骨髓间充质干细胞软骨分化生物学的影响因素

间充质干细胞(MSCs)因具有在适宜的体内或体外条件下分化形成软骨组织的潜能，且易于从骨髓中分离和体外大量扩增纯化，便于自体移植，故被认为是软骨组织工程最有希望的种子细胞来源之一。然而，MSCs在体外培养条件下软骨表型的分化却是一个受多种因素限制的复杂过程。目前其调控机制仍不是很清楚。已知局部环境是影响MSCs向软骨细胞转化的重要因素，低氧张力、高细胞密度、局部应     

骨髓间质干细胞体外定向诱导分化为软骨细胞的实验研究

目的：探讨分离骨髓间充质干细胞（MSCs）并诱导其向软骨细胞转化的体外培养方法,为软骨组织工程的种子细胞来源提供实验依据。方法：抽取兔髂骨骨髓液,经梯度离心法和贴壁法进行体外培养,贴壁细胞传代,取第3代细胞在培养基中添加软骨分化诱导剂[含转化生长因子（TGF-β2）10ng／ml、地塞米松10^7mol／L、维生素C50μmol／L,经7、14、21d诱导培养后,倒置显微镜观察细胞形态,免疫组织化学染色检测软骨特异性Ⅱ型胶原表达。将诱导细胞与软骨支架材料-聚磷酸钙纤维／左旋聚乳酸（CPP／PLLA）复合,1周后终止培养,扫描电镜观察细胞黏附情况。结果：诱导后细胞体外扩增能力显著降低,细胞形态由成纤维样梭形向多角形、多边形或类圆形转变,诱导21d后细胞形态变化最为显著,Ⅱ型胶原免疫组化染色深而均匀。诱导后的MSCs可在支架材料内良好黏附生长。结论：体外培养的MSCs可定向诱导分化为软骨细胞,分泌软骨细胞特异性基质,可用作软骨组织工程的种子细胞。     

骨髓间质干细胞体外定向诱导分化为软骨细胞的实验研究

目的:探讨分离骨髓间充质干细胞(MSCs)并诱导其向软骨细胞转化的体外培养方法,为软骨组织工程的种子细胞来源提供实验依据.方法:抽取兔髂骨骨髓液,经梯度离心法和贴壁法进行体外培养,贴壁细胞传代,取第3代细胞在培养基中添加软骨分化诱导剂[转化生长因子(TGF-β2)10ng/ml、地塞米松10-7mol/L、维生素C 50μmol/L],经7、14、21 d诱导培养后,倒置显微镜观察细胞形态,免疫组织化学染色检测软骨特异性Ⅱ型胶原表达.将诱导细胞与软骨支架材料--聚磷酸钙纤维/左旋聚乳酸(CPP/PLLA)复合,1周后终止培养,扫描电镜观察细胞黏附情况.结果:诱导后细胞体外扩增能力显著降低,细胞形态由成纤维样梭形向多角形、多边形或类圆形转变,诱导21 d后细胞形态变化最为显著,Ⅱ型胶原免疫组化染色深而均匀.诱导后的MSCs可在支架材料内良好黏附生长.结论:体外培养的MSCs可定向诱导分化为软骨细胞,分泌软骨细胞特异性基质,可用作软骨组织工程的种子细胞.     

体外构建组织工程软骨种子细胞的研究进展

体外构建组织工程软骨的首要问题是种子细胞的来源,目前获得种子细胞的可能途径主要有以下几种:(1)培养扩增自体获得的软骨细胞;(2)同种异体软骨细胞;(3)骨髓基质干细胞及其他组织来源干细胞;(4)胚胎干细胞;(5)基因修饰细胞。本文就当前体外构建组织工程软骨的种子细胞研究进展综述如下:1自体软骨细胞自体软骨细胞可由关节软骨、骺板软骨、软骨膜、肋软骨和耳软骨等分离培养获得。软骨细胞是构成透明关节软骨的唯一细胞成分,是终末分化细胞,具有高度特异性。软骨细胞的主要功能是维持软骨基质成分的稳定。新分离的关节软骨细胞在最初的数天…     

