肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体联合阿霉素治疗骨肉瘤

目的 探讨肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体（TRAIL）与阿霉素（ADM）联用对骨肉瘤细胞株HOS是否具有协同杀伤作用，并对其机制进行初步研究。方法 MTT法检测细胞的抑制率和存活率，流式细胞术（FCM）检测细胞凋亡率，逆转录-聚合酶链反应（RT—PCR）检测TRAIL受体（receptor，R）的表达水平。结果 单用0．5mg／LTRAIL及1．0、10．0、100．0mg／LADM对HOS8603的抑制率分别为13．18％、5．56％、23．02％和76．72％，联合用药的抑制率分别为42．98％、53．12％、81．91％。0．5mg／LTRAIL和1．0mg／LADM有协同作用．TRAIL和ADM联用时TRAIL R2 mRNA表达较TRAIL单用时明显增强。结论 TRAIL与ADM联用对骨肉瘤细胞有明显的协同作用，其机制可能与ADM上调TRAILR2的表达有关。     

凋亡相关因子Smac、Livin与Caspase-3在骨肉瘤中表达及其意义

目的 观察人骨肉瘤组织中凋亡相关因子Smac、Livin和Cagpage-3表达,及其对骨肉瘤生物学行为影响.方法 采用免疫组织化学技术(SABC法)检测46例骨肉瘤组织中Smac、Livin及Cagpage-3蛋白表达,比较Smac、Livin表达与骨肉瘤主要临床病理参数的关系.结果 Smac、Livin及Cagpage-3基因在骨肉瘤中表达分别为29例(63.0%)、30例(65.2%)、32例(72.4%);Smac、Livin表达率与骨肉瘤组织学分级、WHO分型无关,与转移有关(P<0.05);骨肉瘤中Smac和Livin基因表达正相关(r=0.639,P<0.01),两者与Caspase-3表达无关.结论 凋亡相关因子Smac、Livin和Cagpage-3高表达于骨肉瘤中,可能通过影响细胞凋亡共同参与肿瘤发生发展.     

凋亡相关基因在骨肉瘤细胞中的表达及其临床意义

目的 探讨凋亡相关基因在骨肉瘤细胞中的表达及其临床意义.方法 采用3个公认的骨肉瘤细胞株及1个成骨细胞株,提取总RNA,合成生物素标记的cRNA与Affymetrix(R)GeneChip(R) U133A芯片杂交,筛选差异表达的凋亡相关基因.利用MATLAB软件进行细胞凋亡通路的KEGG分析.结果 以表达差异≥2.0倍为限,在Affymetrix(R)HG-U133A芯片包含的所有基因中,3个骨肉瘤细胞株与成骨细胞株比较,一共筛选出7个差异表达的凋亡相关基因:3个上调基因(IKBKB、IL1R1和FAS),4个下调基因(TP53、PPP3CB、PPP3CC和APAF1).利用MATLAB软件将7个差异表达的凋亡相关基因映射到KEGG的凋亡通路上.结论 骨肉瘤足细胞增殖和细胞凋亡间平衡失调的结果,通过调控细胞凋亡相关基因的表达可以诱导肿瘤细胞凋亡,达到抗肿瘤目的 .     

Survivin在紫杉醇介导MCF-7细胞凋亡中的作用

目的 观察紫杉醇对人乳腺癌细胞株MCF-7的凋亡诱导作用，探讨Survivin在此过程中的作用。方法 将不同浓度的紫杉醇作用于MCF-7细胞，噻唑蓝（MTT）比色法检测紫杉醇作用的时间效应和剂量效应；用光镜、Hoechst33258荧光染色、流式细胞仪观察细胞的凋亡变化；用逆转录一聚合酶链反应（RT-PCR）、Western blot法观察在紫杉醇作用过程中Survivin的mRNA和蛋白水平的变化。结果 细胞生长抑制率呈现一定的时间、剂量依赖性。较高浓度的紫杉醇处理MCF-7细胞48h后可观察到凋亡。而在各种浓度紫杉醇作用过程的早期（6h内），Survivin转录和蛋白表达水平明显—过性升高。结论 紫杉醇可诱导乳腺癌MCF-7细胞凋亡；而紫杉醇作用过程的早期Survivin表达的增加，极可能有利于肿瘤细胞逃避紫杉醇诱导的细胞凋亡，增加肿瘤细胞耐药的机会。     

