不同浓度葡萄糖对人牙髓细胞增殖凋亡及矿化的影响

目的:探讨人牙髓细胞(hDPCs)在不同浓度葡萄糖作用下，细胞增殖凋亡及矿化情况。方法:体外培养的第4代hDPCs分为正常组、高糖1组和高糖2组，分别用含葡萄糖浓度为0、 5.5、 40和50 mmol/L的培养基培养，21 d后CCK-8实验检测细胞存活率，流式细胞仪检测细胞凋亡率，qRT-PCR检测DMP1和DSPP mRNA相对表达量；茜素红染色观察矿化结节情况，试剂盒检测MDA含量及SOD和ALP活性，Wester blot检测Bcl-2、Bax及DSPP和DMP1蛋白相对表达量。结果:正常组矿化结节明显，其余2组矿化结节少。正常组细胞存活率、SOD和ALP活性、DMP1和DSPP mRNA相对表达量、Bcl-2以及DMP1和DSPP蛋白相对表达量均高于高糖1组(P<0.05)和高糖2组(P<0.05),而细胞凋亡率、MDA含量、Bax蛋白相对表达量均低于高糖1组(P<0.05)和高糖2组(P<0.05)，以上指标差异在高糖2组比1组更明显(P<0.05)。结论:高糖抑制人牙髓细胞增殖和矿化，可能是高糖增强氧化应激反应引起。     

永生化成牙本质细胞表达牙本质基质蛋白的实验研究

目的　探讨永生化人成牙本质细胞样细胞系hTERT-hOd-l表达牙本质基质蛋白的情况。方法　矿化液培养hTERT-hOd-l细胞5周,检测骨钙素(OC)分泌量和碱性磷酸酶(ALP)活性。采用免疫组织化学、RT-PCR和原位杂交方法检测Ⅰ型胶原、骨涎蛋白(BSP)、牙本质基质蛋白1 (DMP1)以及成牙本质细胞标志物牙本质涎磷蛋白(DSPP) 和牙本质涎蛋白(DSP)在细胞中的表达。结果　在矿化液诱导下,hTERT-hOd-l细胞ALP活性和OC分泌量升高。 hTERT-hOd-l细胞在mRNA水平上表达BSP、DMP1和DSPP,在蛋白质水平上表达DSP和Ⅰ型胶原。结论　hTERT- hOd-l细胞在体外表达牙本质基质蛋白,具有矿化的潜能。     

p38β在矿化诱导液诱导的人牙髓细胞成牙本质向分化中的作用

目的研究p38β丝裂原激活的蛋白激酶(MAPK)对矿化诱导液诱导的人牙髓细胞(h DPC)成牙本质向分化的影响。方法体外培养hDPC,Western blot检测hDPC矿化诱导0、3、7、14 d后p38β蛋白表达情况;构建3条慢病毒载体p38β鄄shRNA并分别转染hDPC,Western blot及实时荧光定量聚合酶链反应(PCR)检测p38β蛋白及基因表达;设立空白对照组、矿化诱导(OM)组、OM+空载体(NC)组、OM+sh鄄p38β组共4组。成牙本质向矿化诱导1、7、14 d,实时荧光定量PCR检测成牙本质向分化指标牙本质涎磷蛋白(DSPP)、碱性磷酸酶(ALP)的基因表达;Western blot检测成牙本质向分化指标DSPP蛋白的表达;成牙本质向矿化诱导14 d,茜素红染色检测矿化结节的形成情况。结果 Western blot结果表明正常牙髓组织中存在p38β蛋白;成功构建p38β稳定低表达的hDPCs(实时荧光定量PCR显示三条序列干扰效率分别为55.4%、68.3%、54.2%);实时荧光定量PCR显示沉默p38β的hDPCs经矿化诱导后,成牙本质向分化指标DSPP、ALP基因表达水平显著降低,Western blot结果显示成牙本质向分化指标DSPP蛋白表达水平显著降低;茜素红染色结果显示,矿化诱导+sh鄄p38β组与空白对照组较另外两组的矿化结节数量明显减少。结论 p38β在OM诱导的h DPC成牙本质向分化中发挥作用。     

