构建过表达hBMP-7基因重组腺病毒及体外转染犬骨髓基质细胞的研究

目的：构建携带人骨形态发生蛋白7（hBMP-7）基因的重组腺病毒载体,体外转染犬骨髓基质干细胞（dMSCs）,检测hBMP-7的表达。方法：利用AdEasy腺病毒表达系统,体外构建高效表达hBMP-7重组腺病毒载体,酶切电泳鉴定后体外转染dMSCs,检测转染情况及目的基因的表达。结果：酶切鉴定表明pAd-hBMP-7已成功构建,体外可高效转染dMSCs,RT-PCR方法及免疫细胞化学检测表明hBMP-7可在dMSCs中表达。结论：成功克隆hBMP-7基因并构建重组腺病毒表达载体,证实了其在dMSCs中的表达,为火器伤致颌骨缺损的早期局部基因治疗打下基础。     

Interpore 500R复合人骨髓基质干细胞构建组织工程骨

目的：研究可吸收性珊瑚羟基磷灰石（Interpore 500R）作为骨组织工程支架材料的特点。方法：取人骨髓基质干细胞于含100ml/L胎牛血清的DMEM培养液中培养，并向成骨细胞诱导。将细胞与可吸收性珊瑚羟基磷灰石复合，通过扫描电镜观察细胞附着情况，共聚焦显微镜观察I型胶原的分泌。同时将细胞/Interpore500R复合物植入裸鼠体内构建骨组织。40d后取裸鼠标本组织切片、HE染色观察成骨情况。结果：骨髓基质干细胞在可吸收性羟基磷灰石表面附着良好，可分泌I型胶原，在裸鼠体内形成组织工程骨。结论：可吸收性羟基磷灰石生物相容性好，细胞附着后仍继续保持成骨细胞特性，并可形成骨组织。作为骨组织工程的支架材料，应用前景良好。     

自体骨髓基质干细胞-珊瑚羟基磷灰石修复下颌骨节段缺损的实验研究

目的应用骨髓基质干细胞（BMSCs）复合珊瑚羟基磷灰石（CHA）构建组织工程化骨，修复犬下颌骨节段性缺损。方法体外分离培养，成骨诱导扩增犬BMSCs，将第2代细胞复合CHA后修复5只犬自体下颌骨右侧3cm的节段缺损；6只犬植入单纯CHA作为对照，术后12、26、32周通过影像学、大体形态、组织学和生物力学的方法检测骨缺损的修复效果。结果BMSCs-CHA复合物生长良好。随时间延长，X线片和CT显示实验组连接处骨痂形成，实验对照组连接处始终愈合较差；32周大体观察实验组骨修复较好，组织学显示有板层骨形成，连接处骨性愈合，实验对照组有编织骨形成，连接处纤维愈合。实验组与正常对照组下颌骨力学强度差异无统计学意义。结论自体成骨诱导BMSCs复合CHA形成的组织工程化骨可修复犬下颌骨节段缺损。     

组织工程方法进行特定形态骨组织构建的研究

目的 用组织工程方法构建人下颌骨升支外形的骨组织。方法 体外培养、扩增、诱导兔骨髓基质干细胞（MSCs）,细胞长满后用基因重组人骨形成蛋白-2诱导 3天;收集细胞,按 5×107/ml的浓度混匀至 1.5％藻酸钠溶液中,然后接种于人下颌骨升支外形的多孔珊瑚中,以CaCl2固化后,植入裸鼠背部皮下组织中,于植入术后1、2个月取材,通过大体标本、X线检查、组织学检查观察新骨的形成情况。结果2月时形成的组织在裸鼠背部界限清晰,取材后观察珊瑚表面有坚硬组织形成,形状与支架材料的外形基本一致,X线检查证实珊瑚已有明显吸收,在其表面有明显X线组射影形成;组织学检查表明,在珊瑚表面及内部的孔洞内均有大量新骨形成,新骨形成过程为软骨内成骨。结论 用组织工程方法可以构建出特定形态骨组织,因此适于进行颌面部骨缺损的修复。     

纳米羟基磷灰石复合胶原材料负载骨髓基质干细胞修复颅骨极限缺损的实验研究

目的:探讨纳米羟基磷灰石复合胶原材料(nHAC)负载骨髓基质干细胞作为组织工程骨在修复颅骨极限缺损中的作用。方法:20只新西兰大白兔随机分为复合细胞组、单纯材料组、空白对照组。复合细胞组取自体骨髓基质干细胞并扩增诱导培养后通过负压抽吸及细胞基质膜包裹将细胞与材料复合。材料植入颅骨缺损后8周取材,行大体、X线、组织学观察及灰量测量来研究它们的骨修复能力。结果:复合细胞组成骨能力最强,且材料边缘及内部均有较好的成骨,单纯材料组有部分成骨,空白对照组未修复骨缺损。结论:纳米羟基磷灰石复合胶原材料负载骨髓基质干细胞后是一种较为理想的骨替代材料。     

