SARS冠状病毒S蛋白S1区多肽与SARS病人血清的免疫反应

目的 测定根据计算机预测的SARS冠状病毒S蛋白S1区的抗原表位多肽与SARS病人血清的免疫反应,以寻找和确定SARS相关冠状病毒的中和抗原表位。方法 采用多肽合成仪合成SARS冠状病毒S蛋白S1区的多肽,并用ELISA方法检测合成的多肽与SARS病人血清的免疫反应。结果 合成的8个多肽与SARS病人血清免疫反应的光密度值是其与正常人血清免疫反应的光密度值的1.5～2.6倍。结论 合成的多肽与SARS病人血清的免疫反应较低,提示这些多肽是否为SARS冠状病毒的抗原表位还要进一步研究。     

SARS病毒S蛋白的原核表达与DNA疫苗的构建

目的探讨SARS冠状病毒的刺突(spike，S)蛋白的免疫学特性，以及S蛋白作为SARS—CoV病毒疫苗组分的可行性。方法将S蛋白基因分段克隆入原核表达载体pET—15b，并在大肠杆菌中表达，经过亲和层析得到纯化的重组蛋白rSa和rSb；将全长S基因克隆入真核分泌表达载体pSecTagB，得到重组DNA疫苗pSecS，免疫小鼠，得到SAS—CoV S蛋白抗血清。然后用纯化的重组蛋白rSa和rSb建立的SARS—CoV S抗体ELISA检测技术研究所构建的S-DNA疫苗的免疫效果。结果分段的重组蛋白rSa和rSb在大肠杆菌中均以可溶性形式得到高效表达，并能与SARS确诊病人血清以及pSecS免疫鼠血清发生特异性抗原抗体反应，原核表达的重组分段S蛋白具有SARS—CoV S蛋白相似的抗原性。结论原核表达的两段重组S蛋白有可能作为抗原组分用于临床SARS—CoV检测中；所构建的SARS—CoV的S基因核酸疫苗能在小鼠体内产生特异性抗体，这为进一步SARS DNA疫苗的研制提供一定的借鉴作用。     

SARS病毒S蛋白的原核表达与DNA疫苗的构建

目的 探讨SARS冠状病毒的刺突(spike,S)蛋白的免疫学特性,以及S蛋白作为SARS-CoV病毒疫苗组分的可行性。方法 将S蛋白基因分段克隆入原核表达载体pET-15b,并在大肠杆菌中表达,经过亲和层析得到纯化的重组蛋白rS_a和rS_b;将全长S基因克隆入真核分泌表达载体pSecTagB,得到重组DNA疫苗pSecS,免疫小鼠,得到SAS-CoVS蛋白抗血清。然后用纯化的重组蛋白rS_a和rS_b建立的SARS-CoVS抗体ELISA检测技术研究所构建的S-DNA疫苗的免疫效果。结果 分段的重组蛋白rS_a和rS_b在大肠杆菌中均以可溶性形式得到高效表达,并能与SARS确诊病人血清以及pSecS免疫鼠血清发生特异性抗原抗体反应,原核表达的重组分段S蛋白具有SARS-CoVS蛋白相似的抗原性。结论 原核表达的两段重组S蛋白有可能作为抗原组分用于临床SARS-CoV检测中;所构建的SARS-CoV的S基因核酸疫苗能在小鼠体内产生特异性抗体,这为进一步SARSDNA疫苗的研制提供一定的借鉴作用。     