间充质干细胞的研究进展及其在软骨组织工程中的应用

组织工程研究中,种子细胞、生长因子以及组织工程支架是三大要素.理想的种子细胞应具备:取材容易,对机体损伤小,体外培养时增殖力强、易稳定表达软骨细胞表型,植入体内后能耐受机体免疫,且无致瘤性等特点.间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)不仅具有以上优点,还具有自我复制、多向分化、抗炎作用和营养作用等特性.因此,MSCs是软骨组织工程中理想的种子细胞.研究MSCs在软骨组织工程中的应用有着重要的意义.     

干细胞作为软骨组织工程种子细胞的研究进展

种子细胞是目前软骨组织工程研究的重点之一.目前,报道的软骨组织工程种子细胞主要包括:自体软骨细胞、异体软骨细胞、基因修饰的永生化软骨细胞及各种来源的干细胞.自体软骨细胞来源有限,且体外培养传代会发生"去分化 (dedifferentiation)"现象[1],丧失增殖和分泌基质的能力,这严重限制了其作为种子细胞的应用;     

微RNA调控间充质干细胞软骨分化的机制研究进展

间充质干细胞（mesenchymal stem cells, MSCs）是软骨组织工程的一种理想种子细胞,体外条件下诱导MSCs软骨分化,将直接影响组织工程修复软骨的成败。微RNA（microRNA, miRNA）是一类由内源基因编码、长度为22个核苷酸左右的单链RNA,在细胞增殖、分化、凋亡以及疾病发生过程中发挥重要的调控功能,其在转录后水平调控与软骨分化相关转录因子及信号通路靶基因的表达,以此调控MSCs软骨分化。本文就miRNA调控MSCs软骨分化的机制研究进展作一综述。     

成人骨髓基质干细胞体外定向诱导分化为软骨细胞的实验研究

目的 建立临床成人骨髓基质干细胞(MSCs)体外培养、定向诱导分化为软骨细胞的途径。方法抽取成人骨髓，Percol密度梯度离心法进行体外培养，贴壁细胞传代，取第3代细胞在培养基中添加软骨分化诱导剂地塞米松、维生素C和不同剂量转化生长因子-β(TGF-β)，培养16d后,在倒置显微镜观察细胞形态，甲苯胺蓝染色蛋白多糖，逆转录一聚合酶链反应(RT-PCR)、免疫细胞化学(SABC法)检测Ⅱ型胶原表达，诱导后MSCs与新型材料聚乳酸和羟基乙醇共聚物(PL-GA)复合。结果 Percoll密度梯度离心法培养可获得均一的。MSCs；5、10ng TGF-β诱导分化的MSCs生长迅速。呈典型的软骨细胞形态，甲苯胺蓝染色阳性，Ⅱ型胶原表达阳性，MSCs对材料PL-GA黏附力强。结论 可以从成人骨髓中培养出MSCs，并可定向诱导分化为软骨细胞，5～10ng TGF-β为最佳诱导剂量，成人MSCs可用作临床自体软骨组织工程种子细胞。     

鹿茸多肽对兔骨髓间质干细胞体外软骨表型诱导分化的影响

目的:通过对体外培养的兔骨髓间质干细胞(MSCs)在特定培养液作用下向软骨细胞表型分化的研究,探讨鹿茸多肽对其软骨分化的影响。方法:将第3代兔MSCs随机分为A组(空白对照组)、B组(诱导组)、C组(鹿茸多肽组),并取兔的关节软骨作为D组(关节软骨组)。A、B、C 3组分别采用普通培养液、诱导培养液、含10 ug/m l鹿茸多肽的诱导培养液于离心管内进行培养,分别于1、2、3周后取材,通过组织学、生物化学和RT-PCR技术,对离心管内构建的软骨组织进行形态学和细胞功能状态的观察。结果:A组培养2周后,细胞团块逐渐崩解,无法进行HE染色。B、C组细胞团块除有轻度收缩外,呈白色半透明状,HE染色发现细胞为圆形或卵圆形,表层细胞密度大。B、C组糖胺多糖(GAG)含量及Ⅱ型胶原mRNA表达随培养时间延长而增多,并以C组为著;各时间点B、C组与A组相比明显增多,且差异有显著性统计学意义(P<0.01),C组与B组相比较多,差异有显著性统计学意义(P<0.01),C组与D组相比较少,差异有显著性统计学意义(P<0.01)。结论:MSCs在特定培养条件下能向软骨细胞表型分化,且鹿茸多肽对其定向软骨分化有明显促进作用。虽然在体外可以构建出软骨组织,但其与关节软骨质量相比仍有很大差距。     

