重链可变区基因随机CDR3ScFv噬菌体抗体库的构建及筛选

目的构建VH 基因随机CDR3ScFv噬菌体抗体库 ,并筛选抗HFRS病毒NP抗原的噬菌体抗体。方法采用随机引物PCR法扩增抗HFRS病毒mAb1A8的VH 基因 ,并与1A8VL 基因共同克隆入噬菌粒表达载体 pHEN1后 ,构建VH 基因随机CDR3ScFv基因库。继用辅噬菌体VCSM13超感染后得到噬菌体抗体库 ,然后用HFRS病毒抗原进行筛选。随机挑取筛选的菌落超感染 ,用夹心ELISA检测超感染上清。结果获得库容量约为107 噬菌体抗体库。夹心ELISA的结果表明 ,筛选出的噬菌体抗体可与HFRS病毒NP抗原特异性结合。结论成功地构建了库容量较高的ScFv噬菌体抗体库 ,并获得可与HFRS病毒NP抗原结合的噬菌体抗体。     

抗肝癌细胞噬菌体单链抗体库的构建及筛选

构建抗人肝癌细胞单链抗体库 ,从中筛选与肝癌细胞特异结合的高亲和力单链抗体。从HepG2细胞免疫的BALB/c小鼠脾脏提取总RNA ,RT PCR扩增小鼠抗体重、轻链可变区基因 ,用 (Gly4Ser) 3 连接肽基因 ,经重叠延伸反应 ,在体外将VH 和VL 连接成单链抗体 (scFv)基因 ,并克隆入噬菌粒载体pCANTAB5E中 ,构建噬菌体单链抗体库。以HepG2细胞为抗原对抗体库进行淘选 ,ELISA法鉴定各单克隆与肝癌细胞的结合活性 ,并对阳性克隆进行表达。成功构建了库容为 1 1× 10 6抗肝癌细胞的噬菌体单链抗体库 ,经筛选得到了与HepG2细胞具有较强结合能力的单链抗体 ,实现了scFv在大肠杆菌中的可溶性表达。序列测定结果表明 ,VH 和VL 基因符合小鼠抗体可变区特征 ,scFv基因拼接正确     

鼠源性抗人HAAH mAb可变区基因克隆及单链抗体的构建和表达

目的:从分泌抗人类天冬氨酰基β-羟化酶(HAAH)单克隆抗体(mAb)的杂交瘤细胞G3/F11中,克隆出鼠源an-ti-HAAH mAb重、轻链町变区基因,构建Anti-HAAH的单链抗体(scFv),并进行scFv基因的蛋白表达.方法:提取杂交瘤细胞G3/F11的总RNA,通过RT-PCR扩增出VH和VL基因;再利用重叠延伸PCR(SOE-PCR),通过设计在引物上的linker序列,将VH和VL拼接为完整anti-HAAH scFv基因.将测序正确的scFv基因克隆入pHEN 1载体,并利用E.coli HB2151进行蛋白表达;通过SDS-PAGE,Western blot分析其表达状况,ELISA鉴定其抗原结合活性.结果:测序结果显示,本实验成功地构建出鼠源anti-HAAH VH-linker-VL scFv基因,且VH、VL均具有完整正确的小鼠抗体骨架区和互补决定区结构,所得的scFv基因片段全长744 bp,编码248个氨基酸.SDS-PAGE和Western blot分析表明,pHEN 1-anti-HAAH在E.coli HB2151可表达为Mr约27 000的可溶性scFv蛋白,表达量为7.8%.间接ELISA检测显示,可溶性鼠源anti-HAAH scFv蛋白具有较高的抗原结合活性.结论:成功扩增出的鼠源anti-HAAH mAb VH区和VL区基因,并构建为anti-HAAH scFv基因.然后,利用pHEN 1载体对anti-HAAH scFv基因进行成功表达,为进一步研究其生物活性及应用奠定了基础.     