严重急性呼吸综合征(SARS)临床排除病例与SARS病例心肌酶谱和体液免疫结果分析

目的 :分析 SARS临床排除病例与 SARS病例心肌酶谱和体液免疫的特征 ,为严重急性呼吸综合征( SARS)临床排除病例与 SARS病例的鉴别诊断提供依据。方法 :采用 ( IFCC)推荐方法、速率散射免疫比浊法和间接酶联免疫吸附实验 ( EL ISA)、双抗原夹心 EL ISA分别检测 18例 SARS临床排除病例和 4 5例 SARS病例入院第 2天血清天冬氨酸转氨酶 ( AST)、乳酸脱氢酶 ( L DH)、肌酸激酶 ( CK)、肌酸激酶同工酶 ( CK- MB)、羟丁酸脱氢酶 ( HBDH) ,血清免疫球蛋白 Ig G、Ig M、Ig A ,补体 C3、C4、C反应蛋白 ( CRP)的含量 ,以及血清抗 SARS病毒特异性抗体。结果 :SARS临床排除病例组 AST活力显著低于 SARS病例组 ( P<0 .0 5 ) ,L DH、HBDH活力也显著低于 SARS病例组 ( P<0 .0 1) ,CK、CK- MB活力与 SARS病例组无显著差别 ( P>0 .0 5 )。 SARS临床排除病例组 CRP含量显著低于 SARS病例组 ( P<0 .0 5 ) ,血清免疫球蛋白 Ig G、Ig M、Ig A,补体 C3、C4含量与 SARS病例组差异不显著 ( P>0 .0 5 )。间接 EL ISA检测 SARS临床排除病例特异性抗体 Ig G和 Ig M均为阴性 ,SARS病例组特异性抗体 Ig G阳性 32例 ,Ig M阳性 19例 ,累计阳性 34例 ;双抗原夹心 EL ISA检测 SARS临床排除病例特异性抗体阳性 1例 ;SARS病例组特异性抗体阳     

重组SARS-CoV刺突蛋白基因片段的原核表达及纯化

目的:冠状病毒(SARS-CoV)的刺突蛋白(spike glycoprotein,S蛋白)是病毒的主要结构蛋白之一,也是重要的病毒抗原,重组S蛋白的表达可用于检测病毒感染后血清抗体.方法:根据抗原性预测分析结果,将S蛋白中抗原决定簇的编码基因重新拼接成两个新的基因,通过全基因合成方式直接合成至原核表达载体pET32a( ),转化大肠杆菌BL21(DE3),以IPTG诱导表达,Ni-NTA试剂盒纯化目的蛋白.结果:SDS-PAGE证实重组S蛋白的表达,并被纯化.结论:重组刺突蛋白的表达及纯化,可做为检测SARS-CoV抗体的抗原,有助于进一步开展SARS-CoV相关研究.     

SARS病毒S1蛋白N端片段在大肠杆菌中的表达、纯化与鉴定

目的:获得纯化的重组SARS病毒S1蛋白N端部分,研究其与机体产生针对SARS病毒免疫应答的规律和机制.方法:将编码SARS病毒S1蛋白N端334个氨基酸残基的基因进行克隆,并在原核表达系统中表达,获得了纯化的重组蛋白.利用SARS患者恢复期已知的SARS抗体阳性血清,鉴定纯化的重组S1蛋白片段.结果:克隆表达的重组蛋白基因序列与公布的SARS病毒S1蛋白N端的基因序列相同,所表达的重组蛋白相对分子质量约为64 000.3份SARS患者恢复期的血清均与重组蛋白反应,在相对分子质量64 000处形成特异性的反应条带,而来自SARS流行前的正常人对照血清则不能与重组蛋白反应.结论:获得的重组蛋白与SARS病毒抗体呈现特异性的反应,为进一步研究SARS病毒感染免疫应答机制和制备SARS病毒的重组疫苗奠定基础.     

MART-1特异性治疗性多肽诱导CD8+ T细胞应答的研究

目的探讨基于黑色素瘤特异性抗原MART-127-35表位的治疗性多肽抗原组分、结构,及诱导抗原特异性CD8+ T细胞应答的关系.方法用蛋白质分子设计技术,设计基于黑色素瘤特异性抗原MART-127-35表位、HIV Tat49-57CCP序列及破伤风类毒素通用Th表位的治疗性多肽候选分子,经Merrifield固相多肽合成技术合成,HPLC纯化、鉴定.以黑色素瘤病人PBMC为实验对象,对其诱导T细胞增殖、Th1极化、抗原特异性CD8+ CTL效应进行研究.结果所设计治疗性多肽分子可在体外诱导Th1极化和抗原特异性CD8+T细胞应答,含Th、CTL表位的双表位肽抗原略优于单纯CTL表位肽,含Th、CTL表位和HIV Tat49-57CCP序列的肽抗原效应显著优于前二者(P<0.05).结论提示基于黑色素瘤特异性抗原优势CTL表位、HIV Tat49-57CCP序列及破伤风类毒素通用Th表位的治疗性多肽设计可显著提高肿瘤治疗性小分子肽的免疫原性.     

