绿色荧光蛋白转基因小鼠骨髓间充质干细胞的多向分化潜能研究

目的　研究绿色荧光蛋白(GFP)转基因小鼠骨髓间充质干细胞(MSCs)体外定向诱导下的多向分化潜能。 方法　取6周龄GFP转基因小鼠1只,用密度梯度离心法结合贴壁法体外培养获得GFP转基因小鼠骨髓MSCs有 限细胞系(GFP-MSCs)。取第3代GFP-MSCs进行体外多向分化诱导:成骨诱导后进行碱性磷酸酶增殖活性检测及 茜素红钙盐染色;成脂肪诱导20 d后进行油红O染色鉴定;成神经诱导6 h后用免疫组织化学方法检测神经元烯 醇化酶(NSE)的表达。结果　GFP-MSCs经成骨诱导后ALP表达较对照组明显升高,20 d后茜素红染色可见有橘红 色钙盐沉积;经成脂诱导后油红O染色阳性;经成神经诱导后,细胞形态由梭形转变为星状细胞,NSE染色呈强阳 性表达。结论　GFP转基因小鼠骨髓MSCs在体外诱导下具有多向分化能力,对GFP稳定表达无影响,可以作为研 究MSCs多向分化潜能机制的一个有效示踪工具。     

大鼠骨髓间充质干细胞与脂肪间充质干细胞生物学特性的比较

目的:本研究旨在比较同一个体来源的脂肪间充质干细胞(Adipose tissue-derived mesenchymal stem cells,ADSCs)和骨髓间充质干细胞(Bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs)的生长特点和诱导分化能力。方法:取7～10 d SD大鼠的脂肪和骨髓,体外分离、纯化脂肪和骨髓来源间充质干细胞,分别从细胞形态、生长动力学、表面标志、分化潜能等方面进行鉴定和比较。结果:脂肪间充质干细胞的增殖速度明显大于骨髓间充质干细胞(P<0.05),两种细胞所表达的表面蛋白标志物基本相似,但脂肪间充质干细胞表面蛋白标志CD106呈阴性,而骨髓间充质干细胞CD106呈阳性。在成软骨分化中脂肪间充质干细胞弱表达Ⅱ型胶原,而骨髓间充质干细胞不表达。第5、10、15、20代ADSCs及BMSCs经成骨诱导后茜素红染色均呈阳性且有"矿化"结节形成,碱性磷酸酶活性以第5代最强,随着细胞代次的递增,碱性磷酸酶活性呈递减趋势。结论:ADSCs较BMSCs更易于分离培养及体外扩增,诱导条件下成骨、成脂、成软骨能力较强,适合作为再生医学的种子细胞。     

研究两种干细胞体外矿化过程中LIM矿化蛋白1的表达

目的 LIM矿化蛋白1(LIM mineralization protein-1,LMP-1)是一种胞内非分泌型蛋白,广泛存在于各种组织中,它不仅影响骨基质的矿化而且还是成骨细胞分化和骨形成过程中重要的调节因子。本实验通过检测LMP-1在牙髓干细胞和骨髓间充质干细胞体外矿化过程中的表达情况,来研究胞内信号转导分子LIM矿化蛋白1对牙髓干细胞和骨髓间充质干细胞体外矿化的作用,为LMP-1作为成骨调节因子,影响骨基质矿化方面的研究提供参考。方法酶消化法体外培养牙髓干细胞,用挑克隆细胞团的方法对牙髓干细胞进行纯化传代培养。密度梯度离心法体外培养骨髓间充质干细胞。两种细胞分别设置实验组和对照组。实验组培养液中加入矿化诱导液,对照组不加矿化诱导液。分别于培养3、5、7、14天检测碱性磷酸酶的活性。培养21天茜素红染色检测矿化结节形成。培养期间,采用荧光定量PCR方法检测LIM矿化蛋白1、骨形态发生蛋白BMP-2、牙本质涎磷蛋白DSPP和Ⅰ型胶原蛋白COL-1、核心结合因子RUNX-2等成骨标志基因的表达,用SPSS 17.0对结果进行统计学分析。结果培养3、5、7、14天碱性磷酸酶的活性逐渐提高,且实验组碱性磷酸酶的活性显著高于对照组。培养21天实验组可见矿化结节形成。荧光定量PCR检测到实验组及对照组各个基因均表达,且实验组表达显著高于对照组。结论发现LIM矿化蛋白1与牙髓干细胞和骨髓间充质干细胞体外矿化过程相关,推测LIM矿化蛋白1可能作为检测牙髓干细胞和骨髓间充质干细胞矿化的一个指标。     

