糖基化终末产物对小鼠骨髓间充质干细胞增殖及相关基因P27、cyclinD1 的影响

目的:探讨糖基化终末产物(AGEs)对小鼠骨髓间充质干细胞(BMSCs)增殖能力以及相关基因P27、cyclinD1的影响。方法:全骨髓法培养小鼠骨髓间充质干细胞;成骨、成脂诱导骨髓间充质细胞,对其进行干细胞鉴定;将培养出的骨髓间充质干细胞与不同浓度的AGEs 共培养,MTT检测不同浓度下骨髓间充质干细胞增殖的改变;实时定量聚合酶链反应(Real time PCR)检测AGEs刺激后P27、cyclin D1表达的改变。结果:小鼠骨髓间充质干细胞成骨诱导21 d后茜素红染色出现钙化结节;成脂诱导21 d后油红O染色出现脂滴;MTT显示不同浓度的AGEs(10、50、100、200 mg/L)均能抑制BMSCs的增殖差异有统计学意义(P<0.05),且随着浓度的增加抑制越明显;Real time PCR结果显示:AGEs(50 mg/L)刺激3 d后P27 mRNA的表达水平较对照组升高,cyclinD1 mRNA的表达水平较对照组降低,差异有统计学意义(P<0.05)。结论:AGEs能抑制小鼠骨髓间充质干细胞的增殖并能改变P27 、cyclinD1 mRNA的表达。     

糖基化终末产物对牙周膜干细胞增殖及其Wnt经典信号通路相关基因表达的影响

目的:观察糖基化终末产物(AGEs)对人牙周膜干细胞(HPDLSC)增殖及其Wnt经典信号通路相关基因DKK-1、β-catenin表达的影响。方法:体外组织块法和有限稀释法克隆化培养HPDLSC,并与100μg/mL AGEs共同培养,通过细胞克隆形成率、细胞生长曲线观察AGEs对HPDLSC增殖能力的影响;RT-PCR和Western Blot检测实验组和对照组DKK-1、β-catenin mRNA以及核蛋白β-catenin的表达量。结果:经100μg/mL AGEs刺激的HPDLSC,其克隆形成率、增殖速度以及β-catenin mRNA和核蛋白β-catenin的表达量均明显低于对照组(P<0.05);而DKK-1 mRNA则明显高于对照组(P<0.05)。结论:AGEs能抑制HPDLSC的增殖及其Wnt经典信号通路。     

糖基化终末产物对人牙周膜干细胞骨向分化能力影响的研究

目的:探讨糖基化终末产物(AGEs-HSA)对人牙周膜干细胞(HPDLSC)骨向分化能力的影响。方法:体外组织块法和有限稀释法克隆化培养牙周膜干细胞,流式细胞仪检测牙周膜细胞表型分子CD44、CD146、stor-1、CD90,对其进行干细胞鉴定,将培养出的牙周膜干细胞与不同浓度的AGE-HSA共同培养,并矿化诱导后茜素红染色观察钙结节形成情况、碱性磷酸酶染色观察ALP活性、实时定量聚合酶链反应(real timePCR)检测成骨基因表达情况。结果:流式细胞仪细胞表型分析CD44、CD146、stor-1、CD90表达呈阳性。成骨诱导21 d后茜素红染色,对照组和实验组均出现不同程度的矿化结节,定量分析显示1、10、100、200μg/mLAGEs组矿化能力均比对照组低,差异均有统计学意义(P<0.05);不同浓度的实验组之间矿化能力均有统计学差异(P<0.05),且随着AGEs浓度的升高,矿化能力逐渐降低。成骨诱导7 d ALP染色比较发现各实验组均比对照组减弱。成骨诱导1周后RT-PCR检测各实验组的成骨基因ALP、Runx-2、Col-1、Runx-2 mRNA表达水平均较对照组低,差异有统计学意义(P<0.05);不同浓度的实验组之间各成骨基因的表达也有统计学差异(P<0.05)。结论:AGEs能抑制HPDLSC的骨向分化,并在一定范围内呈浓度依赖性。     

