miR-145抑制口腔鳞状细胞癌Tca-8113细胞增殖活性及其与CDK6的靶向关系

目的 在口腔鳞状细胞癌Tca-8113细胞中验证miR-145靶向CDK6对其细胞增殖活性的影响. 方法 构建pcD-NATM6.2-GW-pre-miR-145重组表达质粒并转染入Tca-8113细胞,以荧光实时定量PCR（qRT-PCR）检测转染后癌细胞miR-145的表达水平.MTT法评价miR-145对Tca-8113细胞增殖活性的影响,并通过双荧光素酶报告基因检测miR-145对候选靶基因CDK6的调控作用,同时采用Western blot法检测miR-145对CDK6蛋白表达水平的影响. 结果 成功构建miR-145真核表达载体,qRT-PCR显示miR-145组中miR-145的表达显著高于内源性表达量（P＜0.001）,说明miR-145在Tca-8113细胞中具有较高的转染效率.MTT法提示miR-145的过表达能够显著抑制Tca-8113细胞的增殖（P＜0.01）,同时双荧光素酶报告基因分析表明,共同转入miR-145与CDK6野生型（CDK6-WT）会显著抑制Tca-8113细胞中的荧光酶表达（P=0.002）;Western blot进一步证实了miR-145的过表达能够抑制内源性CDK6蛋白的表达. 结论 miR-145可能通过直接靶向CDK6来抑制口腔鳞状细胞癌Tca-8113细胞的增殖活性.     

miR-145对宫颈癌细胞增殖、迁移和侵袭的影响

目的研究miR-145对人宫颈癌细胞系SiHa细胞增殖、迁移和侵袭的影响,并探讨其机制。方法体外培养子宫颈癌细胞和正常宫颈上皮细胞,检测细胞中miR-145表达水平;将SiHa细胞分为miR-145过表达(mimics)组和阴性对照(NC)组,转染48 h后,CKK-8法检测细胞增殖情况,Transwell实验检测细胞迁移、侵袭能力;应用TargetScan数据库预测miR-145的靶基因并用荧光素酶报告基因实验验证,蛋白免疫印记(WB)检测miR-145过表达对肌球蛋白Ⅵ(MY06)蛋白表达的影响。结果 SiHa、Hela、MS751人子宫颈癌细胞中miR-145表达水平均显著低于正常子宫颈上皮细胞,差异有统计学意义(P0.05)。转染miR-145 mimics后,SiHa细胞中miR-145表达水平显著上调(P0.05);与NC组比较,mimics组SiHa细胞的增殖、迁移、侵袭能力均显著下降(P0.05)。TargetScan数据库预测显示MY06是miR-145潜在靶基因,双荧光素酶报告基因实验证实二者存在靶向关系。WB结果显示miR-145过表达后,MY06蛋白表达水平显著下调。结论 miR-145能通过下调MY06表达抑制人宫颈癌细胞系SiHa细胞的增殖、迁移和侵袭。     

下调miR-886—5p的表达对宫颈癌SiHa细胞增殖的影响

目的探讨下调miR-886—5p的表达对SiHa细胞增殖的影响。方法应用脂质体转染法分别将miR-886—5p表达抑制质粒及其对照质粒转染siHa细胞,经Blasticidin抗生素筛选,得到稳定抑制miR-886—5p表达的SiHa细胞（SiHamiR-886—5pinhibitor）和稳定转染对照质粒的细胞;RT—PCR进行验证;采用MTT测增殖及克隆形成实验检测细胞的增殖能力。结果获得了稳定抑制miR一886—5p表达的宫颈癌siHa细胞系;MTT测增殖实验发现,SiHamiR-886—5pinhibitor体外增殖能力比si—HamiR-886—5pNC及未转染质粒组细胞均明显减弱（P〈0．05）;克隆形成实验发现,SiHamiR-886—5pinhibitor体外克隆形成能力比SiHamiR-886—5pNC及未转染质粒组细胞均明显减弱（P〈0．01）。结论下调miR-886—5p可显著抑制siHa细胞的增殖,提示靶向抑制miR-886—5p为宫颈癌的治疗提供了新思路。     