抗SARS冠状病毒S1蛋白N端249至667的单克隆抗体的制备与鉴定

目的 在获得了具有免疫原性的SARS冠状病毒S1蛋白片段的基础上，制备和鉴定特异性抗该段S1蛋白单克隆抗体(mAb)。方法 原核表达含S蛋白受体结合区的SARS冠状病毒S1蛋白片段Slc(N端249-667氨基酸残基)，其免疫原性经SARS病人恢复期血清鉴定后免疫BALB／c小鼠，按常规方法制备单克隆抗体，并采用ELISA间接法、免疫荧光和免疫印迹进行筛选和鉴定。结果 筛选出3株特异性针对SARS冠状病毒S1蛋白N端249-667的mAb杂交瘤细胞株，IgG亚类鉴定1株为IgG1，2株为IgG2a，经免疫荧光鉴定与人冠状病毒株229E和OC43无交叉反应。结论 获得3株抗SARS冠状病毒S蛋白受体结合区特异性单克隆抗体。为建立新的SARS冠状病毒检测方法的和进一步研究S蛋白的功能奠定了基础。     

SARS冠状病毒N蛋白在免疫荧光诊断技术中的应用

目的 应用基因工程技术,在昆虫细胞中表达SARS—CoV N基因,产生无感染性的核蛋白,作为诊断抗原,用于检测血清中SAILS特异性抗体。方法 从一例输入性SARS病人血清中提取病毒RNA,通过RT-PCR方法扩增SAILS—CoV N基因,将它插入昆虫杆状病毒,构建重组昆虫杆状病毒,转染sf 9昆虫细胞,经丙酮固定,制成SARS特异性诊断抗原,建立检测病人血清抗SARS-CoV抗体的免疫荧光试验(immunofluorescence assay,IFA)。结果 此抗原仅与SARS阳性病人血清起反应,而与正常人及其他发热病人血清不起反应。经双盲试验,与空斑减少中和试验(plaque reduction neutralization test,PRNT)阳性的2003年SAILS病人血清的符合率为97．8％;检测2004年广东新发4例SAILS病人进展期血清均阳性,发病后第6天即可检出抗体1：40阳性,至第9天,升至1：640.结论 此法用于检测病人血清中SARS抗体,具有特异性强、敏感性高,试剂制备简单、安全,不需P3实验室,为诊断与研究SAILS提供新的途径和手段。     

SARS冠状病毒S1基因的克隆及其植物表达载体的构建

目的:为获得抗SARS的转基因植物疫苗,进行了SARS S1基因的克隆,植物表达载体构建的研究。方法:根据SARS S蛋白受体结合结构域318-510氨基酸区域,设计合成长579 bp的序列片断(S1基因)。并以之为模板,进行PCR扩增,扩增产物被克隆至pGEM-Teasy载体进行序列测定。然后将S1基因插入植物表达载体pCAMB IA2301的35S启动子和NOS终止子之间,构建植物表达载体pCS1。将重组体转化大肠杆菌E.coliXL1,并对重组体进行了鉴定。结果:酶切鉴定和序列分析显示,克隆的目的基因与设计的片断序列一致;双酶切表明,植物表达载体的构建完全正确。结论:成功地克隆了S1基因和构建了含有S1基因的植物表达载体,为进一步获得抗SARS的转基因植物疫苗打下了基础。     

SARS冠状病毒S蛋白S1片段基因克隆和变异分析

目的:获得SARS冠状病毒S蛋白S1片段基因的克隆.方法:将SARS病毒RNA基因组逆转录合成cDNA,PCR得到阳性条带,将其亚克隆到pUCm-T载体中进行酶切及测序分析,并与Genbank中核苷酸序列进行同源性分析.结果:阳性克隆经酶切鉴定,目的基因片段长度为1905 bp,与Genbank中另外45株的SARS病毒株的S蛋白S1片段基因比较,共有13个位点发生突变,其中有8处为同义突变,5处为错义突变.结论:成功克隆SARS冠状病毒S蛋白S1片段基因,为该基因的表达及功能研究奠定了基础.     