糖基化终末产物对人牙周膜干细胞骨向分化过程中的Wnt经典信号通路研究

目的 探讨Wnt经典通路相关因子Dickkopf蛋白1（DKK-1）、β-链蛋白（β-catenin）在糖基化终末产物（AGEs）介导的人牙周膜干细胞（hPDLSCs）骨分化过程中的变化。方法 通过体外组织块法和有限稀释法克隆化培养获取hPDLSCs,实验分两组：正常hPDLSCs组（N-hPDLSCs组）和AGEs刺激的正常hPDLSCs组（A-hPDLSCs组）。对2组细胞成骨矿化诱导后行碱性磷酸酶（ALP）和茜素红染色;实时聚合酶链反应（real time PCR）检测成骨基因,以及Wnt经典通路中相关因子DKK-1、β-catenin;Western blot检测相关成骨蛋白、细胞核蛋白β-catenin。结果 成骨诱导后,A-hPDLSCs组ALP染色明显浅于N-hPDLSCs组;茜素红染色A-hPDLSCs组钙化结节少于N-hPDLSCs组;real time PCR与Western blot的结果显示A-hPDLSCs组BSP、ALP、Runx-2的表达都较低,差异有统计学意义（P<0.05）。Wnt经典信号通路中相关因子：A-hPDLSCs组β-catenin表达高于N-hPDLSCs组,A-hPDLSCs组DKK-1表达明显低于N-hPDLSCs组,并且Weston blot显示A-hPDLSCs组核蛋白β-catenin的表达高于N-hPDLSCs组。结论AGEs可以使hPDLSCs骨向分化过程中Wnt经典通路的抑制因子DKK-1下调,细胞核中的β-catenin表达升高,激活了Wnt经典通路,并且抑制了骨分化。     

糖基化终末产物介导的牙周膜干细胞成骨分化过程中Wnt经典信号通路相关作用机制的研究

目的:探讨人牙周膜干细胞(human periodontal stem cells,HPDLSCs)成骨分化过程中在糖基化终末产物(AGE-HSA)介导下Wnt经典通路β-catenin的变化.方法:体外组织块法和有限稀释法克隆化培养牙周膜干细胞,流式细胞仪进行干细胞表型分子鉴定后,根据不同刺激环境随机分为OS组(单纯成骨诱导对照组)、OSA组(成骨诱导液+10 μg/mL AGEs)、OSDKK-1组(成骨诱导液+100 μg/mL DKK-1)、OSA+ DKK-1组(成骨诱导液+ 10 μg/mL AGEs+ 100 ng/mL DKK-1)4组,并进行相应的诱导培养.诱导培养7d后,碱性磷酸酶染色检测ALP活性;RT-PCR检测Wnt经典通路基因3-catenin mRNA以及成骨相关基因Runx2、ALP mRNA的表达变化情况;Western Blot检测细胞核蛋白β-catenin和细胞总蛋白Runx2的表达变化情况.结果:纯化的人牙周膜干细胞各表型分子CD29、CD90、CD146、stro-l均阳性表达,ALP染色结果显示:OSA组颜色最浅,OSDKK-1组颜色最深,OSA+ DKK-1组颜色介于两者之间;RT-PCR及Western Blot结果显示:与OS组相比,OSDKK-1组β-catenin的表达水平明显降低,Runx2、ALP的表达水平明显升高(P＜0.05),表明DKK-1抑制了经典wnt通路,而使HPDLSCs的成骨能力增强;而OSA组β-catenin的表达水平明显升高,Runx2、ALP表达水平明显降低(P＜0.05),表明激活了经典wnt通路,而使HPDLSCs的成骨能力下降;当联合加入AGEs和DKK-1(OSA+ DKK-1组)时,成骨能力与OSDKK-1组相比明显降低,而与OSA组相比明显升高(P＜0.05).结论:在HPDLSCs成骨分化过程中,抑制经典wnt通路可以促进其骨向分化;而10 ng/mL的AGEs可通过激活wnt经典通路从而抑制其成骨分化.     

