。方法应用细胞培养法复苏病毒，间接免疫荧光法检测pp65蛋白表达，并用特异性引物对UL73基因进行PCR，扩增的产物经凝胶纯化后测序；序列结果运用DNAMAN软件和GenBank登录的3株代表性HCMV毒株进行核苷酸和氨基酸序列比对。结果HCMV AD169株与HCMV-1分离株的UL83基因核苷酸及编码氨基酸序列的同源性均为100％，与其余3株的同源性也达99．26％～99．69％；4株HCMV分离株与Merlin株、Towne株在相应基因片段核苷酸及氨基酸的同源性最低的分别为98．95％，99．06％。结论UL83序列分析结果表明，HCMV UL83编码pp65蛋白的优势抗原决定簇氨基酸序列无变化。     

新疆2011-2013年肠道病毒71型VP1区基因特征分析简

目的了解新疆肠道病毒71型（EV71）分离株VP1区基因特征。方法选取2011-2013年新疆部分地州手足口病病例标本,临床标本或其病毒培养物经实时荧光PCR鉴定后,通过RT—PCR法进行VP1区编码基因扩增,并对扩增产物进行序列测定,所得序列用ChromasPro1．7．4,BioEdit7．1．11和MEGA5．1软件进行序列校正、拼接、整理和分析,并与EV71各型及亚型参考序列构建基于VPl序列的系统进化树。结果新疆EV71分离株之间核苷酸和氨基酸序列同源性在92．8％～100．0％和97．9％～100．0％,22株病毒株与安徽阜阳和山东临沂C4a基因参考株最为相近,核苷酸和氨基酸序列序列同源性在93．9％～98．6％和98．6％～99．6％。而与A、B基因型参考株差异较大,核苷酸和氨基酸序列序列同源性在82．1％～84．8％和95．9％～98．3％。直接用临床标本进行核酸提取、扩增和序列测定的阳性率为30．0％,低于用病毒培养物的阳性率（100．0％）。结论2011—2013年新疆EV71分离株均为C4a基因型,与安徽和山东分离的EV71毒株可能有相同的起源。直接用临床标本进行核酸提取、扩增和序列测定可用于肠道病毒的分型鉴定。     

Similarity and diversity in sequence of HCV genome among Chinese, Japanese and American strains.

To estimate the homology between Chinese HCV strain, Japanese HCV strain and American HCV strain, we isolated and sequenced 8 clones, representing a 277-long fragment of high diversity. Chinese HCV strain was found to be homologous only in 68.6-72.6% for nucleotide sequence and in 69.6-73.9% for amino acid sequence to American HCV strain, but in 83.4-88.4% for nucleotide sequence and in 78.3-88.0% for amino acid sequence to Japanese main strain. The isolated strain may be the main strain in China, which can be divided into several substrains. This result is believed to be of paramount importance for the development of HCV detection method and vaccination as well as for the study on pathogenesis of HCV infection.

     

Comparison between homologies of E2/NS1 gene from genotype III Chinese isolates of hepatitis C virus and that from reported isolates

ＨｅｐａｔｉｔｉｓＣｖｉｒｕｓ（ＨＣＶ）ｉｓｔｈｅｍａｊｏｒｃａｕｓａｔｉｖｅａｇｅｎｔｏｆｎｏｎＡ,ｎｏｎＢｈｅｐａｔｉｔｉｓｔｈｒｏｕｇｈｏｕｔｔｈｅｗｏｒｌｄ．１Ｒｅｃｅｎｔｌｙ,ｉｔｗａｓｓｕｇｇｅｓｔｅｄｔｈａｔｐｒｏｄｕｃｔｅｎｃｏｄ...     

Homology of Chinese, Japanese, and American strains of hepatitis C virus]

As we know, the main HCV strain in Japan (HCV-J 4) is highly diverse in sequence from the original American strain (HCV-US). By comparing the sequences of these two strains, a region, located in the 3'-terminus of the putative E gene in HCV genome, was selected for PCR amplification. In this region, the Japanese strain showed high diversity from the American strain. From 4 patients, 8 isolates with the length of 277 bp, were cloned and sequenced. The homology of these 8 clones was high, indicating that these clones were in the same strain. This strain might be the major strain in China, named HCV-CHN1 in this paper. Since there were still many varieties in these 8 clones, HCV CHN1 could be possibly divided into 3 substrains. HCV-CHN1 was also found to be similar to HCV-J 4, with nucleotide homology of 83.4-86.3%, and amino acid homology of 78.3-88.0%, but remote from HCV-US, with homologies of only 68.6-72.6% and 69.6-73.9%, respectively. These results might be of paramount significance in developing the detection method for HCV infection and in preparing HCV vaccine.     

