恶性疟原虫谷氨酸脱氢酶的表达及免疫活性鉴定

目的：在大肠杆菌中表达恶性疟原虫谷氨酸脱氢酶（GDH）与谷胱甘肽S-转移酶融合蛋白，测定重组蛋白的免疫活性。方法：采用PCR方法特异性扩增恶性疟原虫（海南株）GDH基因，双酶切后克隆入pGEX-4T-1载体中进行诱导表达，重组蛋白纯化后免疫小鼠制备特异性血清，并用琼脂双向扩散法检测效价，ELISA、Westernblotting检测重组抗原的免疫活性。结果：获到了重组表达的抗原蛋白，表达产物能与鼠抗恶性疟原虫血清发生特异反应，并能诱导小鼠产生特异性体液免疫应答，免疫琼脂扩散法检测抗体滴度为1：16。结论：恶性疟原虫GDH在大肠杆菌中获得高效表达且表达产物具有良好的抗原性。     

小鼠IFIT1多克隆抗体的制备

目的 获取小鼠IFIT1(Interferon-induced protein with tetratricopetide repeats 1 )特异性多克隆抗体.方法 扩增培养高效表达IFIT1的重组子pMAL-C2X-IFIT1,超声破碎后的细胞上清过Amylose Pre-packed column亲和层析柱,将所得纯化的融合蛋白MBP-IFIT1作为抗原,添加福氏佐机剂后免疫兔,收集抗血清,用Western blot和ELISA方法测定抗血清特异性反应和效价.结果 纯化的MBP-IFIT1可诱导兔产生特异性免疫应答,所得抗体能够特异性识别融合蛋白中的IFIT1,ELISA结果显示其效价为1∶12 800.结论 MBP-IFIT1具有良好的抗原性,以该融合蛋白为抗原免疫兔成功制备出IFIT1特异性多克隆抗体.     

恶性疟原虫谷氨酸脱氢酶的表达及免疫活性鉴定

目的在大肠杆菌中表达恶性疟原虫谷氨酸脱氢酶(GDH)与谷胱甘肽S-转移酶融合蛋白,测定重组蛋白的免疫活性。方法采用PCR方法特异性扩增恶性疟原虫(海南株)GDH基因,双酶切后克隆入pGEX-4T-1载体中进行诱导表达,重组蛋白纯化后免疫小鼠制备特异性血清,并用琼脂双向扩散法检测效价,ELISA、Western blotting检测重组抗原的免疫活性。结果获到了重组表达的抗原蛋白,表达产物能与鼠抗恶性疟原虫血清发生特异反应,并能诱导小鼠产生特异性体液免疫应答,免疫琼脂扩散法检测抗体滴度为1∶16。结论恶性疟原虫GDH在大肠杆菌中获得高效表达且表达产物具有良好的抗原性。     

间日疟原虫乳酸脱氢酶的表达、纯化及免疫活性的鉴定

目的 在大肠杆菌中表达间日疟原虫乳酸脱氢酶(PvLDH)与谷胱甘肽S-转移酶(GST)融合蛋白,对重组蛋白进行纯化并测定其免疫活性.方法 将构建的LDH/pGEX-4T-1重组菌BL21接种于LB培养基中,异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)诱导重组融合蛋白的表达,重组蛋白纯化后免疫小鼠制备特异性血清,ELISA检测血清效价,Western-blotting鉴定其免疫活性.结果 重组质粒在大肠杆菌中表达PvLDH与谷胱甘肽S-转移酶(GST)的融合蛋白,表达产物主要以包涵体形式存在,经复性、纯化后免疫小鼠,能诱导小鼠产生特异性体液免疫应答,ELISA法测效价为1:51200,Western-blotting结果显示该血清能特异性与间日疟和恶性疟患者全血发生反应,而不能与正常人起交叉反应.结论 PvLDH在大肠杆菌中获得高效表达且表达产物具有良好的抗原性和免疫原性.     