绿色荧光蛋白转基因鼠咀嚼肌肌卫星细胞的分离、体外培养、鉴定及生物学特性的研究

目的探讨绿色荧光蛋白（GFP）转基因鼠咀嚼肌肌卫星细胞体外培养及传代对咀嚼肌肌卫星细胞GFP荧光保持的影响,从而探讨GFP转基因鼠咀嚼肌肌卫星细胞移植入野生型小鼠后是否可以作为追踪细胞转归的有效方法。方法取新生GFP转基因鼠面部咀嚼肌,分离出肌卫星细胞,体外进行原代和传代培养,建立GFP转基因小鼠肌卫星细胞系。通过倒置显微镜观察肌卫星细胞的形态、测定生长曲线等方法观察肌卫星细胞的增殖与分化能力;荧光显微镜观察GFP荧光的保持及表达;免疫细胞化学法对所获得的细胞进行骨骼肌肌动蛋白及结蛋白鉴定;DAPI进行细胞核的标记,检测培养细胞的纯度。结果体外培养的咀嚼肌肌卫星细胞增殖速度快,荧光显微 镜观察发现肌卫星细胞经传代后仍然保持其特有的GFP荧光表达。骨骼肌肌动蛋白单抗及抗结蛋白免疫细胞化学 染色显示体外培养的咀嚼肌肌卫星细胞呈阳性表达。DAPI免疫细胞化学染色显示经分离及培养后肌卫星细胞纯度较高。结论体外培养的GFP转基因鼠咀嚼肌肌卫星细胞有很强的增殖分化能力及良好的GFP荧光表达,能够作为追踪细胞来源及归宿的示踪细胞。     

逆转录病毒介导EGFP基因转染骨髓间充质干细胞及对其生物学特性的影响

目的 观测转染增强型绿色荧光蛋白基因(enhanced green fluorescent protein gene,EGFP)并稳定表达前后兔骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs)的生物学特性,探讨利用EGFP作为体内试验示踪剂的可行性.方法 利用pLEGFP-N1逆转录病毒载体质粒转染PT67包装细胞,提取病毒上清液后感染BMSCs,G418筛选及单克隆培养得到稳定表达绿色荧光蛋白的BMSCs细胞.比较转染前后BMSCs的生长曲线,细胞活性和贴壁率.结果 获得了稳定表达绿色荧光蛋白的BMSCs,其生物学特性无明显改变,荧光有效表达时间达3个月.结论 利用逆转录病毒法转染EGFP可作为BMSCs体内示踪.     

口腔组织病理学

骨髓间充质干细胞与PLGA体外附着的实验研究，牙本质胞外基质对体外血管形成的影响，端粒酶在体外培养人表皮干细胞中的表达，绿色荧光蛋白基因转染大鼠骨髓间充质干细胞的实验研究[编者按]     

兔骨髓间充质干细胞的体外分离培养、鉴定及向成骨细胞分化诱导

目的:探讨体外分离培养、鉴定兔骨髓间充质干细胞(BMSCs)的方法,并观察其向成骨细胞分化的潜能。方法:采用贴壁分离法分离培养兔BMSCs,通过细胞形态学观察和细胞表面抗原检测对细胞进行鉴定,并向成骨细胞分化诱导培养,通过钙钻法检测碱性磷酸酶表达,茜素红染色观察钙结节形成能力。结果:分离培养3d,可见贴壁细胞呈三角形、成纤维形或多角形外观,培养10～12d细胞长满瓶底,传代后细胞增殖明显加快;使用条件培养基传代培养2周,细胞呈集落生长后开始形成钙结节,茜素红染色阳性。结论:全骨髓贴壁法是一种简单实用的分离培养方法,可获得纯度较高的兔BMSCs,经过诱导后可向成骨细胞分化。     

骨纤维异常增殖症病变中骨髓间充质干细胞的分离培养及鉴定

目的:探索从骨纤维异常增殖症(FD)病变组织中分离、培养骨髓间充质干细胞(MSC)的有效方法,为研究骨纤维异常增殖症的病因及发病机制奠定基础.方法:取FD患者新鲜病变组织,将其剪碎后冲洗,获得骨髓间充质干细胞.进行培养,观察细胞形态,绘制细胞生长曲线,检测其细胞表面标志物及向成骨细胞的诱导分化能力.结果:培养的骨髓干细胞随传代次数增多,细胞形态趋向长梭形,99%的细胞表达CD44和HLA-ABC,不表达CD34;可见诱导后的MSC碱性磷酸酶染色阳性,并形成钙结节.结论:在新鲜FD骨标本中可以成功提取MSC,其在体外具有诱导成骨的能力,获取到的MSC可以满足后续实验的要求.     