抗重组人bFGF单克隆抗体可变区基因克隆及单链抗体的构建和表达

目的：从分泌抗重组人碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）单克隆抗体（mAb）杂交瘤细胞株B2F3中克隆抗体可变区（V）基因，构建bFGF单链抗体（scFv），并进行可溶性表达。方法：从分泌bFGF mAb杂交瘤细胞株B2F3提取总RNA，用RT-PCR方法扩增抗体重链可变区基因（VH）和轻链的可变区基因（VL）；再通过重叠延伸拼接（SOE）PCR方法，在VH和VL基因之间引入linker（Gly4Ser）3，构建bFGF scFv。将测序正确的scFv基因克隆到表达载体pCANTAB 5E中，选择非抑制型菌株E.coli HB2151进行可溶性表达；经SDS—PAGE检测抗体表达水平，ELISA鉴定其抗原结合活性。结果：测序分析结果显示，VH基因序列全长375碱基对，编码125个氨基酸，VL基因序列全长399碱基对，编码133个氨基酸，二者均符合小鼠免疫球蛋白可变区基因特征，含有4个框架区（FR）、3个抗原互补决定区（CDR）及抗体特征性的2个半胱氨酸残基；构建的scFv全长789碱基对，编码263个氨基酸，连接结构为VH-linker-VL。SDS-PAGE分析表明scFv基因在大肠杆菌为可溶性表达，表达产物主要位于周质腔中，表达产物的Mr为27000，与理论预期值相符；间接ELISA检测结果显示原核表达的scFv具有与bFGF特异性结合的活性。结论：成功地克隆bFGF mAb可变区基因，并构建表达bFGF scFv，为下一步研究bFGF抗体人源化改造奠定实验基础。     

抗人整合素αυβ3单链抗体的构建和表达

目的：利用基因工程抗体技术构建抗人整合素αυβ3单链抗体(scFv)。方法：从分泌抗人整合素αυβ3单抗(mAb)的杂交瘤细胞E10总RNA中，用RT-PCR扩增VH和VL基因，对其核苷酸序列分析后，通过PCR在VH和VL基因间插入柔性连接子(Gly4Ser)3 组装成scFv基因，并克隆至原核表达载体pTIG—TRX中。以重组子转化大肠杆菌B121(DE3)诱导目的基因表达。结果：转化菌可表达相对分子质量(Mr)为31000的scFv。Western blot证实，具有His6标签蛋白的表达。经低剂量的IPTG诱导和较低温度培养，scFv获得了可溶性形式表达。表达产物经Ni—NTA琼脂糖层析纯化后纯度达91％以上。ELISA鉴定证实，scFv具有良好的抗原结合活性。结论：成功地构建并表达抗人整合素αυβ3的scFv，为进一步临床研究奠定了基础。     

抗B型葡萄球菌肠毒素高亲和力单链抗体的制备

目的 构建针对B型葡萄球菌肠毒素(SEB)的特异性单链抗体(scFv),并进行纯化和鉴定.方法 设计抗SEB高亲和力单克隆抗体(mAb) FMU-SEB-No.2重链和轻链可变区基因片段VH和VL的引物,利用RT-PCR技术,从本室制备的抗SEBmAb FMU-SEB-No.2杂交瘤细胞株中扩增出VH和VL基因片段;然后通过在轻链引物上设计linker序列,重叠引物延伸法(SOE)将VH和VL基因拼接成scFv基因片段,并将其克隆入原核表达载体PGEX4T-1中;转化E.coli BL21(DE3)感受态细胞,IPTG诱导表达,融合蛋白经谷胱甘肽亲和层吸柱纯化.采用SDS-PAGE,Western blot,ELISA等方法对其表达水平和特异性进行分析.结果 成功从1株抗SEB mAb FMU-SEB-No.2杂交瘤细胞株中扩增出VH和VL可变区基因,并通过linker序列将其拼接成scFv片段,大小约750 bp,编码250个氨基酸.PCR、酶切鉴定和测序结果表明表达载体构建成功.转化E.coli BL21(DE3),经IPTG诱导后,以可溶形式表达相对分子质量(Mr)约54 000的融合蛋白.经谷胱甘肽亲和层析法纯化融合蛋白,可获得纯度达90％以上的scFv,ELISA和Western blot法检测结果表明,可溶性scFv与抗原SEB有较强的结合活性.结论 成功构建并表达出抗SEB的特异性单链抗体.     