血清学方法检测SARS病毒抗体的比较

目的：比较血清学方法(间接ELISA法和双抗原夹心ELISA法)对SARS患者特异性抗体的检出情况。方法：采用间接法和双抗原夹心法分别检测健康人、发热非SARS患者、不同时期的SARS患者血清中的特异性抗体水平。结果：双抗原夹心法的阳性检出率为73．6％，而间接法的阳性检出率为57．5％，前者对SARS患者各时期特异性抗体的阳性检出率高于间接法，特别是住院第1周的阳性检出率为30％，而间接法对住院第1周的阳性检出率为0％。结论：双抗原夹心法检测SARS患者特异性抗体优于间接法。     

抗SARS冠状病毒S1蛋白N端249至667的单克隆抗体的制备与鉴定

目的在获得了具有免疫原性的SARS冠状病毒S1蛋白片段的基础上,制备和鉴定特异性抗该段S1蛋白单克隆抗体(mAb)。方法原核表达含S蛋白受体结合区的SARS冠状病毒S1蛋白片段S1c(N端249-667氨基酸残基),其免疫原性经SARS病人恢复期血清鉴定后免疫BALB/c小鼠,按常规方法制备单克隆抗体,并采用ELISA间接法、免疫荧光和免疫印迹进行筛选和鉴定。结果筛选出3株特异性针对SARS冠状病毒S1蛋白N端249-667的mAb杂交瘤细胞株,IgG亚类鉴定1株为IgG1,2株为IgG2a,经免疫荧光鉴定与人冠状病毒株229E和OC43无交叉反应。结论获得3株抗SARS冠状病毒S蛋白受体结合区特异性单克隆抗体,为建立新的SARS冠状病毒检测方法的和进一步研究S蛋白的功能奠定了基础。     

严重急性呼吸综合征合并下呼吸道感染对患者康复期的影响

目的通过对严重急性呼吸综合征(SARS)患者出院后血清特异性抗体IgG、胸片和肺功能的跟踪观察,了解SARS急性期合并下呼吸道感染对其的影响。方法定期跟踪77例SARS患者出院后的血清特异性抗体IgG、胸片和肺功能,将其分为两组继发下呼吸道感染组和非继发下呼吸道感染组,比较两组IgG的动态变化和出院后胸片与肺功能恢复的差异性。结果继发感染组的特异性抗体IgG于第2周高于非感染组,于第8周和第10个月感染组低于非感染组。两组数据均于发病后逐渐增高,于第4个月达最高峰,随后逐渐下降,与发病后时间呈高度相关(r=0811),配对t检验显示感染组的IgG明显低于非感染组。病程第6个月,非感染组66例中,42例胸片已恢复正常;感染组19例中,仅1例胸片正常。10例非感染组中,仅1例有轻度弥散功能障碍;7例感染组中,重度限制性通气功能障碍和重度弥散功能障碍1例,中度1例,轻度3例。结论SARS患者急性期合并下呼吸道感染者,康复期血清特异性抗体比非感染组低,肺部病灶吸收速度和肺功能恢复速度较均缓慢。     

SARS相关冠状病毒S1融合蛋白的原核表达与纯化

目的：克隆严重急性呼吸综合征相关冠状病毒(SARS-CoV)S1蛋白编码DNA，构建原核表达质粒pGEX-5T／S1，并诱导表达谷胱甘肽巯基转移酶融合蛋白。方法：采用PCR方法扩增合成S1片段，并克隆入载体中，经双酶切鉴定和测序后把S1序列定向插入原核表达载体pGEX-5T的多克隆位点，转化大肠杆菌K802，将纯化后的融合蛋白用于SARS—CoV抗体阳性血清的检测。结果：GST—S1融合蛋白以可溶形式表达，纯化后的蛋白用ELISA法检测，结果与对照相符。结论：成功诱导原核表达并纬化出融合蛋白S1，为将其应用于SARS—CoV的特异性检测和亚单位疫苗研究奠定了基础。     

SARS血清快速检测纸条的研制与早期鉴别诊断应用的探讨

目的：传染性非典型肺炎也称“严重急性呼吸综合征”（severe acute respiratory syndrome,SARS）血清快速检测试纸条的研制以及在SARS患者、发热及疑似SARS与健康人的早期鉴别诊断应用的探讨。方法：收集了13例SARS确诊患者、135例发热及疑似SARS患者、10例胸膜炎患者、9例肺癌患者、30例肺结核患者和50例健康人的血清（对照组）,应用SDS-PAGE分别对上述患者、健康人血清进行电泳,应用离子交换层析法分离纯化SARS患者血清分子量为61 kDa的特种蛋白,Western blotting鉴定分离纯化的特种蛋白,氨基酸序列测定仪分析特种蛋白的氨基酸序列,酶化学法制备SARS血清快速试纸条。结果：分子量为61 kDa的特种蛋白仅存在于SARS患者血清中,研制的SARS血清快速检测试纸条的敏感性、特异性和准确度分别为92.31%、97.12%、97.00%。结论：在SARS早期鉴别诊断中,SARS血清快速试纸条的成功研制有较高的临床应用价值,有助于SARS的排除,值得临床推广应用。     