牙胚细胞与骨形态发生蛋白4转染的骨髓间充质干细胞相互诱导的体外实验研究

目的:探讨牙胚细胞和骨形态发生蛋白4(BMP4)转染的骨髓间充质干细胞(BMSCs)相互间的成牙诱导作用。方法:构建骨形态发生蛋白4慢病毒载体,转染SD大鼠骨髓间充质干细胞,并将骨髓间充质干细胞和BMP4转染的骨髓间充质干细胞分别与SD大鼠牙胚细胞按1∶1比例混合培养,同时将细胞分为5组,BMSCs组、BMP4/ BMSCs组、牙胚细胞组、BMSCs/牙胚细胞组(混合组1)、BMP4/ BMSCs/牙胚细胞组(混合组2),分别采用实时荧光定量PCR和western-blotting检测五组细胞Ⅰ型胶原蛋白、成釉蛋白、牙本质基质蛋白1、同源异型盒基因1成牙相关基因mRNA水平和蛋白水平相对表达量的变化。结果:与混合组1相比,混合组2Ⅰ型胶原蛋白、成釉蛋白、牙本质基质蛋白1、同源异型盒基因1 mRNA水平和蛋白水平表达量增多,差异有统计学意义(P<0.05)。结论:牙胚细胞与BMP4转染的骨髓间充质干细胞共培养,促进了成牙相关基因的表达,可作为组织工程牙的备选种子细胞。     

CM-DiI体外标记人乳牙牙髓干细胞的可行性研究

目的: 筛选CM-DiI用于人乳牙牙髓干细胞标记的最佳浓度,并对标记后细胞的生物学行为进行评价,为下一步细胞活体移植和体内示踪打下基础。方法: 酶解组织块法培养人乳牙牙髓细胞并纯化,免疫组化鉴定细胞来源,进行细胞体外多向诱导分化能力实验。将第3代细胞分别使用浓度2 mg/L、3 mg/L及4 mg/L的CM-DiI进行标记,比较标记后细胞乳酸脱氢酶释放率及细胞增殖情况,并观察经体外多次传代后细胞荧光的表达情况。结果: 酶解组织块法可获得成集落状生长的人乳牙牙髓细胞;免疫组化确定细胞为间充质而非造血来源;细胞具有成脂、成骨及成牙本质等多向分化能力。3种标记物浓度均未对细胞乳酸脱氢酶释放及细胞增殖产生显著的不利影响;随体外多次传代,标记荧光强度逐渐减退。结论: CM-DiI操作简便、染色速度快,可有效的标记人乳牙牙髓干细胞,其中3 mg/L的标记浓度细胞毒性极小,标记效率高,在体外多次传代后荧光信号仍能稳定表达。     

新型多孔磷酸钙复合骨髓基质干细胞组织工程实验研究

目的观察新型生物材料多孔磷酸钙的生物相容性及复合骨髓基质干细胞（BMSCs）异位成骨情况。方法体外培养第2代Beagle犬BMSCs,转染绿色荧光蛋白（GFP）后与多孔磷酸钙（CPC）复合培养,获得最佳复合浓度,倒置和荧光显微镜、扫描电镜下观察BMSCs黏附和生长情况,复合体植入裸鼠皮下8周观察异位成骨。结果BMSCs转染GFP与多孔CPC复合培养1 d,细胞从材料中爬出,形态正常,7 d可见细胞伸出伪足,分泌基质;复合体可异位成骨。结论多孔CPC生物相容性好,是一种较理想的骨组织工程支架材料。     