miR-26a靶向EZH2抑制涎腺腺样囊性癌ACC-M细胞的增殖活性

目的 探讨miR-26a对涎腺腺样囊性癌ACC-M细胞增殖能力的影响及其与EZH2的靶向关系. 方法 构建pcD-NATM6.2-pre-miR-26a、pmirGLO-EZH2野生型（pmirGLO-EZH2-WT）和突变型（pmirGLO-EZH2-MT）重组质粒,并采用荧光实时定量PCR（qRT-PCR）检测pre-miR-26a在ACC-M细胞中的转染效率,并与未处理组（control组）进行比较.同时采用MTT法分析miR-26a过表达对ACC-M细胞增殖活性的影响,并采用双荧光素酶报告基因系统、qRT-PCR和Western blot检测miR-26a与EZH2的靶向关系. 结果 将测序结果采用NCBI BLAST进行序列比对,结果显示pre-miR-26a、EZH2-WT和EZH2-MT重组质粒均构建成功,无碱基缺失或突变.qRT-PCR显示转染pre-miR-26a的ACC-M细胞其miR-26a的表达显著高于未处理组（P＜0.001）.MTT分析显示miR-26过表达可以明显抑制ACC-M细胞的增殖活性（P＜0.05）.此外,双荧光素酶报告基因系统（P=0.001）、qRT-PCR和Western blot均证实miR-26a能够显著下调EZH2的mRNA（P=0.001）和蛋白的表达（P=0.006）. 结论 miR-26a能够显著抑制涎腺腺样囊性癌ACC-M细胞的增殖活性,并且与EZH2之间存在良好的靶向关系.     

miR-29a在宫颈癌组织中的表达及其上调后对宫颈癌细胞恶性生物学行为的影响

目的检测微小RNA（miR）-29a 在宫颈癌组织和不同种类宫颈癌细胞系中的表达情况及其上调后对宫颈癌SiHa细胞增殖、凋亡、侵袭及迁移等恶性生物学行为的影响。方法①组织标本检测：收集2014 年7 月-2016 年7 月西南医科大学附属医院活检或手术切除的宫颈组织标本160 例,采用实时荧光定量聚合酶链反应（qRT-PCR）检测miR-29a 的表达情况,并分析宫颈癌组织中miR-29a 的表达与临床病理特征的关系。②细胞学实验：采用qRT-PCR检测miR-29a在不同种类的人宫颈癌细胞系（SiHa、HeLa、Caski及C33a）和人正常宫颈细胞系Ect1/E6E7中的表达水平,选取miR-29a表达最低的宫颈癌细胞系SiHa进行后续研究,使用miR-29a mimics转染SiHa细胞,qRT-PCR检测转染后细胞miR-29a 的表达变化,CCK-8 法检测转染后细胞增殖活力的变化,流式细胞仪检测转染后细胞凋亡率的变化,Transwell实验检测转染后细胞迁移和侵袭能力的变化。结果宫颈鳞癌组织中miR-29a 表达低于HSIL、LSIL及正常宫颈组织（p <0.05）;HSIL组织中miR-29a表达低于LSIL及正常宫颈组织（p <0.05）,LSIL与正常宫颈组织间miR-29a的表达差异无统计学意义（p >0.05）。宫颈鳞癌组织中miR-29a的表达与患者临床分期和淋巴结转移密切相关（p <0.05）。miR-29a在人宫颈癌细胞系（SiHa、HeLa、Caski和C33a）中的表达低于人正常宫颈细胞系Ect1/E6E7（p <0.05）。SiHa细胞转染miR-29a mimics后,miR-29a表达水平增高（p <0.05）,细胞增殖活力降低（p <0.05）,细胞凋亡率增高（p <0.05）,细胞迁移和侵袭能力下降（p <0.05）。结论miR-29a在宫颈癌组织和细胞中均呈低表达,上调miR-29a的表达能够抑制宫颈癌SiHa细胞的增殖及侵袭迁移能力,促进细胞的凋亡。     