沙眼衣原体MIP蛋白的原核表达、纯化及免疫学特性鉴定

目的 采用pGEX-6p载体原核表达沙眼衣原体(Ct)巨噬细胞感染增强因子(MIP),进一步纯化后免疫小鼠,评价该蛋白作为Ct疫苗候选抗原的可行性。方法聚合酶链反应技术从Ct D型基因组扩增MIP编码基因,构建pGEX-6p-1/MIP重组质粒并转化大肠杆菌,IPTG诱导重组菌表达GST-MIP融合蛋白,PreScission蛋白酶切除GST标签后免疫Balb/c小鼠,ELISA法检测MIP的免疫学特性。结果MIP编码基因正确插入pGEX-6p-1载体,核苷酸序列与GenBank登陆的Ct D型MIP基因完全一致;重组融合蛋白在E.coli中稳定高效表达,酶切后纯度达90％以上;MIP蛋白具有良好的免疫原性,诱导小鼠产生高滴度特异性IgG型抗体,亚型以IgG2a为主;MIP免疫组小鼠脾淋巴细胞受MIP蛋白刺激,分泌高水平IFN-γ。结论重组表达的Ct MIP 蛋白具有良好的免疫原性,能诱导小鼠产生高特异性的体液及细胞免疫应答,可进一步探讨其作为Ct亚单位疫苗的可行性。     

结核分枝杆菌基因Rv2660c、Rv2460c、Rv3875、Rv3804c细胞表位融合蛋白的表达及其免疫原性评价

  目的  评价结核分枝杆菌基因Rv2660c、Rv2460c、Rv3875和Rv3804c的细胞表位融合蛋白的免疫原性,为研制新型多阶段结核疫苗提供可靠的靶抗原。  方法  将Rv2660c、Rv2460c、Rv3875和Rv3804c基因中的细胞表位串联构成融合抗原基因(命名为msv),克隆到原核表达载体pEASY-Blunt E1中,诱导表达后采用亲和层析纯化表达产物,经SDS-PAGE和Western blot鉴定后,用纯化的融合抗原蛋白免疫小鼠,ELISA法检测免疫小鼠的特异性抗体滴度;分离免疫小鼠的脾淋巴细胞,采用淋巴细胞增殖法检测其免疫原性。  结果  成功构建了能表达融合抗原基因msv的原核表达质粒;SDS-PAGE和Western blot结果表明,表达产物亲和层析纯化后,获得相对分子质量为41.3×103的目的蛋白;ELISA检测免疫小鼠血清抗体滴度,结果表明特异性抗体效价约为1:81 920;淋巴细胞增殖实验结果表明,抗原致敏的淋巴细胞经融合蛋白msv刺激后明显增殖。  结论  成功表达并纯化出融合蛋白msv,该融合蛋白可诱导小鼠特异性抗体表达和刺激细胞免疫应答,可作为结核疫苗的抗原组分。     

融合表达ESAT6-CFP10蛋白的重组耻垢分枝杆菌诱导小鼠的免疫应答及其保护力

目的研究融合表达ESAT6-CFP10蛋白的重组耻垢分枝杆菌诱导的小鼠体液和细胞免疫应答水平。方法以106CFU/0.1 mL重组M.S通过尾静脉途径免疫小鼠。用MTB培养上清滤液蛋白(CFP)作为抗原,用ELISA法测定免疫小鼠血清特异性抗体的滴度。取部分免疫小鼠脾淋巴细胞,体外用ESAT6-CFP10融合蛋白刺激后,以MTT比色法检测淋巴细胞增殖反应,同时检测免疫小鼠IFN-γ和IL-2水平及脾细胞杀伤效应。结果融合表达ESAT6-CFP10蛋白的重组耻垢分枝杆菌免疫小鼠血清特异性抗体的滴度为1∶6 400。淋巴细胞刺激增殖指数为2.8,明显高于生理盐水组(0.90);IFN-γ和IL-2的含量分别为2230±11 pg/mL和221±17 pg/mL,显著高于生理盐水对照组,但不及BCG免疫组;同时重组耻垢分枝杆菌诱导的脾细胞杀伤率为45%。结论融合表达ESAT6-CFP10蛋白的重组耻垢分枝杆菌能诱导小鼠产生特异性体液和细胞免疫应答,可作为结核新型疫苗使用。     