88例SARS患者心肌酶谱改变观察

目的 :了解SARS患者病程严重程度与心肌酶谱的变化及其临床意义。方法 :采用IFCC推荐方法检测心肌酶。结果 :发病初期与正常组相比 ,各病情组SARS患者血清各心肌酶活力均显著增高 (P <0 .0 1) ;SARS死亡组患者血清各心肌酶活力均显著高于其余病情组 (P <0 .0 1) ;93.1%的SARS死亡组患者发病初期血清心肌酶活力异常升高 ,而生存组这一比率 33%。发病中期 ,SARS患者血清心肌酶活力均有所降低 ,但死亡组和重症组患者血清HBDH活力未见下降。结论 :心肌是SARS病毒侵袭和损伤的重要组织之一 ,SARS患者心肌酶异常升高与病情密切相关     

增强型荧光实时PCR——高灵敏度SARS冠状病毒检测方法

严重急性呼吸综合征(severe acute respiratory sydrome,SARS)是由SARS冠状病毒(SARS-coronavirus,SARS-CoV)引起的传染性强、病死率高的疾病[1-4].其传播的主要途径是通过近距离呼吸道飞沫传播.     

重症SARS患者临床特点分析

为观察和分析重症严重急性呼吸综合征(severeacuterespiratorysyndrome,SARS)患者的临床特点及其影响因素,对我院收治的149例重症SARS患者进行回顾性分析,分别观察患者的一般情况、临床表现、化验指标、肺部阴影、心电图变化、各种治疗情况及预后。结果149例重症SRAS患者中男女比例相当,年龄多于25～75岁之间,40.3%合并慢性基础病,96.0%患者发热,58.0%外周血白细胞正常或降低,78.7%淋巴细胞减少,60%以上血生化多种酶升高,46.9%白蛋白/球蛋白(A/G)比值降低,37.6%血糖(GLU)升高,53.1%患者有低氧血症,81.8%肺损伤面积大,31.7%有心电图异常,58.7%有并发症。主要治疗包括糖皮质激素、抗生素、抗真菌药、抗病毒药、免疫增强剂、中药、吸氧和呼吸机辅助呼吸及支持疗法。最终痊愈和好转患者130人(占87.2%),死亡19人(12.8%)。提示高龄、合并基础疾病和并发症、肺损伤面积大、低氧血症严重、血生化改变大的患者病情重、病死率高。     

严重急性呼吸综合征病毒基因检测和特异性抗体检测的诊断意义分析

目的探讨严重急性呼吸综合征病毒基因检测和特异性抗体检测的诊断意义和价值。方法采用巢式反转录PCR和ELISA法分别检测健康人、普通发热患者、SARS密切接触医务人员及不同时期SARS患者痰标本中SARS病毒核酸和血清标本中特异性抗体IgG和IgM。结果SARS患者住院1～58d期间,采用巢式RT-PCR检测痰SARS病毒基因,52例患者中33例阳性,阳性率63.5%;而采用间接ELISA检测血清抗SARS病毒抗体,52例患者中30例阳性,阳性率为57.7%。2种方法均阳性的有15例,均阴性的有6例。2种病原学诊断方法检测20例正常人、15例发热非SARS患者和20例SARS密切接触医务人员,结果均为阴性。住院1～13d组(92.9%)巢式RT-PCR基因阳性率明显高于ELISA特异性抗体阳性率(7.1%);住院37～58d组巢式RT-PCR基因阳性率(47.4%)则明显低于ELISA特异性抗体阳性率(94.7%)(P<0.01)。结论痰中SARS病毒基因检测可用于SARS的早期诊断,这对于提前确诊和治疗SARS患者,尽早排除疑似病例具有非常关键和现实的意义。血清特异性抗体检测可用于流行病学调查,但对SARS早期诊断和鉴别没有意义。