抗Fas单克隆抗体诱导人胃癌细胞系SGC-7901细胞凋亡的研究

目的 探讨抗Fas单克隆抗体诱导胃癌细胞凋亡的规律及在胃癌治疗中的意义。方法 应用细胞形态观察、琼脂糖凝胶电泳、流式细胞光度术检测抗Fas单克隆抗体对胃癌细胞SGC-7901增殖周期的影响以及对细胞杀伤作用的方式，并检测了SGC-7901细胞表面bcb2的表达情况。结果 抗Fas单克隆抗体有阻滞细胞周期、通过诱发凋亡而抑制肿瘤细胞生长的作用。经抗Fas单克隆抗体处理后，SGC-7901细胞表面bcl-2蛋白表达无明显变化。结论 抗Fas单克隆抗体可以诱导胃癌细胞系SGC-7901细胞凋亡，抗Fas单克隆抗体诱导胃癌细胞凋亡与bcl-2表达无关。     

紫杉醇抑制大鼠原位肝移植急性排斥反应的机制

目的 探讨紫杉醇抑制大鼠原位肝移植急性排斥反应的机制。方法 建立大鼠原位肝移植模型（Lewis-BN），将大鼠分为生理盐水对照组（A组），紫杉醇低剂量干预组（B组），高剂量干预组（C组）检测病理组织学改变，细胞免疫学指标。结果 紫杉醇明显延长术后生存（A组与B组，Log Rank=9．06，B组与C组，Log Rank=7．81，P均〈0．05），减轻肝脏病理组织学改变，降低外周血单核细胞特异的Th前体细胞的比率（t=8．9和11．8，P均〈0．05），促进脾CI）4^＋的淋巴细胞凋亡（T0=27．49和93．4，P均〈0．05），同时使Th1／Th2细胞平衡向Th2移动（t=4．93和5．92，P值均〈0．05）。结论 紫杉醇能够有效减轻肝移植大鼠的急性排斥反应，其机制可能与诱导活化的CD4^＋Th细胞凋亡，从而降低受体对供体细胞的反应，并促使Th1／Th2细胞平衡向Th2移动有关。     

单启动子双表达载体pIRES-p14ARF-p53的构建及其对骨肉瘤细胞增殖的抑制作用

目的 构建双质粒表达载体pIRES-p14ARF-p53，并研究其对骨肉瘤细胞增殖生长的抑制作用。方法 利用基因工程技术，将从培养的正常人肝细胞系L02细胞中扩增出的p14cDNA（0．5kb）亚克隆至pIRES载体中，通过聚合酶链反应（PCR）、限制性内切酶酶切鉴定重组质粒pIRES-p14ARF-p53。通过脂质体介导转染入骨肉瘤MG-63细胞中，并筛选出阳性克隆，流式细胞仪测定瘤细胞DNA含量和细胞周期；逆转录（RT）-PCR和Western bolt对稳定转染后的瘤细胞p53、p14ARF蛋白的表达进行定性和半定量检测。噻唑蓝（MTT）比色法与细胞生长曲线观察细胞增殖情况。结果 成功构建出双质粒表达载体pIRES-p14ARF-p53。转染后瘤细胞形态由转染前密集排列的多角形、星形转变为排列稀疏的长梭形细胞，瘤细胞生长速度较前缓慢，群体倍增时间比转染前增加了2．3倍，且易出现脱壁并见散在瘤细胞凋亡；流式细胞仪检测发现转染后的瘤细胞多停滞于G1期；RT-PCR与Western blot检测证实p14ARF、p53基因在靶细胞mRNA和蛋白水平分别有独立表达，转染MG-63后24、48、72、96h瘤细胞生长抑制率分别为：33．43％、69．37％、66，19％、75．26％，差异有统计学意义（P〈0．01）。结论 野生型p53和p14ARF协同抑制骨肉瘤细胞的增殖促进瘤细胞的凋亡，为进一步研究p14ARF与p53在骨肉瘤基因治疗的体内实验奠定了基础。     