人Norpeg蛋白的原核表达及其抗体的制备

目的 原核表达Norpeg C端编码区并制备小鼠抗Norpeg多克隆抗体。方法 将Norpeg基因C端编码区克隆进原核表达载体pGEX4T-1中,转化E.coli,以WFG诱导重组蛋白的表达。以纯化的重组目的蛋白作为免疫原免疫小鼠,制备相应的多克隆抗体。结果 成功构建原核表达载体,表达了重组蛋白并制备了小鼠抗Norpeg多克隆抗体。结论 人Norpeg C端编码区能够在体外大肠杆菌中获得融合表达,制备的小鼠抗Norpeg多克隆抗体特异性较高,为下一步深入Norpeg功能研究提供了重要基础。     

人心脏发育相关基因ZNF382的原核表达及多克隆抗体的制备

目的 表达、纯化ZNF382融合蛋白及制备兔多克隆抗体.方法 通过PCR扩增ZNF382编码区,将其克隆到pRSET C载体中,重组载体酶切鉴定,测序,转化大肠杆菌BL21(DE3)并用IPTG进行诱导表达,原核表达产物经鉴定、纯化后,免疫新西兰大白兔.通过ELISA和Western blot检测抗血清的效价和特异性.结果 成功构建了pRSET C-ZNF382原核表达重组质粒,His6-ZNF382融合蛋白被强烈诱导表达,以包涵体的形式存在,其相对分子质量约为 64×103,纯化后免疫产生的多克隆抗体效价约为1∶10 000,与ZNF382原核表达蛋白特异性结合.结论 获得了大量高效价、高特异性的兔抗人ZNF382多克隆抗体.     

HZF1在大肠杆菌中的表达及多克隆抗体的制备

目的在大肠杆菌中表达HZF1融合蛋白,制备抗HZF1抗体。方法构建包含编码HZF1非锌指区DNA的重组表达质粒pET30a-HZF1,转化大肠杆菌并用异丙基-β-D-硫代半乳糖苷诱导表达相应的融合蛋白,采用镍柱纯化。以纯化蛋白作为免疫抗原,对新西兰大白兔实施多次免疫(间隔时间分别为3、2和2周)。用ELISA和Westernblot检测抗体效价和特异性。结果获得兔抗HZF1抗体,经过ELISA检测,效价在1:100000以上。Westernblot显示兔抗HZF1抗体能够特异性检测氯高铁血红素诱导的K562细胞中的HZF1蛋白。结论得到高特异性的兔抗HZF1抗体,为HZF1的功能研究以及组织和细胞中HZF1的检测奠定了一定基础。     

Dengue Vaccine: The Current Status

Dengue fever is a re-emerging public health problem with two-fifths of the world population being at risk of infection. Since there are no antiviral drugs available against the dengue virus, and vector control programmes have been largely unsuccessful in preventing outbreaks, vaccination seems to be the most viable option for preventing infection. An ideal dengue vaccine should provide long lasting immunity against all four serotypes of the virus. The envelope protein of the virus plays a key role in vaccine development. The present day candidate vaccines includes a live attenuated tetravalent vaccine, intertypic chimaeric vaccines based on live attenuated dengue virus vectors, chimaeric vaccines based on the live attenuated Yellow Fever 17D vector and recombinant vaccines which include vaccines based on flavivirus and non-flavivirus vectors. Tetravalent live attenuated vaccines, intertypic chimaeric vaccines and chimaeric vaccines are being tested in human trials. Recombinant DNA vaccines based on flavivirus and non-flavivirus vectors are being tested in animal trials. Recent studies have shown that the tetravalent formulations may elicit an unbalanced immune response. Research is continuing to find means of obtaining a balanced response to all antigens in the tetravalent formulations.Key Words: Dengue fever, Candidate vaccines, Clinical trials     