犬骨髓基质干细胞体外定向分化为软骨细胞

目的 体外诱导犬骨髓基质干细胞(BMSCs)定向分化为软骨细胞，探讨体外诱导成软骨的方法和条件。方法 自犬肋骨取骨髓2～3ml，体外行原代和传代培养扩增，顺序加入碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)和转化生长因子β1(TGF-β1)，以培养瓶内较高细胞浓度培养，诱导BMSCs分化为软骨细胞。甲苯胺蓝、阿新蓝染色检测软骨基质的分泌，免疫组织化学染色检测软骨特异性Ⅱ型胶原表达。结果 诱导的软骨样细胞甲苯氨蓝异染性、阿新蓝染色阳性；Ⅱ型胶原免疫组织化学检测阳性。结论 应用bFGF和TGF-β1体外可以诱导犬BMSCs分化为软骨细胞，诱导的软骨细胞可作为软骨组织工程较理想的种子细胞。     

聚磷酸钙纤维／左旋聚乳酸软骨支架复合自体骨髓间充质干细胞构建组织工程化人工关节软骨

目的：应用组织工程学技术,体外初步构建组织工程化人工关节软骨。方法：制备三维多孔软骨支架材料CPP／PLLA,体外诱导兔MSCs向软骨细胞表型分化,免疫组织化学染色检测软骨特异性Ⅱ型胶原表达,将诱导细胞与软骨支架材料CPP／PLLA复合,体外培养构建人工关节软骨,1周后终止培养,扫描电镜观察组织工程化人工软骨的微观结构;同时将构建人工软骨移植于兔大腿皮下,3周后处死动物,甲苯胺蓝染色观察。结果：扫描电镜观察可见该复合材料CPP／PLLA为高孔隙率的网状、连通、微孔结构,微孔分布均匀,孔径大小为300～400μm之间;兔MSCs经体外软骨表型定向诱导后,Ⅱ型胶原免疫组化染色阳性。诱导后的MSCs可在支架材料内良好贴附生长,细胞被分泌的胶原基质包裹;从体内获取的培养物组织切片观察可见大量的软骨细胞生成,甲苯胺蓝染色阳性。结论：经软骨起源诱导后的MSCs与CPP／PLLA复合培养可以构建自体软骨移植的替代物,为应用软骨组织工程方法修复关节软骨缺损和功能重建提供一种新材料,具有较大的潜在应用价值。     

藻酸钠微球三维立体培养恢复去分化软骨细胞表型的实验研究

[目的] 研究在连续体外单层培养条件下不同接种密度对大鼠关节软骨细胞分化状态的影响,并探讨藻酸钠微球三维立体培养恢复去分化关节软骨细胞表型的调节机制.[方法]以正常密度(3×10<,4>/cm<'2>)或低密度(3×10<'2>/cm<'2>)分别连续体外单层传代培养大鼠膝关节软骨细胞使其去分化,RT-PCR检测Ⅰ、Ⅱ型胶原和聚集蛋白聚糖mRNA的表达以确定其分化状态.取正常密度培养时的去分化软骨细胞,藻酸钠微球包被4周以恢复其表型,在该立体培养过程中将特异的SIRT1抑制剂-EX-527加入到培养基中抑制其表达,甲苯胺兰染色微球中软骨细胞分泌的细胞外基质,Western blot检测各种条件下SIRT1和Sox-9的表达.[结果] 当以正常密度连续体外单层培养时,软骨细胞在第4代发生去分化,低密度时于第1代即明显去分化,此时SIRT1和Sox9表达明显降低.藻酸钠微球三维立体培养能显著地增强去分化软骨细胞中Ⅱ型胶原、聚集蛋白聚镛mRNA以及SIRT1、Sox9蛋白的表达,同时降低Ⅰ型胶原mRNA的表达.EX-527不仅限制藻酸钠微球中的软骨细胞周围细胞外基质的大量生成而且还抑制了SIRT1和Sox9的表达.[结论]关节软骨细胞连续体外单层培养的去分化与细胞接种密度有关,低密度培养加速去分化过程.藻酸钠微球三维立体培养恢复去分化关节软骨细胞表型的作用可能是通过细胞-细胞、细胞-细胞外基质间的相互作用,从而激活SIRT1的表达,继而增强Sox9的转录活性来实现.     