Cx43通过Erk1/2促进BMP-2诱导的人牙髓细胞成牙本质分化

目的:探讨骨形态发生蛋白(BMP)-2和连接蛋白(Cx) 43在促进人牙髓细胞(hDPCs)成牙本质分化过程中的联系。方法:在hDPCs中过表达Cx43并施以300 ng/m L BMP-2刺激1 h,qRT-PCR、Western blot和免疫荧光(IF)检测成牙本质分化标记物的表达变化;检测BMP-2介导的Smad1/5/9和Erk1/2通路活性,并施加PD98059(Erk1/2抑制剂)刺激1 h,检测抑制Erk1/2后过表达Cx43对BMP-2诱导的DSPP等的表达变化影响。结果:BMP-2上调hDPCs内osterix、DSPP、DMP-1、ALP和OCN RNA水平以及osterix蛋白表达,增强hDPCs中DSPP的荧光强度。过表达Cx43明显促进BMP-2诱导的hDPCs成牙本质分化。BMP-2激活hDPCs中的Smad1/5/9通路,过表达Cx43上调hDPCs中Erk1/2磷酸化水平。抑制Erk1/2明显减弱过表达Cx43对BMP-2诱导的osterix、DSPP、DMP-1、ALP、OCN mRNA表达以及osterix蛋白水平和DSPP染色强度的增强作用。结论...     

核心结合因子α1诱导人牙乳头细胞矿化的相关蛋白表达

目的 在人牙乳头细胞中探讨核心结合因子α1(core binding factor α1，cbfal)能否调控矿化相关蛋白的表达。方法 体外培养人牙乳头细胞，转染peDNA3-cbfal重组质粒，稳定表达cbfal后检测碱性磷酸酶(alkaline phosphatase，ALP)和骨钙素(osteoealcin，OC)含量，同时采用免疫组化、免疫印迹和PCR等方法观察骨桥素(osteopontin，OPN)、骨涎蛋白(bone sialoprotein，BSP)、骨连素(osteonectin，ON)、牙本质基质蛋白(dentin matrix protein 1，DMP1)、牙本质涎蛋白(dentin sialoprotein，DSP)和牙本质涎磷蛋白(dentin sialophosphopmtein，DSPP)的表达。结果 建立了稳定表达cbfal基因和蛋白的人牙乳头细胞模型PC-3，发现转染后细胞的ALP和OC含量明显增高，OPN、BSP、ON、DMP1的表达也明显增高，但未发现牙本质特异性蛋白DSP及其编码基因DSPP的表达。结论 在人牙乳头细胞中，cbfal能上调ALP和OC含量，诱导多种矿化组织特异性蛋白的表达，在牙齿发育矿化中有重要作用，提示它与牙乳头细胞分化为成牙本质细胞的启动有关。     

模拟微重力影响人牙髓干细胞的矿化能力与RhoA-Rho激酶信号通路相关性研究

目的初步研究Rho A-Rho激酶信号通路在模拟微重力(Simulated Microgravity,SMG)影响人牙髓干细胞(human dental pulp stem cells,h DPSCs)矿化过程中的作用。方法将经酶消化法分离、纯化后的人牙髓干细胞体外扩增培养,以1×106细胞接种于PLGA支架上,分别于模拟微重力下及普通重力下矿化诱导液中培养,72 h后收集细胞,采用Western Blot检测Rho A蛋白表达;此外,在重力条件下采用Rho激酶抑制剂Y-27632,以矿化诱导液培养组作为对照组,检测矿化诱导3、5、7、10d两组碱性磷酸酶(Alkaline phosphatase,AKP)活性变化,采用Western Blot检测矿化诱导10 d,成牙本质相关蛋白牙本质基质蛋白(dentin matrix protein-1,DMP-1)、牙本质涎蛋白(dentin sialoprotein,DSP)、牙本质涎磷蛋白(dentin sialophosphoprotein,DSPP)的表达,采用茜素红染色法检测矿化诱导21 d,矿化结节形成水平。结果模拟微重力下,人牙髓干细胞中Rho A蛋白的表达下调;在普通重力矿化诱导条件下,加入抑制剂Y-27632后,各时间点细胞AKP表达水平均较对照组有所降低;矿化诱导10 d,成牙本质相关蛋白DSP、DSPP、DMP-1表达明显下调,矿化诱导21 d,矿化结节形成同样有所减少。结论模拟微重力下,Rho A蛋白表达水平下调;抑制Rho激酶的表达,可降低h DPSCs矿化能力,提示Rho A-Rho激酶信号通路可能参与模拟微重力对h DPSCs矿化能力的影响。     