Dengue vaccine: The current status

Dengue fever is a re-emerging public health problem with two-fifths of the world population being at risk of infection. Since there are no antiviral drugs available against the dengue virus, and vector control programmes have been largely unsuccessful in preventing outbreaks, vaccination seems to be the most viable option for preventing infection. An ideal dengue vaccine should provide long lasting immunity against all four serotypes of the virus. The envelope protein of the virus plays a key role in vaccine development. The present day candidate vaccines includes a live attenuated tetravalent vaccine, intertypic chimaeric vaccines based on live attenuated dengue virus vectors, chimaeric vaccines based on the live attenuated Yellow Fever 17D vector and recombinant vaccines which include vaccines based on flavivirus and non-flavivirus vectors. Tetravalent live attenuated vaccines, intertypic chimaeric vaccines and chimaeric vaccines are being tested in human trials. Recombinant DNA vaccines based on flavivirus and non-flavivirus vectors are being tested in animal trials. Recent studies have shown that the tetravalent formulations may elicit an unbalanced immune response. Research is continuing to find means of obtaining a balanced response to all antigens in the tetravalent formulations.     

细胞因子IL-18基因对Ag85A DNA疫苗诱导产生抗体水平的影响

目的 :研究表达含白介素 (IL) 18基因的质粒 ,对结核分枝杆菌 (MTB)H37Rv Ag85A基因疫苗诱导免疫应答的影响。方法 :从正常人外周血单核细胞 (PMBCs)中提取RNA ,用RT PCR扩增IL 18cDNA ,并克隆入载体pGEM Teasy中。测序证实后 ,亚克隆真核表达载体pcDNA3.1的BamHⅠ和EcoRⅠ酶切位点。将分别表达人IL 18基因的真核表达质粒pcIL18与MTBpcAg85A基因疫苗联合肌注免疫BALB c小鼠 ,共免疫 3次 ,每次间隔 2周。每次免疫后 2周采血 ,分离血清 ,用ELISA检测小鼠血清抗Ag85A抗体的滴度。结果 :用RT PCR成功地从人PMBCs的RNA中扩增IL 18cDNA ,测序结果正确。用BamHⅠ和EcoRⅠ酶切鉴定证实 ,目的基因已插入载体pcDNA3.1中 ,阳性克隆命名为pcIL18。联合应用pcIL18,三次免疫后血清抗Ag85A抗体的滴度明显较单独应用pcAg85A增高。结论 :pcIL18与pcAg85A基因疫苗联合免疫 ,可显著增强Ag85A抗原的特异性体液免疫应答。pcIL18+pcAg85A基因联合免疫是否具有增强Ag85A抗原特异性细胞免疫的作用有待进一步研究     

白细胞介素-2对乙型肝炎病毒基因疫苗免疫效应的影响

目的　构建表达乙型肝炎病毒 (HBV)S蛋白的重组质粒pCR3 .1 -S作为基因疫苗 ,观察重组人白细胞介素 - 2 (rhIL - 2 )作为佐剂对其诱导BALB/c小鼠产生免疫应答的影响。方法　以不同剂量IL - 2作为佐剂 ,生理盐水作为对照 ,测定不同免疫组的血清抗HBs、淋巴细胞增殖活性、淋巴细胞杀伤活性 ,比较不同免疫组间体液和细胞免疫应答的差异。结果　抗HBsELISA滴度 ,IL - 2组与对照组比较差异无显著性 (P >0 .0 5) ;淋巴细胞增殖指数、淋巴细胞杀伤率 ,IL - 2　 1 0 0 0U/ (只·次 )组、IL - 2　 2 0 0 0U/ (只·次 )组与对照组比较差异有显著性 (P <0 .0 5) ,而IL - 2　 50 0U/ (只·次 )组与对照组比较差异无显著性 (P >0 .0 5)。结论　一定剂量的IL - 2作为佐剂可增强HBV基因疫苗的免疫效应。     