微小RNA-17在糖基化终末产物刺激下人牙周膜干细胞骨向分化过程中的调控作用

目的 检测微小RNA-17（mir-17）在糖基化终末产物（AGEs）刺激下人牙周膜干细胞（HPDLSCs）骨向分化过程中的表达,并分析其对该过程的影响。方法 体外组织块法和有限稀释法克隆化培养HPDLSCs。实时定量聚合酶链反应（real time PCR）检测实验组细胞在骨向分化过程中不同时间点mir-17的表达;采用细胞转染技术过表达和抑制mir-17的表达,real time PCR和Western blot分别检测转染前后其成骨基因mRNA水平和蛋白水平的表达情况。结果 成骨诱导3、7、14 d后,对照组和实验组mir-17的表达均下调,差异有统计学意义（P<0.05）。上调mir-17后,与对照组相比,实验组骨涎蛋白（BSP）、碱性磷酸酶（ALP）、Runt相关转录因子-2（Runx-2）mRNA表达水平以及Runx-2蛋白水平均明显降低;下调mir-17后,实验组BSP、ALP、Runx-2 mRNA表达水平以及Runx-2蛋白水平均高于对照组。结论 AGEs通过影响HPDLSCs骨向分化过程中mir-17的表达从而抑制了HPDLSCs的骨向分化。     

糖基化终产物对人牙周膜细胞MMP-3及TIMP-1表达的影响

目的:探讨糖基化终产物(AGEs)对人牙周膜细胞MMP-3及TIMP-1蛋白表达的影响,进一步阐明糖尿病牙周病发病过程中细胞外基质代谢调节的分子机制.方法:将糖基化终产物修饰的人血清白蛋白与人牙周膜细胞在体外共同培养,用免疫荧光法及ELISA技术检测人牙周膜细胞MMP-3、TIMP-1蛋白表达.结果:人牙周膜细胞在体外表达MMP-3,培养3d后,MMP-3表达明显增强,与对照组相比具有显著性差异.而TIMP-1表达减弱,与对照组相比不具有显著性差异.结论:糖基化终产物可显著影响人牙周膜细胞MMP-3的表达,为AGEs参与糖尿病牙周病发病机制提供了直接证据.     

脂多糖对人牙周膜干细胞增殖及炎性因子表达的影响

目的 观察牙龈卟啉单胞菌脂多糖（LPS）对人牙周膜干细胞（HPDLSCs）增殖及炎性因子表达的影响。方法 培养和鉴定HPDLSCs。实验分为3组,A组采用含有10 μg•mL-1 LPS的α-MEM培养液培养HPDLSCs,B组采用含有10 ng•mL-1 LPS刺激单核细胞的上清液培养HPDLSCs,C组采用α-MEM培养液培养HPDLSCs。MTT法检测HPDLSCs的增殖能力,逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）检测HPDLSCs白细胞介素-1β（IL-1β）、白细胞介素-6（IL-6）和肿瘤坏死因子-α（TNF-α）mRNA的表达。结果 HPDLSCs具有克隆形成能力和骨向及脂向分化能力。与C组相比,A组和B组均抑制HPDLSCs的增殖,且B组比A组的抑制作用更明显（P<0.05）;A组和B组IL-1β、IL-6和TNF-α mRNA的表达均增加,且B组比A组增加更明显（P<0.05）。结论 牙龈卟啉单胞菌可通过LPS直接或间接地一方面抑制HPDLSCs的增殖,另一方面增加炎性因子的表达,从而加重牙周炎症组织的损伤,延缓牙周组织的自我修复。     

淫羊藿苷对人牙周膜细胞增殖及骨向分化的影响

目的：探讨淫羊藿苷对人牙周膜细胞增殖及骨向分化的影响,为淫羊藿苷在治疗牙周病方面的应用提供一定依据。方法：体外培养人牙周膜细胞,矿化诱导条件下将第3代细胞与10～0.001mg/L,6个浓度的淫羊藿苷作用,通过噻唑蓝（MTT）比色法、ALP活性测定及BSP表达水平,反应其对人牙周膜细胞增殖及分化的影响。结果：作用24h,各药物浓度均能促进人牙周膜细胞增殖（P〈0.05）。作用48h,1～0.001mg/L组可促进人牙周膜细胞增殖（P〈0.05）。作用72h,0.1～0.001mg/L组可促进人牙周膜细胞增殖（P〈0.05）,10mg/L组抑制人牙周膜增殖（P〈0.05）;作用72h,1～0.001mg/L组可促进人牙周膜碱性磷酸酶（ALP）活性（P〈0.05）;作用72h,0.1～0.001mg/L组的BSP表达水平较对照组显著增加（P〈0.05）。结论：淫羊藿苷在一定浓度范围内可促进人牙周膜细胞增殖及骨向分化。     