白花丹素体外诱导前列腺癌PC-3细胞凋亡的研究

目的 探讨白花丹素对前列腺癌PC-3细胞增殖、凋亡的作用及其和RelA(p65)表达的关系.方法 应用不同浓度梯度的白花丹素(1、5、1O、15、20 μmol/L)共同培养PC-3细胞24、48 h,噻唑蓝(MTT)比色法检测PC-3细胞增殖活力,双染流式细胞仪检测凋亡细胞,透射电镜观察超微病理变化,计算药物半数抑制浓度(IC50).逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)法扩增检测RelA(p65).结果 24 h组在10～20 μmol/L,48 h组在5～20 μmol/L时均出现生长抑制,IC50分别为12.88、3.71 μmol/L.双染流式细胞仪检测显示PC-3随作用浓度的上升凋亡率增加并呈现浓度依赖关系.透射电镜观察作用后PC-3呈现典型凋亡表现.RT-PCR结果提示其细胞凋亡率同Rel A(p65)表达呈负相关.结论 白花丹素体外实验可能通过抑制Rel A(p65)表达诱导PC-3的凋亡.     

百里醌对人骨肉瘤SaOS-2细胞生长的抑制作用

目的 探讨百里醌对体外人骨肉瘤SaOS-2细胞生长的影响及其机制.方法 百里醌作用人骨肉瘤SaOS-2细胞24h后,细胞计数CCK-8法检测细胞增殖;流式细胞仪检测细胞凋亡;DAPI染色后荧光显微镜下观察细胞形态学变化;Western blot检测SaOS-2细胞中Caspase-3、X连锁凋亡抑制蛋白(XIAP)和Smac的表达.结果 不同浓度(20、40、80μmol/L)百里醌作用人骨肉瘤SaOS-2细胞24h后,细胞存活率分别为(75.5±4.2)%、(62.1±6.7)%和(52.5±4.9)%;细胞早期凋亡率分别为(8.1±0.7)%、(13.2±1.1)%和(20.2±1.7)%;百里醌作用后,SaOS-2细胞出现典型凋亡的形态学改变;百里醌可明显上调Caspase-3和Smac在SaOS-2细胞中的表达,而显著抑制XIAP的表达.结论 百里醌具有抑制体外人骨肉瘤SaOS-2细胞生长和促进细胞凋亡的作用,可能是通过上调人骨肉瘤SaOS-2细胞中Caspase-3和Smac的表达和下调XIAP的表达而实现.

Abstract：

Objective To investigate the inhibitory effect of thymoquinone on the growth of human osteosarcoma cell line SaOS-2 in vitro.Methods After human osteosarcoma SaOS-2 cells were treated with different concentrations of thymoquinone, the proliferation was measured by Cell Counting Kit-8 (CCK-8) assay. The flowcytometry (FCM) was used to determine apoptosis of SaOS-2 cells. The morphological changes of SaOS-2 cells were observed under the fluorescence microscopy after DAPI staining. Western blotting was used to detect the protein expression of Caspase-3, X-linked inhibitor of apoptosis protein (XIAP) and Smac.Results Thymoquinone obviously suppressed proliferation of SaOS-2 cells in a dose-dependent manner, and the apoptosis rate was (8.1±0.7)%, (13.2±1.1)% and (20.2±1.7)% respectively when the concentrations of thymoquinone exposed were 20, 40 and 80 μmol/L. After treatment with thymoquinone, the expression of Caspase-3 and Smac was up-regulated in SaOS-2 cells, and thymoquinone treatment significantly decreased the XIAP levels in SaOS-2 cells.Conclusion Thymoquinone has the anti-tumor effect on the human osteosarcoma SaOS-2 cells in vitroprobably by up-regulating the expression of Caspase-3 and Smac and down-regulating the expression of XIAP.     