miR-3685通过靶向CTTN抑制宫颈癌细胞的迁移、侵袭及生长

目的:微小RNA (microRNA,miRNA)通常通过与其靶基因的3′非翻译区（3′UTR）结合而调控肿瘤细胞的恶性行为,目前miR-3685对肿瘤细胞恶性行为的影响鲜有报道,本文旨在探讨miR-3685对宫颈癌细胞恶性行为及其分子机制的影响。方法:生物信息学软件预测miR-3685的靶基因,用EGFP报告系统验证。实时荧光定量PCR(RT-qPCR)技术检测miR-3685和CTTN(cortactin)在人类宫颈癌细胞中的表达,用transwell迁移/侵袭实验、Western blot实验、集落形成实验、细胞周期进程实验分别检测了miR-3685和CTTN对HeLa细胞和SiHa细胞的迁移、侵袭能力、EMT进程、细胞增殖能力及细胞周期进程的影响。结果:与对照组相比,过表达miR-3685可抑制宫颈癌HeLa和SiHa细胞的迁移、侵袭及生长,封闭miR-3685,得到相反的结果。过表达CTTN可促进宫颈癌HeLa和SiHa细胞的迁移、侵袭及生长,EGFP报告系统验证CTTN是miR-3685的直接靶基因（*P＜0.05,**P＜0.01,***P＜0.001）。结论:miR-3685通过抑制CTTN的表达而抑制宫颈癌HeLa和SiHa细胞的迁移、侵袭及生长。     

miR-221在前列腺癌细胞中的表达及对增殖的影响

目的研究前列腺癌细胞中miR-221的表达情况及其对癌细胞增殖的影响。方法运用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测miR-221在前列腺正常细胞株与前列腺癌细胞株中表达的差异情况,利用细胞转染构建miR-221过表达LNCa P和DU145细胞株,再通过CCK8细胞增殖实验检测细胞增殖情况的变化。结果 qRT-PCR检测细胞株发现miR-221在PC3、LNCa P和DU145三种前列腺癌细胞株中表达量均比前列腺正常细胞株Pr EC低(F=254.197,P<0.001),其中两两比较差异也均有统计学意义。细胞转染技术构建的miR-221过表达LNCa P和DU145细胞株,经qRT-PCR结果显示,miR-221在LNCa P和DU145细胞株中的表达水平明显升高(LNCa P,倍数变化=2.24,t=3.46,P<0.01;Du145,倍数变化=2.24,t=4.29,P<0.01)。细胞增殖实验结果显示,过表达了miR-221的LNCa P(P<0.001)和DU145(P<0.001)细胞生长速度慢于对照组。结论实验证明miR-221表达过度能减慢前列腺癌细胞的增殖,miR-221有可能成为前列腺肿瘤治疗的生物学标志物。     

miR-145在非小细胞肺癌中的表达及其对N-cadherin表达的调控

目的:检测miR-145在非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)中的表达,并探讨其调控神经性钙黏附蛋白(neural cadherin,N-cadherin)在NSCLC侵袭转移中的作用?方法:实时荧光定量PCR检测31例NSCLC组织中miR-145与N-cadherin的表达水平?采用脂质体法将miR-145 mimics瞬时转染至SPC-A1细胞,RT-PCR和Western blot检测N-cadherin的表达变化;Transwell实验检测转染后SPC-A1细胞的侵袭能力?结果:在NSCLC癌组织中,miR-145与N-cadherin的表达水平分别表现为显著下调和上调,且表达水平与淋巴结转移密切相关?在SPC-A1细胞中,过表达miR-145能降低N-cadherin的表达,并抑制肿瘤细胞的侵袭?结论:miR-145在NSCLC中低表达,其可能通过靶向调控N-cadherin而影响NSCLC的侵袭转移?     