个体化钛支架复合珊瑚羟基磷灰石和重组人骨形成蛋白2修复兔下颌骨缺损

目的通过观察个体化钛支架复合珊瑚羟基磷灰石(CHA)和重组人骨形成蛋白2(rhBMP-2)修复兔下颌骨缺损的实验效果,探讨下颌骨个体化修复再生的途径。方法以9只新西兰大白兔为实验对象,采用磨骨术建立兔下颌骨单侧缺损模型,利用计算机辅助设计/制作、快速成型技术等设计制作兔下颌骨个体化钛修复体,再将其与CHA和rhBMP-2复合应用于兔下颌骨标准化缺损修复,通过大体标本观察、骨密度检测、生物力学测试和组织学染色对下颌骨缺损的个体化再生修复效果进行研究。结果兔下颌骨解剖形态恢复理想,生物力学测试、骨密度检测及组织学观察均显示随时间点延长成骨效果呈明显上升趋势(P<0.05),钛支架内具有大量新骨形成,新生骨组织在24周时已明显成熟。结论采用快速成型技术制作的个体化钛支架复合CHA和rhBMP-2,可望通过骨再生途径实现下颌骨缺损的个体化修复重建。     

腺病毒介导的骨形态发生蛋白-2基因转染脂肪间充质干细胞的实验研究

目的 探讨腺病毒介导的人骨形态发生蛋白-2（Ad-hBMP-2）基因转染大鼠脂肪间充质干细胞（ADSCs）的可行性及其成骨特性。方法 取4周龄SD大鼠腹股沟的脂肪组织,经体外分离培养的方法获得ADSCs,分别转染以腺病毒为载体的绿色荧光蛋白（Ad-GFP）基因和Ad-hBMP-2基因。用荧光显微镜每隔12 h观察转染Ad-GFP的细胞,并确定转染率,观察其形态变化,绘制生长曲线;利用免疫细胞化学法对转染Ad-hBMP-2的细胞作碱性磷酸酶（ALP）染色,用免疫细胞化学法作骨钙素（OC）检测确定成骨活性,Western blot法检测hBMP-2的表达。结果 12 h后荧光显微镜观察转染Ad-GFP的细胞,有52％的阳性表达细胞,48 h后转染率达95%;转染Ad-hBMP-2后倍增时间延长,ALP、OC检测为阳性表达,hBMP-2蛋白转染后48 h为阳性表达,并持续至第5代。结论 ADSCs可以作为腺病毒转染的载体,转染Ad-hBMP-2基因后有明显的成骨作用,可以作为骨组织工程的种子细胞。     

兔骨髓基质干细胞自体嚼肌内移植异位成骨实验研究

目的：观察骨髓基质干细胞成骨向分化诱导后植入嚼肌内异位成骨的过程。方法：从兔髂骨分离骨髓基质干细胞,经体外诱导分化,与磷酸三钙／羟基磷灰石（tricalcium phosphate／hydroxyapatite,TCP／HA）支架复合,植入兔自体嚼肌内,形态学、免疫细胞化学、组织学观察其成骨特征。结果：体外培养的兔骨髓基质干细胞性状稳定,经矿化诱导培养的骨髓基质干细胞表现为成骨细胞分化,表达Ⅰ型胶原蛋白,与支架材料复合植入自体嚼肌内可见成熟骨组织形成。结论：利用骨髓基质干细胞为种子细胞植入嚼肌内开展功能性组织工程化颌骨移植方法可行。     

应用GFP基因转染示踪BMSCs在组织工程下颌骨内的分化

目的：应用绿色荧光蛋白（GFP）标记技术,观察组织工程化下颌骨形成过程中种子细胞的变化与转归。方法：用GFP反转录病毒载体与疱疹性口炎病毒糖蛋白G基因（VSV-G）蛋白重组形成假病毒,高效转染犬骨髓间质干细胞（bone marrow stromal cells,BMSCs）,将其接种于珊瑚,形成细胞、材料复合物,植入修复犬下颌骨标准缺损。术后32周取材,进行大体观察,组织学观察组织结构,免疫组化检测GFP蛋白表达情况。结果：32周后,大体可见组织工程化下颌骨形成,Van Gieson染色示新生骨大部分为成熟骨质,免疫组化显示新骨表面有GFP阳性成骨细胞,连接处无GFP阳性细胞,,珊瑚大部分降解。结论：组织工程下颌骨结构与正常皮质骨类似,新生组织表达GFP,证实组织工程下颌骨组织的形成来源于植入细胞。     