丙型肝炎病毒山东分离株核衣壳蛋白区cDNA的序列测定

①目的　通过核衣壳蛋白区（ Ｃ区）基因序列分析,对丙型肝炎病毒（ Ｈ Ｃ Ｖ）山东分离株进行定型。②方法　应用反转录套式聚合酶链反应（ Ｒ Ｔｎｅｓｔｅｄ Ｐ Ｃ Ｒ）方法,从山东省 Ｈ Ｃ Ｖ 抗体阳性血清中扩增出 Ｈ Ｃ Ｖ Ｃ区基因的一个片段（４３２ｂｐ）,对其进行 Ｔ Ａ 克隆及测序,并通过 Ｄ Ｎ Ａ Ｓ Ｉ Ｓ软件和 Ｇｅｎｅｂａｎｋ 进行序列分析。③结果　此分离株与基因型１ｂ 的 Ｈ Ｃ Ｖ 分离株同源性最高,与４ 个已知 １ｂ 型分离株的核苷酸相应序列同源性为 ９６．５２８％ ～９８．１４４％ ,其推导的氨基酸同源性为９４．４４４％ ～９６．０３２％ ．④结论　此分离株归为 １ｂ 型。     

山东省HCV分离株C 区及NS5 区核苷酸序列分析

①目的 探讨山东省丙型肝炎病毒（ＨＣＶ）分离株Ｃ区、ＮＳ５区的核苷酸序列及其基因型别。②方法 以ＲＴ－ｎｅｓｔ－ＰＣＲ方法从１例临床ＨＣＶ感染者血清中分别扩增出ＨＣＶＣ区（４３２ｂｐ）及ＮＳ５区（３１９ｂｐ）的基因片段,将其克隆于Ｔ载体上,以双脱氧末端终止法自动测序并进行序列分析。③结果 该分离株与ＧｅｎＢａｎｋ中５０多个１ｂ型分离株同源性均在９０％以上,其中Ｃ区与中国北京的１ｂ型株ＨＣＵ６３３７     

广东省东莞市2017-2018年登革病毒E基因进化分析

目的 测定广东省东莞市2017—2018年Ⅰ~Ⅳ型登革病毒（DENV-1~DENV-4）的E基因序列,分析其系统进化情况及流行基因亚型,从分子水平探讨病毒来源。方法 收集东莞市2017—2018年140例可疑登革热患者急性期血清,用实时荧光PCR方法检测病毒核酸,阳性血清用C6/36细胞分离培养登革病毒,测定分离株E基因序列,绘制系统进化树,结合流行病学资料进行分子流行病学分析。结果 140份急性期血清中DENV核酸阳性54份,阳性率38.6%,DENV-1阳性占53.7%。分离得到17株毒株。序列比对和系统进化分析显示,10株DENV-1分离株间核苷酸同源性为90.0%~99.9%,氨基酸同源性为96.6%~99.8%,分属基因Ⅰ型和基因Ⅴ型。7株基因Ⅰ型分离株与泰国2015年、缅甸2015年、中山2015年及越南2016年流行株核苷酸同源性较高(99.3%~99.9%),其中2018年本地株D2018078与2017年输入株D2017008核苷酸同源性达99.8%;3株基因Ⅴ型分离株与印度2014年、2017年株及新加坡2014年流行株核苷酸同源性较高(97.7%~99.1%)。4株DENV-2分离株间核苷酸同源性为91.0%~98.6%,推导氨基酸同源性为97.6%~99.8%,分属混合型和亚洲Ⅰ型,2株混合型分离株与马来西亚2014年、台湾2015年流行株核苷酸同源性较高(99.6%~99.7%);2株亚洲Ⅰ型分离株分别与越南2015年、泰国2011年流行株核苷酸同源性较高(99.3%~99.5%)。2株DENV-3分离株间核苷酸同源性为98.4%,氨基酸同源性为99.4%,均属基因Ⅰ型,与缅甸2017年、马来西亚2015年流行株核苷酸同源性较高(99.3%~99.7%)。1株DENV-4分离株与越南2013、2016年流行株同源性较高(99.3%~99.5%),属基因Ⅰ型。结论 2017—2018年东莞市登革热的病原体主要为DENV-1,其次是DENV-2,各至少有2种基因亚型同时在流行;DENV-3和DENV-4各至少有1种基因亚型在流行。流行方式主要为南亚和东南亚国家及我国中山、台湾等地输入病例引起的本地暴发流行,存在输入引起本地感染的风险。     