miR-320靶向Rab11对宫颈癌细胞增殖、侵袭及迁移的影响

目的探讨miR-320对宫颈癌细胞SiHa增殖、侵袭及迁移的调控作用。方法选取宫颈癌细胞系SiHa,将细胞分为miR-320模拟基因组、miR-320抑制剂组、对照模拟基因组、对照抑制剂组,各组分别转染miR-320模拟基因、miR-320抑制剂、对照模拟基因、对照抑制剂。采用反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)法检测各组SiHa细胞中miR-320表达;Western blot检测各组SiHa细胞中Rab11蛋白表达;噻唑蓝(MTT)法检测细胞增殖活性;Transwell小室实验检测细胞侵袭能力;划痕实验检测细胞迁移能力;双荧光素酶报告基因检测细胞荧光素酶活性。结果 miR-320抑制剂组SiHa细胞中miR-320相对表达量低于对照抑制剂组(P<0.05);miR-320模拟基因组SiHa细胞中miR-320相对表达量高于对照模拟基因组(P<0.05)。miR-320抑制剂组SiHa细胞的细胞活性、侵袭能力、迁移能力高于对照抑制剂组(P<0.05);miR-320模拟基因组SiHa细胞的细胞活性、侵袭能力、迁移能力低于对照模拟基因组(P<0.05)。miR-320抑制剂组SiHa细胞中Rab11蛋白表达高于对照抑制剂组(P<0.05);miR-320模拟基因组SiHa细胞中Rab11蛋白表达低于对照模拟基因组(P<0.05)。miR-320抑制剂组SiHa细胞的细胞荧光活性显著低于对照抑制剂组(P<0.05);miR-320模拟基因组SiHa细胞的细胞荧光活性与对照模拟基因组比较差异无统计学意义(P>0.05)。结论 miR-320可通过靶向Rab11调控SiHa细胞增殖、侵袭及迁移。     

SERPINE1介导miR-660信号影响肝癌细胞增殖的实验研究

目的 分析SERPINE1在肝癌组织中的表达水平,探讨其对肝癌细胞增殖的影响及其调控机制。方法 利用GEPIA网站分析SERPINE1在肝癌及癌旁组织中的表达情况。荧光定量PCR检测五株肝癌细胞中SERPINE1的表达,选择SERPINE1低表达的细胞转染SERPINE1过表达载体,SERPINE1高表达的细胞转染SERPINE1干扰片段,细胞转染48 h后,CCK-8检测细胞增殖情况;双荧光素酶以及荧光定量PCR检测miR-660对SERPINE1的调控作用,CCK-8进一步验证SERPINE1是否介导了miR-660对肝癌细胞增殖的调控。结果 TCGA数据库分析结果显示,SERPINE1在肝癌组织中的表达水平显著降低(P<0.05)。CCK-8结果显示,与空载体组相比,过表达SERPINE1显著抑制了肝癌细胞的增殖(P<0.05);双荧光素酶结果显示,miR-660能够结合SERPINE1,并且上调miR-660抑制了SERPINE1的表达(P<0.05)。此外,与NC mimic组相比,过表达miR-660显著促进了细胞增殖(P<0.05),而与miR-6...     

miR-519d靶向CDKN1A/p21调控宫颈癌细胞增殖的初步研究

目的探讨miR-519d对人宫颈癌细胞中CDKN1A/p21基因的靶向调控作用以及对细胞增殖、周期的影响。方法通过荧光定量PCR技术检测miR-519d抑制物对其活性的调控作用。在宫颈癌He La和Si Ha细胞中下调miR-519d表达,利用MTT法检测细胞增殖能力,通过流式细胞术检测细胞周期的分布情况。将miR-519d mimic转染He La和Si Ha细胞,用荧光定量PCR、Western Blot分别检测p21 m RNA和蛋白水平的表达。利用双荧光素酶报告基因系统确认miR-519d与p21的靶向关系。结果 miR-519d抑制物能有效下调宫颈癌He La和Si Ha细胞内miR-519d的表达。MTT实验和细胞周期分析结果提示,下调细胞内miR-519d的表达能够显著降低细胞增殖活力,并使细胞周期阻滞于G1期。进一步通过双荧光素酶报告基因系统鉴定miR-519d能够结合p21 m RNA3′UTR有效抑制其表达。q RT-PCR和Western blot检测结果表明,过表达miR-519d能在m RNA和蛋白水平上抑制p21的表达。结论 p21是miR-519d的直接靶基因,miR-519d可能通过靶向p21调控宫颈癌细胞增殖。     