软骨细胞三维培养扩增与液态凝胶复合构建软骨的实验研究

目的通过在微载体上进行三维培养扩增软骨细胞,并结合液态胶原构建组织工程软骨。方法比较兔软骨细胞在单层培养与微载体上进行三维培养扩增软骨细胞的保持表型能力。幼兔软骨细胞分别进行单层和微载体三维培养扩增,并进行体外球型培养评价软骨细胞保持表型能力和糖胺多糖的定量生化分析。三维培养扩增软骨细胞与液态鼠尾胶原复合构建组织工程软骨,分别以低细胞密度（2×10^6个／mL）和高细胞密度（1．2×10^7个／mL）两种细胞密度接种,培养14d后通过组织学特种染色鉴定构建组织特性。结果微载体培养的软骨细胞可以保持良好活力和保持表型能力,与单层培养体系相比较,细胞糖胺多糖的定量生化分析的差异具有统计学意义（P〈0．05）。三维培养扩增软骨细胞复合液态鼠尾胶原构建组织工程软骨,体外14d后发现高细胞密度接种时可形成形态稳定的软骨组织。组织学染色显示为透明软骨样组织。结论在微载体上进行三维培养扩增软骨细胞可以加强细胞保持表型能力。软骨细胞与液态胶原合成后,以高细胞密度（1．2×10^7个／mL）可以在体外形成形态稳定的组织工程软骨。     

软骨组织工程种子细胞影响因素的研究进展

组织工作学是利用工程学和生命科学的原理和方法发展生物机体的组织、器官或功能替代物的新兴学科,软骨组织工程是其一个分支基本步骤为：①种子细胞的获得：从软骨组织中分离或从胚胎上细胞、骨髓基质干细胞分离分化出软骨细胞,并在体外进行培养。②将体外培养的软骨细胞种植在天然或人工合成生物载体材料上,并在生物载体材料上大量增殖、     

骨髓经羟乙基淀粉(HES)处理后分离和培养MSCs的初步探讨

种子细胞、支架材料和生长因子是组织工程的三大要素,而寻找合适的种子细胞是成功的重要因素[1]。骨髓间充质干细胞(Mesenchymal Stem Cells,MSCs),因其具有多向分化潜能,如形成骨、软骨、肌组织、皮肤等,成为最具代表性的种子细胞[2,3]。目前,国内外已分离培养出人,小鼠,大鼠,兔等的骨髓MSCs,并诱导分化出多种组织[4],但由于它在骨髓内含量极少,只占0.01%～0.001%,而组织工程需要短期内有大量的种子细胞再生组织,故需进行体外培养、分化和扩增[5]。本实验对骨髓MSCs的两种分离方法进行比较,以期获得更好的方法。1材料与方法1.1材料动…     