硅酸钙生物陶瓷对牙髓细胞体外增殖分化的影响

目的:应用硅酸钙(CaSiO3,CS)生物陶瓷作用于人牙髓细胞(human dental pulp cells,hDPCs),研究其对hDPCs增殖及向成牙本质细胞方向分化的影响。方法:从年轻健康患者(18²0岁)拔除的智齿或前磨牙牙髓组织中获取hDPCs进行培养。将质量浓度为0.2 g/mL的CS浸提液按1/2、1/4、1/8、1/16、1/32、1/64和1/128倍比稀释后作用于hDPCs。MTT实验检测不同质量浓度CS浸提液对hDPCs增殖的影响,进而筛选出最佳浓度。以最佳质量浓度(1/64倍比稀释)CS浸提液培养hDPCs 2、4 d后,Real-Time PCR检测以下hDPCs成牙本质相关基因的表达:牙本质涎磷蛋白(dentin sialophosphoprotein,DSPP)、牙本质基质蛋白-1(dentin matrix protein 1,DMP-1),Ⅰ型胶原(collagen typeⅠ,COL-Ⅰ)、骨钙蛋白(osteocalcin,OCN)、骨桥蛋白(osteopontin,OPN);培养7、14 d后碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)染色及半定量检测ALP活性。结果:最佳质量浓度(1/64倍比稀释)CS浸提液能够促进hDPCs的增殖,对牙髓细胞DSPP、DMP-1、COL-1、OPN等成牙本质相关基因的表达有较为明显的促进作用。ALP染色及半定量分析显示该浓度的CS浸提液能够提高hDPCs分泌ALP的活性。结论:最佳质量浓度(1/64倍比稀释)CS浸提液能够明显促进hDPCs的增殖,提高成牙本质相关基因的表达,进而促进hDPCs向成牙本质细胞方向分化,为后期hDPCs结合CS支架材料进行牙本质再生的研究打下基础。     

人牙髓干细胞诱导后人牙本质基质蛋白1基因转录活性的变化和意义

目的:观察人牙髓干细胞(human dental pulp stem cell,HDPSC)经矿化液诱导后牙本质基质蛋白1(dentin matrix protein1,DMP1)的表达、细胞生物学变化以及对人DMP1基因启动子转录活性的影响。方法:通过建立体外培养的HDPSC体外矿化诱导模型,运用RT-PCR、组织染色等方法检测矿化诱导后细胞DMP1 mRNA表达、细胞形态和矿化能力的变化以及对两个DMP1基因启动子重组报告基因载体pGL3-P-193~ 86和pGL3-P-505~ 86活性的影响。结果:HDPSC经矿化液诱导后,能够向成牙本质细胞方向分化,出现成牙本质细胞样细胞表型。与对照组相比较,随着诱导时间的延长,细胞内碱性磷酸酶(ALP)活性增强,较早的出现了矿化结节,说明在诱导液作用后细胞矿化能力升高。诱导后的细胞出现了DMP1 mRNA表达水平增高,pGL3-P-193~ 86和pGL3-P-505~ 86活性均出现增强的趋势,尤其以pGL3-P-505~ 86活性增强更明显。结论:矿化液可诱导HDPSC向成牙本质细胞方向分化,诱导后的细胞矿化能力增强,DMP1表达和转录活性也随之增强,提示DMP1可能参与成牙本质细胞的分化过程。     

DLK1对人牙髓干细胞增殖和成牙本质分化的影响

目的研究DLK1在人牙髓干细胞(hDPSCs)增殖分化中的作用。方法用免疫组织化学分析法来检测小鼠上颌第一磨牙中DLK1的表达。构建重组慢病毒使DLK1在hDPSCs中稳定过表达,用CCK8法和Ed U核素渗入法分别检测hDPSCs的细胞活力和增殖;hDPSCs进行成牙本质细胞向分化诱导后,通过ALP活性分析、ALP和茜素红染色,以及ALP、DSPP、DMP1等矿化相关基因的表达,研究hDPSCs的成牙本质细胞向的分化。结果 DLK1在小鼠上颌第一磨牙的成牙本质细胞和牙髓细胞中高表达,而且正常hDPSCs在成牙本质细胞向分化诱导14 d后,ALP蛋白水平增长1.6倍,DSPP增长1.16倍,DMP1增长1.42倍,DLK1增长1.54倍。hDPSCs中过表达DLK1后,相比于对照组增加了1.7倍,显著促进了细胞增殖,却抑制了其成牙本质细胞向分化。结论 DLK1在牙齿发育中发挥重要作用,DLK1过表达促进hDPSCs的增殖,但抑制其成牙本质细胞向分化。     