雌、孕激素联合给药逆转miR-145对三阴性乳腺癌的抑癌作用

目的 探讨雌、孕激素在三阴性乳腺癌形成中的作用及相关分子机制.方法 构建MDA-MB-231/miR-145及 MDA-MB-231/miR-SCR(对照组)稳定细胞株,分5组培养细胞,分别为 miR-SCR 组、miR-145 组、miR-145 + E2 组、miR-145 + P4组、miR-145 + E2 + P4组,分别分组给药.利用 CCK-8试剂盒检测细胞增殖能力,Western blot检测miR-145靶基因胰岛素样生长因子受体-1(IGF-1R)、N-RAS的蛋白表达水平,荧光定量PCR(qRT-PCR)检测IGF-1R、N-RAS下游信号分子血管内皮生长因子(VEGF)的表达水平及转染后 miR-145的表达.结果 CCK-8试剂盒检测结果显示,雌、孕激素联合给药可逆转miR-145对三阴性乳腺癌细胞增殖的抑制作用(P＜0. 05).Western blot法检测结果显示,雌、孕激素联合给药使miR-145靶基因IGF-1R、N-RAS的蛋白表达水平上升.qRT-PCR检测结果显示,与对照组比较,转染后miR-145的表达水平上升(P＜0.05);雌、孕激素联合给药使VEGF的表达水平明显上升(P＜0.01).结论 雌、孕激素联合给药可促进三阴性乳腺癌VEGF的表达和细胞增殖,从而逆转miR-145在三阴性乳腺癌中的抑癌作用.     

miR-200C-3p靶向调控ZEB2抑制前列腺癌细胞增殖和迁移的实验研究

  目的  前列腺癌的进展与多种因素有关,本研究旨在探索miR-200C-3p对前列腺癌细胞系的影响,并分析miR-200C-3p与ZEB2的潜在机制。  方法  通过qRT-PCR检测miR-200C-3p在前列腺癌细胞系PC-3、DU145、前列腺上皮细胞RWPE-1的表达量。DU145转染miR-200C-3p后,通过CCK-8、划痕修复实验以及Transwell实验探究增殖与迁移能力。沉默ZEB2后分析DU145增殖和迁移能力的变化,采用双荧光素酶报告法蛋白免疫印迹实验测定miR-200C-3p与E盒结合锌指蛋白2(zinc finger E-box binding homeobox 2,ZEB2)的潜在关系。  结果  qRT-PCR结果显示RWPE-1中miR-200C-3p表达量是DU145的2.5倍左右。DU145转染miR-200C-3p mimics后CCK-8实验组的增殖能力明显弱于对照组,划痕修复实验实验组[(20.33±1.45)%]与对照组[(46.67±2.40)%]相比愈合能力明显减弱(P < 0.001),Transwell实验结果表明实验组(114.30±5.21)与对照组(212.00±6.49)相比迁移能力显著下降(P < 0.001)。沉默ZEB2可抑制DU145细胞的增殖和迁移能力(P < 0.05),双荧光素酶报告和蛋白免疫印迹实验证实miR-200C-3p在DU145中过表达降低了ZEB2的蛋白表达(P < 0.05)。  结论  miR-200C-3p通过介导ZEB2抑制DU145的增殖和迁移。      