反义MDM2联合紫杉醇对胶质瘤细胞U251的作用及其机制

目的探讨MDM2反义寡核苷酸联合紫杉醇对U251人胶质瘤细胞株的作用。方法以Lipofectamine介导的MDM2反义寡核苷酸转染U251人胶质瘤细胞株，免疫组织化学法检测胶质瘤细胞株MDM2蛋白的改变，噻唑蓝（MTT）检测细胞增殖，流式细胞仪检测凋亡，Western blot检测野型生p53（wild typ p53，wtp53）的表达，构建荷胶质瘤裸鼠模型，采用瘤内注射和腹腔给药方式，以MDM2反义寡核苷酸联合紫杉醇治疗，研究其联合抗肿瘤作用。结果脂质体介导反义MDM2 ODN转染U251人胶质瘤细胞株后，MDM2表达减少，与紫杉醇联合使用可增加细胞的凋亡率，野型生p53的表达量增加，裸鼠动物试验联合治疗组瘤重显著小于单独用药组及对照组。结论MDM2反义寡核苷酸可显著降低MDM2在U25I中的表达，引起细胞凋亡，MDM2反义寡核苷酸与紫杉醇联合作用U251人胶质瘤细胞株具有协同作用。     

华蟾酥毒基诱导骨肉瘤细胞凋亡的体外实验研究

 目的 研究华蟾酥毒基（cinobufagin）对多种骨肉瘤细胞系的增殖抑制和诱导凋亡作用,并探讨其相关机制。方法 不同浓度的华蟾素毒基分别处理骨肉瘤细胞系U2OS、MG63和SaO2后,四甲基偶氮唑蓝（MTT）法观察不同骨肉瘤细胞系的增殖活性,流式细胞仪检测细胞周期的变化,细胞核荧光染色及Annexin V/ PI染色检测细胞凋亡,Western blot检测IAPs和Bcl-2家族凋亡相关蛋白凋亡相关蛋白Bax、cleaved-PARP、xIAP、cIAP-1、survivin及p65的表达。结果 MTT检测显示,华蟾酥毒基可明显抑制骨肉瘤细胞U2OS、MG63和SaO2的增殖,其抑制细胞增殖的作用呈剂量和时间依赖性,其对U2OS、MG63和 SaO2细胞的48 h IC50值分别为（104.83±16.96） nmol/L、（47.07±7.5） nmol/L和（136.72±10.08） nmol/L。100 nmol/L 华蟾酥毒基处理骨肉瘤细胞12 h后,流式细胞仪检测可见骨肉瘤U2OS、MG63和 SaO2的G₀/G₁期细胞比例下降,G2/M 期细胞比例增加,表明华蟾素毒基主要通过将细胞阻滞在G₂/M 期,以抑制骨肉瘤细胞的增殖。进一步Hoechst 33258细胞核染色发现,华蟾素毒基可诱导骨肉瘤细胞产生典型凋亡小体,Annexin V/ PI检测100 nmol/L 华蟾酥毒基作用48 h后,U2OS、MG63和 SaO2细胞凋亡率分别为33.6%±6.4%、36.4%±7.8% 及 29.3%±5.1%。表明华蟾酥毒基的抗骨肉瘤效果是通过诱导骨肉瘤细胞凋亡来实现。在探讨其诱导骨肉瘤细胞凋亡的相关机制中,通过Western blot检测发现其诱导凋亡的作用机制是通过上调IAPs和Bcl-2家族凋亡相关蛋白Bax、cleaved-PARP,下调xIAP、cIAP-1、survivin及p65蛋白来实现。结论 华蟾酥毒基可明显抑制骨肉瘤细胞株U2OS、MG63和 SaO2细胞增殖,阻滞细胞在G₂/M期,并诱导其凋亡,其诱导凋亡的作用机制为调节IAPs和Bcl-2凋亡相关家族蛋白的活性。     