深圳市2015年首例输入性登革热病毒溯源分析

目的 对2015年深圳市报告的首例输入性登革热病例进行溯源分析。方法 收集该病例流行病学资料及血清样本,并通过免疫层析法和实时荧光RT-PCR对该病例血清中的特异性IgM抗体、IgG抗体、NS1抗原及病毒核酸进行检测。用C6/36细胞对血清进行病毒分离。对分离株的E基因进行序列测定,与不同型别的标准株及不同地区的分离株进行同源性分析并构建系统发生树。同时对糖基化位点、毒力位点上的序列进行比较。结果 从该病例血清中检测出IgM抗体、NS1抗原和2型登革病毒RNA,并成功从血清样本中分离出登革病毒DEN2-SZ1503。 SZ1503与标准2型登革病毒NGC株E基因的核苷酸及氨基酸序列同源性分别为93.8％和97.8％。系统发生树表明SZ1503与SG（EHI）D2 / 06572Y13株（Malaysia 2013）,具有最高相似性,且位于系统发育树的同一分支中。该分离株同1051株（Indonesia 76）、10株（Somalia 84）和271-206株（Sri Lanka 90）一起属于基因型Ⅳ。SZ1503株E基因的糖基化位点与其他登革热2型毒株相同,毒力位点也与之前报道的毒株一致。结论 病毒学、血清学和流行病学结果表明,该输入登革热病例是由2型登革热病毒引起的,SZ1503病毒株的遗传特征与马来西亚流行的登革热病毒一致。     

7型腺病毒温州株基因组主要序列的克隆与分析

目的：克隆和分析7型腺病毒温州株（Ad7wz1）基因组主要序列ITR、E1A261R、E1B55kDa、Hexon和E3。方法：分离并提取了Ad7wz1基因组DNA,PCR扩增得到各基因后利用PMD18 simple T载体进行克隆,并测序分析。结果：获得Ad7wz1 ITR-L、E1A261R、E1B55kDa、Hexon、E3和ITR-R六个基因的克隆,并测得核苷酸序列;分析表明其核苷酸序列和相应的氨基酸序列与GenBank上已发表的Ad7全基因组序列比较同源性分别达到93.2%～100%和97.8%～100%。结论：初步确定本次分离的Ad7wz1毒株为Ad7d2型,Ad7wz1与已经发表的Ad7病毒株序列有高度同源性,为研究Ad7的致病机制提供了重要的理论基础。     

汉坦病毒湖北株M片段G1编码区基因变异研究

目的 :探讨近年来汉坦病毒HTN湖北株M基因片段G1编码区部分基因序列的变异情况。方法 :根据汉坦HTNM片段G1编码区核苷酸序列设计引物 ,利用RT PCR方法对 75份病程在 7d以内的肾综合症出血热 (HFRS)患者 (经临床诊断和ELISA确诊 )血清标本进行检测 ,并对扩增出的目的基因片段选用 3种限制性内切酶AluⅠ、RsaⅠ、MboⅠ进行酶切 ,根据限制性片段长度多态性分析筛选出变异毒株 ,继而通过序列测定 ,得到变异毒株G1编码区部分核苷酸序列 ,并与标准株HTN76 118及地方株HTN 114的相应核苷酸序列及氨基酸序列进行比较分析。结果 :75份血清标本通过RT PCR方法进行检测 ,阳性率为 77.3 %。扩增片段用 3种限制性内切酶AluⅠ、RsaⅠ、MboⅠ进行酶切分析 ,发现 4份阳性产物其限制性片段长度多态性与HTN 76 118均不相同 ,但其中 3份阳性产物限制性片段长度多态性与地方株HTN 114基本相同 ,1份与HTN 114株不完全相同。对该扩增产物的核苷酸序列和氨基酸序列进行同源性分析表明 ,其核苷酸序列与标准株 76 118的同源性为 83.3 % ,与地方株HTN 114的同源性为 96 % ;推导氨基酸序列与HTN 76 118的同源性为 93.2 % ,与地方株HTN 114的同源性为 99%。结论 :①近年来引起湖北地区HFRS的主要毒株仍为HTN地方株。②从分析的病