壳聚糖膜对人牙周膜细胞体外增殖的影响

目的　研究壳聚糖膜在体外培养条件下对人牙周膜细胞增殖的影响。方法　制备用于引导性组织再生的壳聚糖膜。体外培养人牙周膜细胞 ,用酶动力学观察在壳聚糖膜、聚四氟乙烯膜、壳聚糖膜浸出液及空白对照 4种条件下 ,人牙周膜细胞增殖的情况。结果　壳聚糖膜组的人牙周膜细胞增殖高于其他组 (P <0 .0 1) ,壳聚糖膜浸出液组人牙周膜细胞增殖高于聚四氟乙烯膜组和空白对照组 (P <0 .0 5 ) ,聚四氟乙烯组与空白对照组差异无显著性 (P >0 .0 5 )。结论　体外培养时 ,壳聚糖膜可以促进人牙周膜细胞增殖。     

内皮素促人牙周膜成纤维细胞生长作用的体外研究

目的:探讨不同浓度内皮素-1(ET-1)对人牙周膜成纤维细胞(human periodontal ligament fibroblastcells,HPLFs)增殖和分化的影响,为进一步探讨正畸牙齿移动的生物学机制奠定基础。方法:采用HPLFs体外培养技术和四唑盐(MTT)显色分光光度法及生化检测法观察ET-1对人牙周膜成纤维细胞增殖和分化的影响。结果:与对照组相比,10-8mol/L组ET-1对HPLFs具有显著的促增殖作用(P<0.01),10-6mol/L组ET-1对HPLFs的增殖具有明显的抑制作用(P<0.01)。ET-1对HPLFs的分化没有影响。结论:ET-1为促HPLFs生长因子,但是对细胞分化不产生影响,可能在正畸过程中牙周组织的改建中发挥作用。     

bFGF与米贝拉地尔对人牙周膜成纤维细胞增殖的调节

目的:研究成纤维细胞生长因子(bFGF,以下用B代表)与米贝拉地尔(Mibefradil,以下用M代表)这两种药物对人牙周膜成纤维细胞(HPLFs)增殖的调节作用。方法:B分10.0、20.0、30.0 μg/L 3种浓度(分别为B1、B2、B3),M分2.5、5.0、10.0 μmol/L 3种浓度(分别为M1、M2、M3),再按加药时间分为1 d组、2 d组和3 d组,用WST法检测两种药物单独使用和按先后不同顺序联合使用后HPLFs的增殖率。结果:两种药物单独使用可分别起到促进和阻滞细胞增殖的效果,但是B作用时间过长细胞表现为增殖受阻滞。其中,B3作用1 d组细胞增殖率最高(P<0.05),M2作用1 d组细胞增殖率最低(P<0.05)。M仅对加用B3的细胞有明显阻滞作用,与单独使用B3的细胞增殖率有显著性差异(P<0.05)。另外,只有B1不能改变细胞加用M后增殖受阻滞的现象。所有联合用药后的细胞增殖率均与正常细胞增殖率无统计学差异。结论:bFGF与Mibefradil单独使用有各自的最佳作用浓度和作用时间。除过度增殖状态外,HPLFs增殖状态很难受到阻滞,并且处于增殖受阻滞状态的细胞很容易恢复增殖状态,以维持HPLFs不断处于增殖平衡状态。     

模拟微重力培养环境下牙周膜干细胞生长状态的研究

目的探讨模拟微重力培养体系下人牙周膜干细胞（human periodontal ligament stem cells,HPDLSCs）的生长特点。方法在体外用有限稀释法克隆化生长获得HPDLSCs,接种于葡聚糖微载体,观察在旋转微重力细胞培养环境下与普通重力环境下细胞生长状态的差异。结果利用克隆生长法成功获取具备多向分化潜能的HPDLSCs,在微重力环境下的微载体表面细胞多呈半球形,少数铺展为不规则扁平形或长梭形,与普通重力环境相比,细胞生长速度明显加快。结论三维微重力培养环境可以迅速获得大量的HPDLSCs,为构建工程化牙周组织奠定了实验基础。     