人可溶性TRAIL蛋白诱导骨肉瘤细胞凋亡的实验研究

目的 初步观察并探讨人重组可溶性TRAIL蛋白诱导MG-63骨肉瘤细胞凋亡的作用，并通过实验初步探讨TRAIL对肿瘤细胞的选择性杀伤作用。方法 MTT法测定TRAIL对MG-63细胞、MRC-5人肺二倍体细胞及L-02人肝细胞的抑制率；电镜观察与FACS分析TRAIL蛋白诱导MG-63骨肉瘤细胞凋亡的作用；用RT-PCR检测TRAIL受体在MG-63骨肉瘤细胞、MRC-5人肺二倍体细胞及L-02人肝细胞上的表达，并初步分析TRAIL诱导MG-63骨肉瘤细胞凋亡的机制。结果 MTT还原试验表明：作用24h后500ng/ml TRAIL的抑制率为10.1％，1μg/ml TRAIL的抑制率为24.3％，2μg/ml TRAIL的抑制率为50.6％，5μg／ml TRAIL的抑制率为95％以上，其半数抑制浓度为2μg/ml。而TRAIL对MRC-5人肺二倍体细胞株及L-02人肝细胞株无明显作用。细胞形态学观察显示：MG-63骨肉瘤细胞经TRAIL作用3～8h后即有部分细胞开始变小、变圆，24h后大量细胞变圆、脱落，漂浮于培养液中。透射电镜可观察到核固缩，染色质浓聚于核膜形成新月状小体。流式细胞仪检测显示2μg／ml的TRAIL处理MG-63骨肉瘤细胞6h，即可在二倍体峰前出现较明显的凋亡峰。结论 人可溶性TRAIL蛋白可以迅速地选择性杀伤MG-63骨肉瘤细胞，具有潜在的临床应用价值。     

STIM1和Orail在骨肉瘤细胞HOS增殖和凋亡中的作用

目的：探讨钙库操纵的钙内流（ SOCE）组成蛋白STIM1和Orai1蛋白在骨肉瘤细胞系HOS增殖和凋亡中的作用。方法用shRNA干扰技术抑制STIM1和Orai1蛋白的表达。 Western blot测定STIM1和Orai1的蛋白表达;激光共聚焦检测细胞Ca2＋内流变化;噻唑蓝（ MTT）比色法检测HOS细胞的增殖能力;流式细胞技术检测HOS 细胞的凋亡变化。结果与空白对照组和转染negative-shRNA的对照组相比,转染48 h后STIM1-shRNA 组STIM1蛋白的表达均明显降低（ P＜0.01）,Orai1-shRNA组Orai1蛋白的表达也明显降低。抑制STIM1和Orai1蛋白后,细胞Ca2＋内流减少。转染24、48和72 h后,STIM1-shRNA组及Orai1-shRNA组HOS细胞的增殖能力明显下降（ P＜0.01）。流式细胞检测显示,与control组和negative-shRNA组相比,转染48 h后细胞的周期受到明显抑制,而凋亡水平明显升高（P＜0.01）。结论 STIM1和Orai1在骨肉瘤细胞HOS增殖中有重要作用,抑制STIM1和Orai1蛋白表达可以抑制HOS细胞增殖、促进凋亡。     

硫化砷对骨肉瘤细胞生长和凋亡的影响

目的 研究硫化砷对骨肉瘤细胞生长和凋亡的影响，并探讨其可能的机制。方法 应用噻唑蓝（MTT）比色法检测细胞生长抑制率、倒置显微镜观察细胞形态、AnnexinV法检测细胞凋亡、逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）法检测bcl-2及bax基因的表达，观察硫化砷对骨肉瘤细胞株MG-63诱导凋亡的作用。结果 硫化砷可明显抑制MG-63细胞的增殖，1．0mg／L浓度的硫化砷作用24h后，MG-63细胞的抑制率可达26．43％。倒置显微镜观察被硫化砷抑制的MG-63细胞呈典型的凋亡改变．流式细胞仪检测凋亡率与硫化砷处理时间、处理浓度呈正相关。在硫化砷的作用下，MG-63细胞的bcl-2表达下调，而bax表达无明显改变．结论 硫化砷可有效地诱导骨肉瘤细胞凋亡，bcl-2表达下调是诱导细胞凋亡的重要机制。     