抗人整合素ανβ3单链抗体的构建和表达

目的 :利用基因工程抗体技术构建抗人整合素ανβ3 单链抗体(scFv)。方法 :从分泌抗人整合素ανβ3 单抗 (mAb)的杂交瘤细胞E10总RNA中 ,用RT PCR扩增VH 和VL 基因 ,对其核苷酸序列分析后 ,通过PCR在VH 和VL 基因间插入柔性连接子(Gly4Ser) 3,组装成scFv基因 ,并克隆至原核表达载体pTIG TRX中。以重组子转化大肠杆菌BL2 1(DE3 )诱导目的基因表达。结果 :转化菌可表达相对分子质量 (Mr)为 3 10 0 0的scFv。Westernblot证实 ,具有His6标签蛋白的表达。经低剂量的IPTG诱导和较低温度培养 ,scFv获得了可溶性形式表达。表达产物经Ni NTA琼脂糖层析纯化后纯度达 91%以上。ELISA鉴定证实 ,scFv具有良好的抗原结合活性。结论 :成功地构建并表达抗人整合素ανβ3 的scFv ,为进一步临床研究奠定了基础。     

大容量噬菌体抗体库的构建及鉴定

目的　构建大容量噬菌体单链抗体库 ,从中筛选人源单链抗体 (ScFv)。方法　从正常成人外周血和新生儿脐血分离淋巴细胞 ,用RT PCR扩增轻链可变区基因 (VL)和重链可变区基因(VH) ,通过重叠PCR法将VH 和VL 拼接形成ScFv基因 ,并克隆入噬菌体表达载体PDF ,得到ScFv初级噬菌体抗体库。以高MOI超感染cre 菌株BS136 5 ,通过loxp cre定位重组系统 ,介导轻重链的组合配对 ,得到大容量抗体库 ,用多种抗原对抗体库进行生物淘筛 ,鉴定抗体库的性能。结果　获得了 6×10 10 的大容量单链噬菌体抗体库。分别用卵清蛋白、胃蛋白酶、铁蛋白、人角蛋白、人TNF α、地高辛等6种抗原进行筛选 ,均得到多样性的特异性噬菌体抗体。结论　经loxp cre定位重组系统在单细胞内重组成功地构建了大容量单链噬菌体抗体库 ,初步尝试对 6种抗原进行筛选均获成功 ,提示该抗体库可用于制备具有应用前景的人源抗体     

大容量人源噬菌体抗体库的构建

目的:构建大容量易于改造成Diabody的噬菌体单链抗体库,筛选人源性抗体。方法:从正常成人外周血和新生儿脐血中分离淋巴细胞提取RNA,经RT-PCR扩增轻重链可变区基因(VL和VH),通过重叠PCR(over-lapPCR)将VL和VH拼接成单链抗体(ScFv)基因(其中VH两侧是两个非同源的loxp基因),并克隆入噬菌体表达载体PDF,得到初级噬菌体抗体库。将初级抗体库以高MOI超感染Cre+菌株BS1365,通过loxp-cre定位重组系统,介导轻重链在菌内重组配对,然后低感染XL1-Blue菌,得到大容量的次级抗体库。以多种不同抗原对库进行筛选,得到多样性较好的特异性抗体。结果:经超感染重组,得到1·2×1010的大容量抗体库。经三种蛋白抗原筛选,均得到多株特异性较好的噬菌体抗体,并成功构建为活性较好的Diabody。结论:经Loxp-Cre定位重组系统在单细胞内重组,能够高效地构建大容量噬菌体单链抗体库。     