荧光活性染料(CM-Dil)对人骨髓间充质干细胞增殖能力的影响

目的:体外分离、培养人骨髓间充质干细胞(human bone marrow derived mesenchymal stem cells,hBMSCs),探讨应用不同浓度氯甲基苯甲酰氨荧光染料(CM-Dil)对hBMSCs增殖力的影响。方法:采用Ficoll梯密度离心法分离、培养hBMSCs,并促进其分别向成骨细胞、脂肪细胞分化;应用不同浓度CM-Dil分别标记第3代hBMSCs,观察不同浓度标记下细胞的荧光强度、标记效率、活性和增殖能力。结果:采用Ficoll梯密度离心法获得的hBMSCs,成骨、成脂分化染色阳性。不同浓度CM-Dil(5、10、20、30μmol/L)在30 min内均可成功标记hBMSCs,24 h后观察标记效率均达到98%以上(P>0.05)。直到20μmol/L的标记浓度对细胞的活力、增殖能力仍没有影响(P>0.05)。结论:CM-Dil是一种简便、安全的标记骨髓间充质干细胞的方法。     

应用GFP基因转染示踪BMSCs在组织工程下颌骨内的分化

目的：应用绿色荧光蛋白（GFP）标记技术,观察组织工程化下颌骨形成过程中种子细胞的变化与转归。方法：用GFP反转录病毒载体与疱疹性口炎病毒糖蛋白G基因（VSV-G）蛋白重组形成假病毒,高效转染犬骨髓间质干细胞（bone marrow stromal cells,BMSCs）,将其接种于珊瑚,形成细胞、材料复合物,植入修复犬下颌骨标准缺损。术后32周取材,进行大体观察,组织学观察组织结构,免疫组化检测GFP蛋白表达情况。结果：32周后,大体可见组织工程化下颌骨形成,Van Gieson染色示新生骨大部分为成熟骨质,免疫组化显示新骨表面有GFP阳性成骨细胞,连接处无GFP阳性细胞,,珊瑚大部分降解。结论：组织工程下颌骨结构与正常皮质骨类似,新生组织表达GFP,证实组织工程下颌骨组织的形成来源于植入细胞。     

骨髓基质细胞修复山羊髁突软骨缺失的绿色荧光蛋白示踪

目的:采用绿色荧光蛋白(green fluorescent protein,GFP)对骨髓基质细胞体内修复髁突软骨全层缺失进行示踪观察。方法:扩增PG13细胞株,获得大量含GFP基因的假病毒液,并直接转染骨髓基质细胞(bone marrow stromal cells,BMSCs)。将含有GFP基因转染标记的BMSCs和少量软骨细胞与生物可降解材料复合后,植入山羊髁突软骨全层缺失处,1个月后应用激光共聚焦显微镜检测修复组织中GFP标记的BMSCs的分布。结果:标记的BMSCs植入关节软骨缺损1个月后,修复组织仍能高效表达GFP。激光共聚焦显微镜下显示:多数新生软骨陷窝内有GFP标记的细胞。结论:标记的BMSCs可在髁突软骨全层缺失区分化为成熟的软骨细胞,并在髁突软骨缺失的修复中发挥重要作用。     

骨髓间充质干细胞向牙髓组织迁移体内模型的构建

目的：构建一种骨髓间充质干细胞（bone marrow mesenchymal stem cells,BMMSCs）向牙髓等口腔组织迁移分化的体内模型,为进一步研究BMMSCs迁移、归巢机制从而诱导其修复、再生口腔组织奠定基础。方法：将第1代绿色荧光蛋白（Green flurensence protein,GFP）转基因小鼠的BMMSCs与野生型C57BL6小鼠的全骨髓细胞按一定比例混合后,尾静脉注射入亚致死量照射24h后的16只同品系小鼠体内（GFP-BMMSCs：2×105/只;BMCs：2×106/只）,28d后随机选取6只嵌合小鼠,检测其股骨BMMSCs中GFP＋BMMSCs细胞的比例。对同一处理组剩余小鼠右下颌磨牙牙髓施加刺激,7d后行多聚甲醛心脏灌注,并采集标本,常规脱钙处理后以自体左侧磨牙作为对照,组织学观察比较牙髓中荧光细胞数量改变。结果：嵌合模型股骨BMMSCs中GFP＋的比例为（76.32±3.46）%,口腔刺激侧牙髓中荧光细胞数量明显多于同一个体对照侧（P〈0.05）。结论：以荧光细胞作为示踪标记的骨髓移植动物可作为有效的研究模型探索骨髓间充质干细胞在体向牙髓等口腔组织迁移分化机制。     