调控miR-181d-5p表达对宫颈癌细胞增殖、凋亡、侵袭的影响

目的 探究miR-181d-5p对宫颈癌细胞增殖、凋亡、侵袭影响及对细胞硫酰化限速酶(sulfation rate-limiting enzyme, PAPSS2)/蛋白聚糖(proteoglycans, VCAN)信号通路的影响。方法 细胞学实验：人宫颈癌细胞Hela细胞分为对照组、NC组和miR-181d-5p组,MTT、流式细胞技术及Transwell实验分别检测各组细胞增殖、凋亡和侵袭能力,Western blot检测各组PAPSS2和VCAN蛋白表达水平。裸鼠荷瘤实验：20只SPF级裸鼠随机分为对照组(n=10)和miR-181d-5p组(n=10),分别接种野生型细胞和转染miR-181d-5p细胞,模型建立后每3 d测量1次小鼠肿瘤体积,连续测量21 d,于实验终点测量肿瘤质量和体积。结果 细胞学实验表明：与对照组和NC组比较,miR-181d-5p组细胞增殖能力显著降低、细胞凋亡比例显著增加、细胞侵袭能力显著降低、PAPSS2,VCAN表达水平显著下调(P<0.05),NC组与对照组差异无统计学意义(P>0.05)。裸鼠荷瘤实验表明：miR-181d-5p组...     

miRNA-145调控靶基因c-Myc抑制胃癌增殖、侵袭

目的 探索microRNA145（miR-145）对胃癌细胞增殖活性的影响,及与其靶基因c-Myc的调控关系。方法 选取人胃癌细胞株SGC-7901作为研究对象,并向细胞株内转染miR-145模拟物和miR-145阴性对照物,荧光显微镜观察、Q-PCR检测转染后细胞株miR-145的变化,并通过细胞软琼脂克隆增殖实验和MTT实验检测转染后SGC-7901细胞株的增殖能力、Transwell侵袭小室检测细胞侵袭能力。Western blot法检测转染后SGC-7901细胞株中c-Myc蛋白的表达情况。结果 转染后,miR-145模拟物组中miR-145的表达明显高于miR-145阴性对照和空白组,转染miR-145模拟物后SGC-7901细胞增殖能力显著降低（P<0.05）,c-Myc蛋白表达也明显较低（P<0.05）。结论 miR-145能通过抑制靶基因c-Myc的表达,抑制胃癌细胞的增殖与侵袭能力。总之,miR-145可能在胃癌中发挥抑癌基因的作用,是胃癌潜在的早期诊断指标和治疗靶点。     

人microRNA149抑制表达慢病毒载体的构建及对黑色素瘤细胞增殖及迁移的影响

目的 构建人microRNA149(Hsa-miR-149)抑制表达慢病毒载体,并探讨抑制miR-149表达对黑色素瘤Mel-RM细胞增殖及迁移的影响.方法 由miRBase及NCBI数据库查找获得miR-149序列,设计合成其引物序列,通过退火反应获得双链DNA寡核苷酸片段,与载体pBS-hU6-1连接,将连接后的载体与FG12连接,经测序鉴定后获得重组慢病毒载体;将重组慢病毒质粒分别与包装辅助质粒共转染至293T细胞中,包装产生病毒,进行病毒滴度测定,再用包装后的病毒感染Mel-RM细胞,利用实时荧光定量PCR法检测miR-149表达水平.同时用MTT法及细胞迁移实验分别检测细胞增殖和迁移能力.结果 成功构建了抑制miR-149表达的慢病毒载体,测序证实了所插入的基因序列正确.在荧光显微镜下观察到转染后的297T细胞表达大量绿色荧光蛋白,收集病毒,用梯度滴定法测得的重组载体病毒滴度为3.2×1010 TU/L.将病毒感染Mel-RM细胞显示可有效降低miR-149的表达水平(P＜0.05).MTT法结果显示与感染空载FG12病毒的对照组相比,感染抑制miR-149表达重组质粒的实验组中活细胞数明显减少(P＜0.05).细胞迁移实验结果显示与对照组相比实验组明显抑制了Mel-RM细胞的迁移(P ＜0.001).结论 成功构建抑制miR-149表达的慢病毒载体,抑制miR-149的表达可以抑制Mel-RM细胞的增殖和迁移.并为后续进一步研究miR-149对黑色素瘤细胞发生发展的影响提供依据.