抗人DR5单链抗体噬菌体展示文库的建立和筛选

目的应用噬菌体展示技术构建抗人DR5(death receptor 5,DR5)单链抗体(single chain Fv,scFv)文库,从中筛选抗DR5 scFv。方法利用重组人DR5抗原免疫小鼠,分别扩增小鼠VH和VL基因,经重叠延伸PCR将VH和VL基因拼接成scFv基因,以SfiⅠ位点定向插入PAK100噬菌粒载体,转化E.coli XL1-Blue,构建了库容为1×106的抗DR5单链抗体库。对抗体库进行5轮富集筛选后,phage-ELISA检测阳性克隆的抗原特异性,取1株阳性克隆进行测序分析。结果抗DR5 scFv基因序列长747 bp,编码249个氨基酸,具有和DR5结合的特异性。结论本文利用噬菌体抗体库筛选到了抗DR5 scFv,为研制临床免疫治疗的新型抗体奠定了实验基础。     

人源性抗角蛋白单链抗体的构建及表达

目的:克隆抗角蛋白抗体的可变区(V区)基因,构建抗角蛋白单链抗体(scFv)表达载体并表达。方法:根据人源性抗角蛋白Fab段的基因序列设计引物,用PCR方法克隆抗角蛋白抗体的V区基因,并重组到scFv的表达载体中,在大肠杆菌进行表达,表达产物经体外变性复性后进行SDS-PAGE鉴定。用ELISA检测其特异性结合活性。结果:成功地克隆抗角蛋白抗体的V区基因,构建了scFv的表达载体,并在大肠杆菌中表达。ELISA检测证实,表达的scFv保留了亲本Fab抗体的特异结合活性。结论:获得功能性抗角蛋白的scFv,可用于进一步的临床应用研究。     

抗木瓜凝乳蛋白酶单链抗体基因的构建、初步筛选和鉴定

目的 :构建抗木瓜凝乳蛋白酶全套单链抗体 (scFv)噬菌体表面展示文库。方法 :从木瓜凝乳蛋白酶免疫小鼠的淋巴细胞中提取总RNA ,反转录成cDNA后 ,用抗体V区简并引物扩增全套VH 和VL 基因。经重叠延伸反应 ,装配成scFv基因 ,并将其克隆到噬粒载体pFAB5C中 ,构建scFv噬菌体抗体库。对抗体库进行亲和筛选后 ,用ELISA法鉴定抗木瓜凝乳蛋白酶的scFv。结果 :经 4轮“亲和 吸附 洗脱”的富集过程 ,得到ELISA活性较高可与木瓜凝乳蛋白酶结合的克隆。结论 :成功地构建了抗木瓜凝乳蛋白酶的scFv噬菌体展示文库 ,并筛选到与木瓜凝乳蛋白酶具有结合能力的scFv基因     

抗溶藻弧菌独特型单克隆抗体单链抗体ScFv的构建和表达

目的：克隆抗溶藻弧菌独特型单克隆抗体ScFv。方法：从分泌抗溶藻弧菌独特型单克隆抗体的杂交瘤细胞株（2F4）中提取总RNA，利用RT-PCR技术，克隆该抗体重链可变区基因（VH）和轻链可变区基因（VL），通过基因重组构建VH-VL的表达载体pTAT-ALI，转化大肠杆菌BL21后用IPTG诱导表达。结果：VH基因序列全长369碱基对，编码123个氨基酸，VL基因序列全长339碱基对，编码113个氨基酸，二者均符合小鼠免疫球蛋白可变区基因特征，含有4个框架区（FRs）、3个抗原互补决定区（CDRs）及抗体特征性的两个半胱氨酸残基。ELISA测定显示基因工程抗体ScFv与原代抗体一样，具有较高的抗原亲和力。结论：成功构建了抗溶藻弧菌独特型抗体ScFv基因并表达于细菌壁膜间隙和包涵体中，为溶藻弧菌独特型抗体单链抗体ScFv成为新一代基因工程疫苗奠定了初步基础。     