hOPG转染对大鼠BMSCs及种植体周围成骨的影响

目的：研究体内、体外人骨保护素（hOPG）基因对大鼠骨髓间充质干细胞（BMSCs）成骨功能和种植体周围成骨的影响。方法：构建含hOPG的重组腺病毒,蛋白印迹杂交法Western Blot检测转染细胞OPG蛋白功能表达。倒置显微镜观察转染细胞形态差别,茜素红S染色鉴定转染细胞的体外成骨能力。建立大鼠股骨干骺端羟基磷灰石涂层种植体植入动物模型。植入种植体前,实验组于植入体窝注入10μL的病毒悬浮液;对照组注入10μL的PBS。4周后取材,HE染色,光镜下观察,定量分析。结果：Western blot结果显示OPG在蛋白水平高表达;茜素红S染色转染组和未转染组都出现了较多散在的致密圆形矿化结节,萃取染色后分光光度检测两者无明显差异;体内实验显示实验组种植体周围成骨明显高于对照组。结论：体外pDC316-hOPG-EGFP成功转染大鼠BMSCs,转染hOPG基因的BMSCs能持续稳定的高表达hOPG。转染不影响BMSCs的成骨活性。种植体周围注射hOPG具有促进种植体周围成骨的作用。     

重组人骨保护素抑制破骨细胞及促进羟磷灰石修复去势大鼠下颌骨缺损的研究

目的 探讨转染人骨保护素（hOPG）基因的大鼠骨髓间充质干细胞（rBMSCs）复合羟磷灰石（HA）支架对去势大鼠下颌骨缺损的修复作用。方法 将重组腺病毒pDC316-hOPG-EGFP转染rBMSCs,蛋白质印迹法和骨磨片试验分别检测hOPG的表达水平和抑制破骨细胞功能;构建骨质疏松大鼠模型,分别将HA支架、未转染rBMSCs复合HA支架、转染rBMSCs复合HA支架植入大鼠下颌骨骨缺损,6周后通过抗酒石酸酸性磷酸酶、苏木精-伊红染色检测骨缺损区破骨细胞及骨修复情况。结果 体外携载有hOPG基因的腺病毒成功转染rBMSCs,转染后的rBMSCs表达具有抑制破骨细胞活性功能的hOPG;表达hOPG的rBMSCs复合HA支架后骨缺损处破骨细胞明显减少,成骨增多。结论 转染hOPG基因的rBMSCs在体内外均具有抑制破骨细胞功能的作用,且转染rBMSCs复合HA支架可促进骨质疏松大鼠的下颌骨缺损修复。     

基因修饰的组织工程化骨修复骨质疏松症骨缺损的实验研究

目的 探讨人类骨形成蛋白2（hBMP-2）基因修饰的组织工程化骨修复骨质疏松症者骨缺损的可行性及方法。方法24只6个月龄雌性SD大鼠建立去势模型，按体重编号，随机分组。3个月后实验组骨髓问质干细胞（BMSC）转染hBMP-2质粒，对照组未作干预，在体外构建自体细胞组织工程化骨，植入下颌骨缺损区。结果术后4周时实验组有新生骨质形成，8周时成熟骨基质形成；对照组新生骨质数量明显少于实验组，且材料边缘及中央处有脂肪样结构形成。结论hBMP-2基因修饰的组织工程化骨可用于骨质疏松症者骨缺损的治疗。     

The use of tissue-engineered bone with human bone morphogenetic protein-4-modified bone-marrow stromal cells in repairing mandibular defects in rabbits

In this study, the capacity of hBMP-4 gene therapy combined with tissue-engineering techniques to improve the repair of mandibular osseous defects in rabbits was explored. A mammalian plasmid vector expressing enhanced green fluorescent protein-human bone morphogenetic protein-4 (pEGFP-hBMP-4) was initially constructed through subcloning techniques. Bone-marrow stromal cells (bMSCs) from New Zealand White rabbits were cultured and either transfected with pEGFP-hBMP-4 or pEGFP, or left untransfected in vitro. Once the transfer efficiency was determined through the expression of EGFP, cells from the three groups were combined with natural non-organic bone (NNB) at a concentration of 50 x 10(6)cells/ml and placed in 15 mm x 6 mm bilateral, full-thickness, mandibular defects surgically made in 12 rabbits. Together with NNB control, there were six samples per group. Four weeks after surgery, the implants were harvested and evaluated histomorphologically. Under optimal experimental conditions, gene transfer efficiency reached a maximum of 38.2+/-9.4%. While the percentage of new bone area in the NNB control group was 8.8+/-3.1%, in the untransfected bMSC group 22.5+/-8.2%, and in the pEGFP group 18.1+/-9.0%, a significantly higher amount of 32.5+/-6.1% was observed in the pEGFP-hBMP-4 group. These results suggest that transfection of bMSCs with hBMP-4 enhances their inherent osteogenic capacity for maxillofacial bone tissue-engineering applications.     