表达戊型肝炎病毒ORF2蛋白的重组腺病毒构建及其经粘膜途径免疫小鼠

目的 构建可表达戊型肝炎病毒(hepatitis E virus,HEV)ORF2蛋白(112-660ea)的重组腺病毒Adasy-EORF2,探讨其经鼻腔和腹腔免疫小鼠后。诱导机体产生特异性体液免疫和粘膜免疫应答的能力,为研制戊型肝炎疫苗探索新的途径。方法 经PCR扩增编码ORF2蛋白(112-660aa)的基因片段,将其连接于重组腺病毒Adasy系统的穿梭质粒pTrack-CMV上,与腺病毒基因组质粒pAdEasy-l共转化宿主菌BJ5183,经细菌内同源重组获得重组腺病毒基因组质粒,转染293细胞以产生、扩增重组腺病毒。将重组腺病毒以10^7pfu的剂量经鼻腔和腹腔免疫小鼠,通过ELISA检测血液IgG和粘膜IgA的应答情况。结果 重组腺病毒经鼻腔免疫小鼠后可刺激机体产生特异性IgA、IgG免疫应答,IgG最高滴度达l：l000。经腹腔免疫可刺激小鼠产生IgG免疫应答,最高滴度可达l：10000,未检测到明显的IgA应答。结论 表达HEV ORF2蛋白的重组腺病毒能刺激机体产生有效的免疫应答,具有成为新型戊型肝炎疫苗的潜力．     

不同浓度重组登革病毒1型病毒样颗粒免疫效果的评价

目的评价毕赤酵母表达的登革病毒1型(DENV-1)病毒样颗粒(VLPs)不同浓度条件下的免疫效果,为登革多价疫苗的研究奠定基础。方法采用毕赤酵母系统构建两种DENV-1 VLPs(即DENV-1 prME-VLPs和DENV-1CprME-VLPs),鉴定、纯化后比较其表达量,选择表达量高的VLPs以不同剂量免疫BALB/c小鼠(试验组分别注射经弗氏佐剂乳化的VLPs 10、25、50μg;对照组分别注射PBS和弗氏佐剂)。通过间接ELISA及中和试验测定免疫小鼠血清特异性抗体效价和中和抗体效价;用VLPs体外刺激免疫小鼠的脾淋巴细胞,MTT法测定其增殖指数;ELISPOT检测IL-4、IFN-γ及TNF-α的抗原特异性淋巴细胞数量。结果以电镜下观察到成功表达的直径约为30nm、形态无明显差异的两种VLPs。两种表达体系中,以DENV-1 prME-VLPs表达量较高。经较高表达量的VLPs免疫小鼠后发现,初次免疫后1周,即可检测到针对DENV-1的抗体,随着时间延长,抗体效价逐渐上升,5周达峰值;其中,VLPs 25μg剂量组与50μg剂量组特异性抗体效价及中和抗体效价均显著高于PBS组、佐剂对照组及VLPs 10μg剂量组,差异有统计学意义(P0.05)。VLPs 25μg剂量组与50μg剂量组免疫后的小鼠淋巴细胞增殖指数及其分泌IL-4、IFN-γ及TNF-α抗原特异性淋巴细胞数目,均显著高于对照组及VLPs 10μg剂量组,差异有统计学意义(P0.05)。结论毕赤酵母表达的DENV-1 VLPs免疫剂量为25μg时即可诱导高效价的中和抗体和显著的细胞免疫效应。     

丙型肝炎病毒核酸疫苗的构建及小鼠体液免疫效果

目的 探讨核酸商以苗在HCV感染中的预防和治疗价值。方法 将HCV C区基因插入pEF质粒EF－1α下游,构建pEF-HCV C重组质料,然后经im及皮下注射免疫BALB／c小鼠,免疫次数分别为1,2,3,4次,ELISA法检测免疫小鼠血清中抗－HCV的水平。结果 接种后各组均检测到抗－HCV的水平。结果 接种后各组均检测到抗－HCV,但是抗体滴度较低,在不同的免疫次数中,4次免疫组抗体水平最高。结论 构建的HCV DNA重组体可诱发BALB／d小鼠产生体液免疫应答,加强免疫后可使血清中抗－HCV明显增高。     