聚磷酸钙纤维和左旋聚乳酸软骨支架复合自体骨髓间充质干细胞构建组织工程化人工关节软骨

目的应用组织工程学技术，体外初步构建组织工程化人工关节软骨。方法制备三维多孔软骨支架材料CPP／PLLA，体外诱导兔MSCs向软骨细胞表型分化，免疫组织化学染色检测软骨特异性Ⅱ型胶原表达，将诱导细胞与软骨支架材料CPP／PLLA复合，体外培养构建人工关节软骨，1周后终止培养，扫描电镜观察组织工程化人工软骨的微观结构；同时将构建人工软骨移植于兔大腿皮下，3周后处死动物，甲苯胺蓝染色观察。结果扫描电镜观察可见该复合材料CPP／PLLA为高孔隙率的网状、连通、微孔结构，微孔分布均匀，孔径大小为300～400Ⅳn之间；兔MSCs经体外软骨表型定向诱导后，Ⅱ型胶原免疫组化染色阳性。诱导后的MSCs可在支架材料内良好贴附生长，细胞被分泌的胶原基质包裹；从体内获取的培养物组织切片观察可见大量的软骨细胞生成，甲苯胺蓝染色阳性。结论经软骨起源诱导后的MSCs与CPP／PLLA复合培养可以构建自体软骨移植的替代物，为应用软骨组织工程方法修复关节软骨缺损和功能重建提供一种新材料，具有较大的潜在应用价值。     

兔髂骨骺板软骨细胞体外构建骺板样软骨组织

目的　利用组织工程学技术体外构建骺板样软骨组织。方法　从 4～ 5周龄兔髂骨骺板软骨处获取软骨细胞 ,在离心管内轻微离心后 ,体外培养。行组织学观察。结果　培养至第 7天时 ,细胞呈现定向分化 ,形态与体内骺板软骨细胞相类似 :肥大软骨细胞体积较大、呈圆形或椭圆形 ;增殖、成熟软骨细胞体积小 ,呈圆形或扁圆形 ;细胞周围充满大量的细胞外基质。这些不同分化阶段的细胞形成了分化区带 ,肥大软骨细胞位于上侧 ,增殖、成熟细胞位于中间 ,其次是散在静止软骨细胞。培养第 14天 ,分化区带更加明显 ,增殖、成熟细胞和肥大软骨细胞呈现纵向定向排列。培养第 2 1天 ,组织表面出现膜样的结构。结论　体外构建的骺板样软骨组织与天然骺板的组织学形态极为相似。从髂骨处骺板处获取肥大软骨细胞进行体外构建骺板软骨材料 ,更具有临床实用性     

Ad-TGFβ1重组腺病毒载体转染兔骨髓间充质干细胞的研究

利用软骨组织工程修复人体关节面的软骨面缺损是自20世纪末以来人们探讨的研究方向，其中骨髓间充质干细胞作为种子细胞向软骨细胞分化的研究是具有优势的一个热点。我们利用重组腺病毒作为载体，将TGFβ1基因转染兔骨髓间充质干细胞（MSCs），为其向软骨细胞表型的分化提供实验基础。     

骨髓基质干细胞作软骨组织工程种子细胞研究

目的　综述近年来骨髓基质干细胞体外培养、定向分化为软骨细胞的条件及相关研究进展。方法　广泛查阅相关文献 ,对上述研究进展进行整理、综合和分析。结果　骨髓基质干细胞易于分离培养 ,体外增殖能力强 ,传代多次后仍保持有多分化潜能 ;体内成软骨能力明确 ;但骨髓基质干细胞定向分化的软骨细胞 ,不是终末分化阶段 ,而只是一个中间阶段。结论　骨髓基质干细胞以其自身多方面的特点已成为软骨组织工程的另一种可选择的种子细胞 ,但其进一步分化为成熟软骨细胞的条件尚需进一步研究。     

干细胞作为软骨组织工程种子细胞的研究进展

种子细胞是目前软骨组织工程研究的重点之一。目前，报道的软骨组织工程种子细胞主要包括：自体软骨细胞、异体软骨细胞、基因修饰的永生化软骨细胞及各种来源的干细胞。自体软骨细胞来源有限，且体外培养传代会发生“去分化（dedifferentiation）”现象，丧失增殖和分泌基质的能力，这严重限制了其作为种子细胞的应用；异体软骨细胞免疫源性尚不能完全克服；基因修饰的永生化软骨细胞其相应技术尚未成熟，且如何控制其表型稳定及其潜在的致癌性仍需进一步研究。