hBMP-2基因修饰的组织工程化骨修复兔下颌骨正中缝的实验研究

目的:评价腺病毒介导的人骨形成蛋白-2(Ad-hBMP-2)基因转染的组织工程化人工骨对兔下颌骨正中缝的修复效果。方法:健康成年新西兰大白兔45只,随机分为5组,去除下颌骨正中缝的软组织,分别植入如下人工骨:Ⅰ组,Ad-hBMP-2转染的成骨细胞复合倍骼生(Bioglass)(10只);Ⅱ组,腺病毒介导的增强型绿色荧光蛋白(Ad-EGFP)基因转染的成骨细胞复合倍骼生(10只);Ⅲ组,未转染的成骨细胞复合倍骼生(10只);Ⅳ组,单纯倍骼生(10只);Ⅴ组,空白对照(5只)。于术后第2、4、8、12周末行大体观察、X线检查、组织学检查、新生骨量分析和生物力学测定。应用单因素方差分析和多样本均数两两比较的q(Newman-Keuls)检验对实验结果进行统计学分析。结果:大体观察见,4周时,Ⅰ组的兔下颌骨正中缝被新生骨组织代替,表面有皮质骨生成。X线检查,第4、8周,Ⅰ组的下颌骨正中缝内有明显骨痂形成。新生骨量分析显示,与其他组相比,Ⅰ组的新生骨量最多(P<0.01)。Ⅰ组移植骨的最大抗弯曲负荷、弯曲刚度值显著大于其他各组(P<0.01)。结论:hBMP-2基因修饰的组织工程化人工骨可以较好地修复兔下颌骨正中缝,有可能用于牙槽突裂的骨性修复。     

兔BMSCs复合β-TCP修复牙槽骨缺损后牙移动时机的探讨

目的 探讨兔骨髓间充质干细胞（bone marrow mesenchymal stem cells, BMSCs）复合β磷酸三钙（β tricalcium phosphate,β-TCP）构建的组织工程骨修复牙槽骨缺损区内开展正畸牙移动的最佳介入时机。方法 选择40只新西兰大白兔,拔除右侧下颌第一磨牙,扩大牙槽窝,形成6 mm×4 mm×8 mm的缺损,植入构建好的兔BMSCs复合β-TCP组织工程骨（实验侧）,左侧单纯拔牙（对照侧）。分别在术后2、4、8、12周进行下颌第二磨牙近中移动,加力4周后取标本。测量下颌第二磨牙的移动距离,H-E染色观察第二磨牙近远中牙周组织变化。TRAP染色,选取压力侧牙周组织进行破骨细胞计数。BMP-2免疫组织化学染色观察张力侧牙周组织平均吸光度值。采用SAS 8.0软件包对数据进行统计学分析。结果 2周、4周组实验侧牙移动距离、TRAP阳性细胞计数、BMP-2吸光度值均显著小于对照侧;8周组、12周组实验侧与对照侧的各项指标无统计学差异。结论 兔BMSCs复合β-TCP修复兔下颌牙槽骨缺损8周后是进行正畸牙移动的适宜时机。     

hBMP-7基因转染的骨髓基质细胞与BME-10X胶原膜复合物的体外构建

目的:观察人骨形成蛋白-7(hBMP-7)基因转染的骨髓基质细胞(BMSCs)与胶原膜BME-10X复合后,BMSCs在BME-10X上的生长状态。方法:利用脂质体介导法将hBMP-7基因转染Beagle犬BMSCs,传代与胶原膜BME-10X复合,荧光显微镜、扫描电镜、透射电镜观察。结果:转染细胞复合胶原膜后生长良好,24h细胞已贴附、伸展。透射电镜可见细胞与材料表面连接紧密,包膜部分增厚,形成类似半桥粒样结构。结论:hBMP-7基因转染BMSCs在胶原膜BME-10X上生长良好,hBMP-7基因转染的BMSCs与胶原膜复合物有望应用于牙周组织工程。     

钛网加强的BMSC/松质骨基质修复下颌骨缺损的实验研究

目的：观察钛网加强的骨髓基质细胞(BMSC)／松质骨基质复合物修复下颌骨缺损的能力。方法：体外培养兔BMSC经扩增，诱导分化后复合同种异体松质骨基质，植入自体下颌骨缺损区，修复骨缺损，钛网固位和加强，植入6周、12周后经X线，组织学检查，观察骨形成情况。结果：骨髓基质细胞(BMSC)/松质骨基质复合物有很强的成骨作用，实验组X线观察有骨形成，组织学染色证实有新骨形成，骨磨片显示钛网和新骨获得良好的愈合。结论：钛网加强的BMSC／松质骨基质可诱导修复兔下颌骨缺损，为组织工程方法修复骨缺损提供了新的思路。