聚丙烯酸载体用于青霉素酰化酶的固定

以反应性单体丙烯酸和交联剂二乙烯基苯,以石油醚为致孔剂,通过悬浮聚合制备固定化酶的载体,并用于对青霉素酰化酶的固定。研究了丙烯酸与二乙烯基苯以不同摩尔比对青霉素酰化酶固定活性的影响,以及悬浮聚合时水油相比例的不同所合成的载体对固定化酶性能的影响。当丙烯酸和二乙烯基苯摩尔比为84.2:4时合成的载体固定青霉素酰化酶的酶活为2784U/g,而水油相比为2.75:1（丙烯酸和二乙烯基苯摩洋比为84.2:5）时固定青霉素酰化酶活达到2183U/g。固定青霉素酰化酶可使青霉素转化,得到半合成青霉素的中间体6-氨基青霉烷酸,由此可制成高效、广谱、服用方便的新青霉素。     

功能基化聚丙烯酸甲酯固定化青霉素酰化酶

合成了一系列大孔丙烯酸甲酯－二乙烯苯交联共聚物,经酰肼化、叠氨后固定青霉素酰化酶,考察了反应条件对固定化酶的影响,当交联剂用量为３０％,至孔剂量为１３０％,混合致孔剂（正庚烷与乙酸乙酯）中正庚烷的质量分数为５５％时,所制的载体经活化后得到的固定化酶酶活较高,为９５ｕ／ｇ（湿）,用分批式反应器连续水解青霉素Ｇ钾盐,使用６３批次后仍保留酶活７９．４％。     

青霉素酰化酶研究——Ⅱ.酶的修饰和修饰酶的性质

本文介绍用β-硫酸酯乙砜基苯胺(SESA)活化右旋糖酐T2000以修饰大肠杆菌5852青霉素酰化酶。活化时500mg右旋糖酐需SESA 20mg。制备对氨基苯磺酰乙基葡聚糖(ABSE)-右旋糖酐的反应温度为80℃,与500mg活化右旋糖酐偶联的酰化酶酶量为100u,修饰率达88.3%。用琼脂糖(Sepharose 4B)或交联葡聚糖(Sephadex G150)柱层析分离得高分子量的修饰酶。修饰酶对热和pH的稳定性均优于自由酶,最适温度提高,但最适pH和高浓度青霉素G底物抑制现象没有改变。     

适用于酶包埋的高分子载体材料研究进展

固定化酶作为一种生物催化剂，它能在较为温和的反应条件下，高选择性，高效率地催化某些化学反应，并且不会对环境造成污染，本文对适用于酶包埋的高分子载体材料的制备，优缺点以及制备载体材料的优化方法做了较为详细的叙述，最后对这些高分子载体材料的发展前景进行了预测。     

固定化青霉素酰化酶动力学参数测定

本文介绍一种测定固定化酶催化反应动力学参数的新方法。在纤维间扩散阻力和外扩散阻力存在下,改变底物输送流速,测定纤维状固定化酶的一系列对应反应初速度;用双倒数图和Dixon图分别求各种流速下的表观米氏常数(K_m~(?))和表观产物抑制常数,再用所求得的各种表观动力学参数与对应的底物输入酶柱的线速度倒数的线性关系式,两次图解求得本征动力学参数。采用这一方法求得纤维状固定化青霉素酰化酶催化重排酸水解的本征米氏常数(K_m)、产物7-ADCA和苯乙酸抑制常数的本征值(K_p,K_q)分别为6.9,16.8和94.4mmol/L。     

聚甲基丙烯酸缩水甘油酯固定化青霉素酰化酶性质的研究

应用反相悬浮技术合成了珠状甲基丙烯酸缩水甘油酯 - N ,N′-亚甲基双 (丙烯酰胺 )共聚物 ,并将巨大芽孢杆菌 ( Bacillus megaterium)青霉素酰化酶共价偶联到甲基丙烯酸缩水甘油酯共聚物载体上 ,制成固定化青霉素酰化酶 ,其表观活性为 3 71 U/g(干重 ) ,水解青霉素 G钾盐的最适温度为 47°C,最适 p H为 8.5 ,在 p H4.5～ 9.0 ,温度 40°C以下时酶的活性稳定 ,表观米氏常数 Km为 1 .3 3× 1 0 -2 mol/L ,最大反应速度 vmax为 1 .2 7× 1 0 -5mol/min,固定化酶在 4°C冰箱保存 3 5 d,再水解 w=0 .0 2的青霉素 G钾盐溶液 ,重复使用 3 0次 ,保留酶活性 88.1 %。     

固定化酶载体材料的研究进展

随着经济的发展和科学技术的进步,我国对于新型技术的开发和研究取得了突破性的进展。近几年来,固定化酶技术不断发展,对于固定化酶载体材料的研究也因此变得十分活跃。固定化酶作为一种生物催化剂,可以在相对稳定的反应条件下,对一些化学反应进行高选择性、高效率的催化,并且清洁无污染,不会对环境造成破坏。本文主要对固定化酶载体材料进行了分析和探讨,阐述了其各自的特点和研究进展,并对载体材料的发展前景进行了预测和展望。     