人牙周膜干细胞的初步鉴定及体外成骨诱导

目的：体外培养、鉴定人牙周膜干细胞（periodontal ligament stem cells,PDLSCs）并定向诱导分化为成骨细胞,探讨人PDLSCs的多向分化潜能：方法：体外分离、培养人牙周膜细胞,待细胞达一定量后用有限稀释法进行克隆化培养,筛选鉴定牙周膜干细胞（PDLSC）,矿化诱导培养21d后检测钙结节形成情况、ALP活性,免疫细胞化学检测骨涎蛋白（BSP）、Ⅰ型胶原表达,RT—PCR检测ALP、BSP mRNA表达。结果：人PDLSCs体外诱导培养21d后可见钙结节形成,成骨细胞相关蛋白及mRNA均阳性表达。结论：人PDLSCs在体外诱导条件下具有成骨潜能。     

TP对脂多糖介导人牙周膜成纤维细胞细胞间黏附分子-1表达的影响

目的: 检测人牙周膜成纤维细胞(human periodontal ligament fibroblasts,HPDLF)在脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)介导下细胞间黏附分子-1﹙intercellular adhesion molecule-1,ICAM-1﹚的表达,探讨TP(tea polyphenols,TP)对其表达的影响。方法: HPDLF采用改良组织块法体外培养,将HPDLF随机分成LPS组、TP100组、TP200组,用酶联免疫吸附试验法(enzyme linked immuosorbent,ELISA)检测不同浓度TP对LPS介导下HPDLF分泌ICAM-1的活性。实时定量聚合酶链反应(real-time quantitative polymerase chain reaction,Real-time PCR)检测ICAM-1 mRNA的表达。结果: 在LPS干预下,不同时间不同浓度的TP影响下均可抑制ICAM-1分泌,其活性降低,与LPS组比较差异有统计学意义(P<0.05);且ICAM-1 mRNA表达水平显著降低,与LPS组比较差异有统计学意义(P<0.05)。结论: TP对ICAM-1的抑制作用明显,100 μg/mL TP对其的抑制作用更显著,提示TP的抗炎机制可能与抑制ICAM-1有关。     

High Glucose Concentrations Suppress the Proliferation of Human Periodontal Ligament Stem Cells and Their Differentiation Into Osteoblasts

Background: Diabetes mellitus (DM) is a major risk factor for periodontal disease and affects various cellular functions. Periodontal ligament stem cells (PDLSCs) play an important role in periodontal tissue regeneration; however, the effect of hyperglycemia on PDLSCs is unclear. The aim of this study is to investigate whether hyperglycemia affects periodontal tissue regeneration, using human PDLSCs and high‐glucose medium as a model of DM. Methods: PDLSCs were obtained from healthy adult human mandibular third molars. Cell proliferation, osteoblastic differentiation, and proinflammatory cytokine expression were investigated by culturing PDLSCs in media supplemented with four different glucose concentrations representative of control patients (5.5 mM), patients with postprandial or controlled DM (8.0 mM), and patients with uncontrolled DM (12.0 and 24.0 mM). The molecular effects of hyperglycemia on PDLSC physiology were examined with a focus on the nuclear factor (NF)‐(κB signaling pathway. The involvement of NF‐κB was investigated with a specific NF‐κB inhibitor in PDLSCs under hyperglycemic conditions. Results: High glucose levels inhibited PDLSC proliferation and differentiation into osteoblasts but induced NF‐κB activation and subsequent interleukin (IL)‐6 and IL‐8 expression. Treatment with an NF‐κB inhibitor rescued the defects in cell proliferation and osteoblastic differentiation and inhibited the IL‐6 expression caused by the high‐glucose environment. Conclusion: The results of this study demonstrate that hyperglycemia inhibits human PDLSC proliferation and osteoblastic differentiation.