人源化抗人肺癌单域抗体基因的构建、表达及活性分析

目的： 构建人源化的抗人肺癌单域抗体hu3D3VH基因, 在大肠杆菌中表达, 对其蛋白活性进行分析.方法： 采用CDR移植技术对mAb3D3的重链可变区进行人源化, 通过重叠PCR获得hu3D3VH的基因.构建pET22（b＋）/hu3D3VH表达载体, 并转化大肠杆菌BL21（DE3）, 在IPTG诱导下表达.表达产物通过Ni亲和层析柱纯化.采用间接ELISA和竞争抑制ELISA法进行活性分析.结果： 通过重叠PCR获得序列正确的目的基因.目的蛋白以包涵体的形式表达, 表达量占菌体总蛋白的30%以上.纯化后, 目的蛋白的纯度达95%以上.hu3D3VH具有与亲本抗体相同的抗原反应性, 并能抑制mAb3D3与L342细胞的结合.结论： 获得的人源化单域抗体hu3D3VH, 保留了与mAb3D3相同的反应性和特异性, 为进一步临床应用奠定了基础.     

抗人肺癌单链抗体噬菌体库的构建及特异性单链抗体的鉴定

目的 构建人源噬菌体抗体库,并从中筛选出抗肺癌人源单链抗体。方法 提取肺癌患者癌旁淋巴结组织,通过RT-PCR扩增出重链可变区基因（VH）和轻链可变区基因（VL）,再经剪切-重叠-延伸PCR(SOE-PCR)将VH 和VL连接得到单链抗体（ScFv）。将双酶切后的ScFv基因片段克隆入噬菌体表达载体pCANTAB5E,得到初级噬菌体抗体库。以肺腺癌细胞株A549为抗原对抗体库进行4轮筛选富集,鉴定抗体库性能。将得到的阳性克隆用IPTG诱导表达并进行检测。结果 成功构建噬菌体单链抗体库。经筛选富集,噬菌体收获率得到增加,第4轮是第1轮的115倍。随机选取10个克隆,通过ELISA法检测到其中7个与A549细胞呈阳性反应,阳性率为70%。SDS-PAGE及ELISA检测证实得到人源抗肺癌单链抗体。结论 成功构建人源单链抗体噬菌体库,从中获得具有较高特异性的抗人肺癌单链抗体。     

从人源全合成抗体库中筛选到抗人干扰素α1b单链抗体

目的研究开发人源抗huIFN—α的基因工程抗体,为系统性红斑狼疮（Systemic lupus erythematosus,SLE）的治疗提供有效的抗体药物。方法本研究利用噬菌体表面展示技术,以纯化的人干扰素α1b（huIFN-α1b）和人干扰素α2b（huIFN—α2b）蛋白为抗原从人源全合成抗体库中筛选抗huIFN-α的基因工程单链（single chain variable fragment,scFv）抗体,通过phage—ELISA对噬菌体单链抗体的结合特异性和稳定性进行验证。将单链抗体基因克隆到原核分泌表达载体pET22b上在大肠杆菌BL21（DE3）中表达,通过Western blot检测单链抗体的分泌表达,并通过ELISA对单链抗体的结合特异性进行验证。通过金属螯合亲和层析纯化单链抗体,并用Western Blot对单链抗体的结合特异性进行鉴定。结果经过3轮富集筛选,获得100株对huIFN—α1b有特异性结合的噬菌体单链抗体。对得到的86株克隆的测序分析表明,共有9株带有不同的抗体轻重链可变区序列及其组合的抗体,有7株抗体轻重链可变区序列分类在VH3和VL3家族,有2株抗体轻重链可变区序列分类在VH3和VL1家族。获得了5株稳定且特异针对huIFN—α1b而与huIFN-α2b和huIFN-γ无交叉反应的人源单抗。这5株抗体在BL21（DE3）中分泌表达,有3株单链抗体能特异性结合huIFN-α1b而与无关抗原无交叉反应。结论通过噬菌体表面展示技术,从人源全合成抗体库中筛选得到3株稳定且特异结合huIFN—α1b的人源治疗用基因工程单克隆抗体。     