Bone marrow‐derived cells in palatal wound healing

Oral Diseases (2010) 16 , 788–794 Objective: Myofibroblasts are responsible for contraction and scarring after cleft palate repair. This leads to growth disturbances in the upper jaw. We hypothesized that cells from the bone marrow are recruited to palatal wounds and differentiate into myofibroblasts. Methods: We transplanted bone marrow from green fluorescent protein (GFP)‐transgenic rats into lethally irradiated wild‐type rats. After recovery, experimental wounds were made in the palatal mucoperiosteum, and harvested 2 weeks later. GFP‐expressing cells were identified using immunostaining. Myofibroblasts, activated fibroblasts, endothelial cells, and myeloid cells were quantified with specific markers. Results: After transplantation, 89 ± 8.9% of mononuclear cells in the blood expressed the GFP and about 50% of adherent cells in the bone marrow. Tissue obtained during initial wounding contained only minor numbers of GFP‐positive cells, like adjacent control tissue. Following wound healing, 8.1 ± 5.1% of all cells in the wound area were positive, and 5.0 ± 4.0% of the myofibroblasts, which was significantly higher than in adjacent tissue. Similar percentages were found for activated fibroblasts and endothelial cells, but for myeloid cells it was considerably higher (22 ± 9%). Conclusions: Bone marrow‐derived cells contribute to palatal wound healing, but are not the main source of myofibroblasts. In small wounds, the local precursor cells are probably sufficient to replenish the defect.     

绿色荧光小鼠非血管化游离股骨移植的实验研究

目的:检验非血管化游离植骨块的活力,观察新骨来源和生成情况,进一步探讨非血管化游离骨移植的愈合机制。方法:取15只转染绿色荧光蛋白的C57BL/6小鼠,截取一侧5mm股骨(完整保留骨膜及部分肌肉附着),植入同近交系非荧光小鼠的5mm股骨缺损区,术后3d、1、2、3、4周连续组织学和荧光显微镜观察。结果:术后3d:移植组织及其周边表现为炎症反应:出血、炎细胞浸润、移植骨少量吸收。1周时骨吸收达到高峰,破骨细胞大量增生,未分化间充质细胞聚集,新骨开始形成。1例新生骨在术后2周开始大量增生,1例3周时逐渐矿化成熟,1例4周时新骨与余留移植骨已不易区分。部分移植肌肉和新生骨组织术后有绿色荧光表达。结论:完整保留骨膜和部分肌肉附着的非血管化游离植骨块在短期内可以部分保留自身活力。新生骨大部分源于移植骨本身,移植骨膜在新骨形成过程中起重要作用。     

Contribution of Bone Marrow–derived Cells to Reparative Dentinogenesis Using Bone Marrow Transplantation Model

IntroductionThe aim of this study was to analyze the contribution of bone marrow–derived cells (BMDCs) to reparative dentinogenesis using bone marrow transplantation (BMT) and pulp capping as an in vivo model.MethodsA chimeric mouse model was created through the injection of BMDCs expressing green fluorescent protein (GFP+ BMDCs) from C57BL/6 GFP+ transgenic donor mice into irradiated C57BL/6 wild-type recipient mice (GFP− mice). These GFP− chimeric mice (containing transplanted GFP+ BMDCs) were subjected to microscopic pulp exposure and capping with white mineral trioxide aggregate (n = 18) or Biodentine (Septodont, St Maur-des-Fossés, France) (n = 18) in the maxillary first molar. Maxillary arches from GFP− chimeric mice (with the capped tooth) were isolated and histologically processed 5 (n = 9) and 7 (n = 9) weeks after BMT. Confocal laser microscopy and immunohistochemical analysis were performed to assess the presence of GFP+ BMDCs and the expression of dentin sialoprotein, an odontoblast marker, for those cells contributing to reparative dentinogenesis in the dental pulp.ResultsConfocal laser microscopic analyses evidenced the presence of GFP+ BMDCs in close association with reparative dentin synthesized at the site of pulp exposure in GFP− mice 5 and 7 weeks after BMT. Immunohistochemical analysis revealed that GFP+ BMDCs in close association with reparative dentin expressed DSP, suggesting the contribution of nonresident GFP+ BMDCs to reparative dentinogenesis.ConclusionsThese data suggest the presence of nonresident BMDCs in reparative dentinogenesis and its contribution to dental pulp regeneration in the pulp healing process.