固定化青霉素酰化酶在光敏感可再生两水相体系中催化青霉素G为6-APA

在一种光敏感可再生高聚物(PNBC 300000)与葡聚糖20000(Dextran 20000)形成的两水相体系中进行固定化青霉素酰化酶的相转移催化青霉素G产生6-APA的反应。在这个两水相体系中,当pH为7.8,底物浓度为62 mmol/L,反应温度为20℃,在50 mmol/L KCl存在下,6-APA的分配系数可达8.4。催化动力学显示,达到平衡的时间近6 h,PG(Na)转化率约82.6%。3批半连续反应转化率为60%~70%,较相近条件下的单水相反应得率提高近20%。在两水相中,底物及产物主要分配在上相,固定化酶分配在下相,底物青霉素G进入下相经酶催化产生的6-APA及苯乙酸又转入上相,从而解除了青霉素酰化酶催化反应的底物及产物抑制作用,达到提高产物得率的效果。形成两水相的高聚物通过488 nm的激光照射可实现循环利用,高聚物的光照回收率在95%~98%。     

青霉素G酰化酶调节基因定点诱变的研究

构建了大肠杆菌中青霉素G酰化酶（PAC）的调节基因（pacR）翻译起始密码定点突变株。对突变后PAC的表达调控特征进行了研究，结果表明：突变株的pac基因表达后能正常加工成24ku、65ku的α亚基和β亚基；突变后，虽然PAC表达仍需要苯乙酸诱导，但是，可诱导性提高，形成低组成型表达，无葡萄糖有分解代谢物阻遏效应，因而pacR对PAC表达水平存在着影响，pacR基因是葡萄糖以及它的分解代谢物在分子水平上影响PAC表达的另一作用因素。采用突变株进行发酵生产中，PAC产量较亲株提高3倍，而且可以采用葡萄糖作为碳源，有利于改善PAC的生产。     

PGA在含环氧活性基的多孔高聚物载体上的固定化及修饰

研究了青霉素G酰化酶(PGA)在含环氧活性基的多孔高聚物载体上的固定化及修饰,优化固定化条件为1 mol/L,pH 8.0的磷酸钾缓冲体系,每克载体(湿重)投酶量为500~550 U,30℃下150 r/min固定化36~48 h,得到的固定化酶表观酶活为每克载体(湿重)177 U,表观酶活回收率35%。固定化酶经巯基乙醇修饰后提高了热稳定性。固定化酶水解青霉素G的最适pH为9.0,最适温度为47℃,在pH 4~9,40℃以下稳定。固定化酶的各项性能均优于游离酶。     

PEG修饰青霉素酰化酶及其在两水相生物转化体系中的分配

厅用对甲苯磺酰氯法,用聚乙二醇对青霉素酰化酶进行化学修饰,修饰酶的比活为未修饰酶的75％,稳定性比游离酶有了很大提高。酶在带修饰酶的聚乙二醇与葡聚糖组成的两水相体系中的分配系数为25。     

分子伴侣GroEL对青霉素G酰化酶亚基折叠的影响

采用Tac启动子控制表达质粒，在不同的宿主细胞中表达了青霉素G酰化酶（PAC），检测这些菌株所表达的PAC活性，分析细胞内分子伴侣GroEL含量，PAC翻译后加工为α，β亚基的状况，以及它们之间的关系，结果表明：质粒pKK-SP在不同宿主中表达时，翻译后加工状况有明显差异，单位质量细胞所表达的PAC活性与翻译后加工效率相关，且与细胞内分子伴侣GroEL在菌体总蛋白中含量正相关，同时也阐明了亚基的折叠成为翻译后加工过程的限制步骤，细胞内分子伴侣GroEL有助于PAC亚基的折叠和稳定。     

粪产碱杆菌青霉素酰化酶在枯草芽孢杆菌中的表达优化

在5L发酵罐中进行了表达粪产碱杆菌青霉素G酰化酶的重组枯草杆菌WB600(pMA5)的发酵研究。实验表明，发酵液中的葡萄糖浓度和菌体产酶能力密切相关，维持低葡萄糖水平，可以提高枯草杆菌WB600(pMA5)青霉素G酰化酶的合成能力。采用混合碳源进行发酵，在生长阶段流加葡萄糖，并维持低浓度，在发酵12h菌体浓度达到约13．8g／L时停止流加葡萄糖，使茵体利用发酵液中的可溶性淀粉作为碳源，避免葡萄糖的代谢副产物对茵体产酶能力的抑制，青霉素G酰化酶的表达水平从原来的55u／L提高到582u／L。     

粪产碱杆菌来源的青霉素G酰化酶拆分制备（S)-2-氨基-4-苯基丁氨酸

粪产碱杆菌来源的青霉素G 酰化酶（Alcaligenes faecalis penicillin G acylase ,AfPGA）可以对映选择性地水解N苯乙酰苯基丁氨酸制备（S）-2-氨基-4-苯基丁氨酸。反应体系的pH及温度对酶的对映选择性影响不显著。研究表明,水饱和的乙酸乙酯体系要优于传统的水相体系,该体系显著提高了底物N苯乙酰化苯基丁氨酸的溶解度,并可简化产物的分离过程。当底物的转化率为48.6%时,（S）2氨基4苯基丁氨酸的光学纯度（e.e.值）为99.8%。