抗SARS抗体独特型单链抗体的筛选及鉴定

目的从人源噬菌体抗体库中筛选抗SARS独特型抗体为SARS的诊断及疫苗的研究奠定基础。方法以混合SARS病人恢复期血清免疫球蛋白（Ig）作为筛选分子,从噬菌体抗体库中筛选出能与病人血清IgG（IgM）结合的抗体,并通过与混合正常人血清Ig作负性筛选,从而获得抗SARS病毒的独特型抗体（AId）。通过4轮“吸附-洗涤-扩增”,从最后一轮所得单克隆菌株中分别通过ELISA筛选出能和SARS病人恢复期血清Ig结合的菌株,提取质粒DNA,并对PCR扩增产物进行DNA序列测定,最后用所筛选的克隆通过与不同人群血清反应,证实其特异性。结果随机挑选经第4轮筛选后的200个单克隆菌落,其中有10个与SARS病人恢复期血清Ig结合的OD值明显高于其与正常人Ig结合的OD值;以上10个克隆经PCR扩增,其中有6个克隆于l000bp处有电泳条带;其DNA序列经与BLAST数据库和IMGT／QUEST软件比对有5个均与人的重链可变区（VH）和轻链可变区（VL）高度同源,且与其同源性最高的人Ig的VH属VHI亚群,VL属k链,属VKⅡ亚群;最后确认有3个克隆其噬菌体抗体和SARS病人血清Ig结合的OD值均明显高于与正常人血清Ig结合的OD值。结论利用抗体库技术可不经免疫制备特异性抗SARS抗体独特型抗体,为SARS诊断及疫苗的研制奠定基础。     

Interaction of the octapeptide angiotensin II with a high-affinity single-chain Fv and with peptides derived from the antibody paratope

The amino-acid sequence of the very high-affinity anti-angiotensin II monoclonal antibody 4D8 was predicted from the nucleotide sequence of the heavy and light chain variable genes. The single-chain variable fragment (scFv) was constructed and expressed in Escherichia coli as a soluble protein and at the surface of the filamentous M13 phage and was compared with the full-length antibody (Ab). The scFv showed the same specificity profile and affinity constant as the intact antibody (5.0x10(10) and 8.0x10(10) M(-1), respectively, by Scatchard analysis). Several peptides from the set of overlapping dodecapeptides covering the variable domains of 4D8 mAb were found to specifically bind biotinylated angiotensin II: peptides from the L1, L2, L3 and H1 regions had the strongest capacity to bind the antigen.     

从噬菌体抗体库中筛选抗角蛋白单链抗体

目的　从半合成噬菌体抗体库中筛选人源性抗角蛋白单链抗体 (scFv)并进行鉴定。方法　以人表皮角蛋白为抗原 ,通过“吸附 洗脱 扩增”过程从噬菌体抗体库中筛选特异性抗角蛋白单链抗体 ,对其抗原结合活性、识别角蛋白的相对分子质量 (Mr)和序列进行分析鉴定。结果　经过筛选 ,获得 6株能与角蛋白特异性结合的阳性克隆 ,所识别角蛋白的Mr 相同 ,均在 5 6 0 0 0～ 5 70 0 0之间 ;序列分析显示 ,所获抗体克隆的可变区基因分别属于免疫球蛋白基因家族的不同亚群。结论　利用噬菌体抗体库技术可以不经免疫制备出高特异性的人源性抗角蛋白单链抗体     

从噬菌体抗体库筛选人源性抗白细胞介素8抗体

目的: 从噬菌体抗体库中筛选人源性抗IL- 8单链抗体(scFV)。方法: 采用原核表达载体pRSET- IL- 8在大肠杆菌BL21(DE3)中表达IL- 8 His融合蛋白, 并通过亲和层析纯化。以该融合蛋白为固相抗原, 对噬菌体抗体库进行 3轮淘筛, 并对所获阳性克隆进行抗原结合活性测定和DNA序列测定。结果: 获得 2株特异性抗IL- 8噬菌体抗体。对其DNA序列测定结果表明, 其VH基因均属于人IgGVH3亚群, Vλ基因分别属于人VλDPL5和VλDPL2亚群。结论: 利用噬菌体抗体库技术可不经免疫制备人源性抗IL- 8抗体, 为银屑病及相关疾病的临床应用提供了条件。