Neutralizing Antibody Titer Test of Ebola Recombinant Protein Vaccine and Gene Vector Vaccine pVR-GP-FC

Objective In previous studies, we immunized mice with Ebola recombinant protein vaccine and gene vector vaccine. Both stimulated high levels of humoral immunity. In this work, we constructed a pseudovirus containing Ebola membrane proteins to verify whether the two immunization strategies can induce neutralizing antibodies in mice. Methods A pseudovirus containing an Ebola virus membrane protein based on the HIV-1 viral gene sequence was constructed and evaluated using a known neutralizing antibody. The titer of the neutralizing antibody in the sera of mice immunized with the recombinant protein and the gene vector vaccine was examined using a neutralization test. Results Ebola pseudovirus was successfully prepared and applied for neutralizing antibody detection. Immunological experiments showed that recombinant protein GP-Fc and gene vaccine pVR-modGP-Fc had good immunogenicity. The titer of the bound antibody in the serum after 8 weeks of immunization in mice was more than 1:105, and the recombinant protein induced greater humoral immunity. The results of the neutralization test based on the Ebola pseudovirus system demonstrated that both vaccines induced production of protective antibodies, while the gene vaccine induced a higher titer of neutralizing antibodies. Conclusion An Ebola pseudovirus detection system was successfully established and used to evaluate two Ebola vaccines. Both produced good immunogenicity. The findings lay the foundation for the development of new Ebola vaccines and screening for neutralizing monoclonal antibodies.     

布氏杆菌PBP39蛋白抗原表达及免疫效果的研究

目的获得纯化的布氏杆菌PBP39重组蛋白抗原,观察PBP39重组蛋白的免疫原性.方法扩增不同种布氏杆菌PBP39基因,测序、连接表达载体PET32a,诱导表达,柱纯化PBP39重组蛋白抗原,免疫BALB/c小鼠,ELISA检测抗体及抗体亚型.结果我国牛、羊、猪布氏杆菌PBP39基因与国外已报道的PBP39编码基因不完全相同.在蛋白N端58位碱基后多一G,造成移码突变.故在85、86、87位编码终止子TCA.而在134、135、136位的ATG又编码了新的起始密码.布氏杆菌PBP39蛋白在大肠杆菌高效表达,表达量达40%,纯化重组蛋白抗原免疫BALB/c小鼠,产生了较高水平的特异性抗体免疫应答,抗体亚型主要是IgG1.结论我国牛、羊、猪布氏杆菌PBP39编码抗原蛋白同国外已报道的不完全相同,纯化的PBP39重组蛋白抗原可诱导高水平的抗体反应,为筛选布氏杆菌病新型疫苗保护性抗原分子奠定了基础.     

HIV-1 p24 gag 与hIL-2基因在重组痘苗病毒中的共表达研究

目的：研究 Ｈ Ｉ Ｖ １ｐ２４ ｇａｇ 与 ｈ Ｉ Ｌ ２基因在重组痘苗病毒中的共表达。方法：以痘苗病毒复制非必需区血凝素（ Ｈ Ａ）基因为侧翼,将编码人白细胞介素２（ｈ Ｉ Ｌ ２）的基因片段克隆到真核表达质粒ｐ１６ Ｑ Ｆ２４ Ｉ Ｌ２,经同源重组和血凝素阴性空斑筛选,获得了重组痘苗病毒ｖ１６ Ｑ Ｆ２４ Ｉ Ｌ２。结果：经间接免疫荧光试验、 Ｄｏｔ Ｅ Ｌ Ｉ Ｓ Ａ 和 Ｗ ｅｓｔｅｒｎ ｂｏｌｔ 等检测证明,重组病毒能同时表达ｐ２４ ｇａｇ 蛋白和 Ｉ Ｌ ２蛋白,表达产物分子量分别为２４ ０００、１６ ０００。结论：这种重组痘苗病毒人表达外源蛋白的成功,为获得更强的免疫效果,研制 Ｈ Ｉ Ｖ 重组病毒活疫苗提供一种安全的新途径。