塞来昔布协同顺铂P13K/Akt途径诱导骨肉瘤MG-63细胞凋亡的实验研究

目的 探讨环氧化酶-2(COX-2)选择性抑制剂塞来昔布对人骨肉瘤MG-63细胞增殖和凋亡的影响及作用机制.方法 塞来昔布(50 μmol/L或100 μmol/L)和(或)顺铂(10 μg/ml)作用骨肉瘤MG-63细胞48 h后,MTT法测定细胞增殖的抑制率,电子显微镜和流式细胞仪检测细胞凋亡,RT-PCR法检测基因水平COX-2表达变化,Western blot检测COX-2及凋亡相关蛋白表达变化.P13K抑制剂Wortmannin作用MG-63细胞48 h,检测蛋白表达变化.结果 塞来昔布导致MG-63细胞阻滞在G1期,通过激活半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶(caspase)-9的内源性凋亡途径诱导细胞凋亡;顺铂单药作用后骨肉瘤MG-63细胞凋亡率为5.93%,而联合应用塞来昔布50μmol/L或100 μmol/L后,凋亡率分别为6.66%和37.15%,与顺铂联合具有明显的协同作用;COX-2蛋白表达未降低.塞来昔布联合顺铂明显降低P13K/Akt、survivin、Bcl-2的表达,检测到caspase-9、caspase-3的激活和PARP裂解片段.Wortmannin作用MG-63细胞48 h,检测到pAkt(Thr308)、Bcl-2、survivin表达下调.结论 塞来昔布可通过非COX-2途径诱导骨肉瘤MG-63细胞凋亡,与P13K/Akt、survivin、Bcl-2蛋白相关,并且PI3K/Akt途径在survivin、Bcl-2表达调控中发挥重要作用.这可能是塞来昔布药物干预的中心环节.     

NS-398对骨肉瘤细胞的作用及其对Survivin表达的影响

目的：观察选择性环氧合酶-2抑制剂NS-398对人骨肉瘤细胞系MG-63的凋亡的影响及其对survivin基因表达的影响。方法：体外培养骨肉瘤细胞系MG-63，应用MTT法研究不同浓度NS-398对骨肉瘤细胞系MG-63的凋亡诱导作用，流式细胞仪检测细胞周期的改变及凋亡率的变化，RT-PCR法分析NS-398对骨肉瘤细胞系MG-63中survivin基因表达的影响。结果：NS-398可诱导骨肉瘤细胞系MG-63发生凋亡，并具有剂量依赖性，在NS-398浓度为200μmol／L时，对细胞生长有明显的抑制作用。流式细胞仪检测显示NS-398引起MG-63细胞凋亡率增加。RT-PCR分析显示经NS-398作用后的骨肉瘤细胞系MG-63表达survivin较用药前明显下降。结论：NS-398对骨肉瘤细胞系MG-63有杀伤作用，其作用可能通过抑制survivin的表达，促进肿瘤细胞的凋亡而实现。     

人骨肉瘤组织中Survivin mRNA的表达及与细胞凋亡的关系

目的　观察人骨肉瘤中Survivin基因表达 ,探讨其与细胞凋亡关系及对骨肉瘤生物学行为的影响。方法　采用原位杂交、免疫组织化学技术、DNA原位末端标记技术对 3 8例骨肉瘤、15例骨软骨瘤、5例正常骨组织SurvivinmRNA及骨肉瘤中Caspase 3蛋白和细胞凋亡进行检测。结果　较正常骨 (0 % )和骨软骨瘤 (6.7% ) ,SurvivinmRNA显著表达于骨肉瘤 (65 .8% )中 ,并与骨肉瘤WHO分型和转移有关 (P <0 .0 5 ) ;骨肉瘤中Caspase 3蛋白与凋亡细胞阳性率分别为71.1%和 63 .2 % ,凋亡指数 (AI)均值为 8.3 % ;Survivin阴性组AI显著高于阳性组 (P <0 .0 1) ;Sur vivin与Caspase 3表达不相关。 结论　Survivin选择性表达于骨肉瘤中 ,通过抑制细胞凋亡 ,参与骨肉瘤发生发展 ,其可能是判断骨肉瘤预后的重要参考指标。