人脐带间充质干细胞与牙髓细胞体外共培养对细胞生物学的影响

目的: 研究人脐带间充质干细胞（human umbilical cord mesenchymal stem cells, hUCMSCs）与经骨形态发生蛋白2（bone morphogenetic protein 2,BMP2）诱导后的人牙髓细胞（human dental pulp cells,hDPCs）共培养对细胞生物学特性的影响。方法: 分别取原代培养的hUCMSCs和hDPCs,分别通过流式细胞术、成骨诱导、成脂诱导以及免疫组织化学染色鉴定细胞;使用BMP2诱导hDPCs,14 d后检查其DSPP、ALP、DMP1的mRNA表达情况;按照1∶1、1∶5、5∶1的比例直接共培养hUCMSCs与经BMP2诱导后的hDPCs,实时定量PCR检测其DSPP、ALP、DMP1、OCN、VEGF、HGF、Nanog的mRNA表达情况。根据实时定量PCR结果选取1∶1组与单独培养hUCMSCs组、hDPCs组比较,分别培养21 d后进行茜素红染色,在酶标仪上于562 nm处检测沉淀物形成情况。采用SPSS21.0软件包对数据进行统计学分析。结果: 直接共培养14 d后,1∶1细胞组的DSPP、ALP、DMP1、OCN、VEGF、HGF的mRNA表达量比单独培养的hUCMSCs组显著升高（P<0.05）,而Nanog mRNA表达量比单独培养的hUCMSCs组降低（P<0.05）。茜素红染色结果显示,1∶1组的OD值显著高于hUCMSCs组（P<0.05）。结论: 将hUCMSCs与经BMP2诱导后的hDPCs按照1∶1比例共培养,可以诱导细胞向成牙本质细胞方向分化,并促进血管生成因子的表达。     

KLF4 promotes the odontoblastic differentiation of human dental pulp cells

Introduction

Krüppel-like factor 4 (KLF4) plays an important role in cytodifferentiation and proliferation. Our previous study showed that KLF4 was specifically expressed in polarizing and elongating odontoblasts. However, the role of KLF4 in odontoblast differentiation was still unknown. The purpose of this study was to investigate the role of KLF4 in odontoblastic differentiation of human dental pulp cells (hDPCs).

Methods

hDPCs were treated with odontoblastic induction medium. Odontoblastic differentiation was determined by the detection of alkaline phosphatase (ALPase) activity and the expression of mineralization-related genes including ALP, dentin sialophosphoprotein (DSPP), and dentin matrix protein-1 (DMP-1). Also, cell proliferation ability was examined by the 5-ethynyl-2’-deoxyuridine (EdU) incorporation assay. Simultaneously, messenger RNA and protein levels of KLF4 were detected. pKLF4-IRES2-EGFP plasmid encoding full-length KLF4 was constructed to overexpress KLF4, and biologic effects of KLF4 on hDPCs were investigated by the evaluation of ALPase activity and the detection of ALP, DSPP, and DMP-1 expression and analysis of cell proliferation ability.

Results

ALPase activity and the expression of odontoblastic differentiation markers progressively increased in hDPCs cultured with odontoblastic induction medium. Meanwhile, the proliferation ability decreased in this procedure; messenger RNA and protein levels of KLF4 increased significantly on day 5 after the odontoblastic induction of hDPCs and kept increasing until day 14. hDPCs showed up-regulated activity of ALPase and the expression of mineralization-related genes, including ALP, DMP-1, and dentin sialoprotein (DSP), after KLF4 overexpression. Besides, the proliferation ability of hDPCs decreased significantly in the KLF4 overexpression group by EdU incorporation assay.

Conclusions

Our findings suggest that KLF4 is able to promote odontoblastic differentiation of hDPCs and inhibit proliferation of hDPCs.     

Effect of ginsenoside Rg1 on proliferation and differentiation of human dental pulp cells in vitro

Background:  Human dental pulp cells (hDPCs) have the potency to proliferate and differentiate into odontoblasts and play an important role in dentine formation and reparation. The aim of the present study is to evaluate the effects of ginsenoside Rg1 on the proliferation and differentiation of hDPCs. Methods:  hDPCs were incubated with different concentrations of ginsenoside Rg1 (0.1, 0.5, 2.5, 5, 10 and 20 μmol/L). The effects of ginsenoside Rg1 on the proliferative ability of hDPCs were evaluated by a fibroblast colony forming test, MTT assay and flow cytometry for cell cycle. The control group, osteogenic induction group, ginsenoside Rg1 (5 μmol/L) group and combination group were designed, and alkaline phosphatase (ALP) activity and FQ‐PCR for gene expressions of dentine sialophosphoprotein (DSPP) and dentine matrix protein 1 (DMP1) were performed to evaluate the differentiation of hDPCs. Results:  The proliferative ability of hDPCs in ginsenoside Rg1 was significantly enhanced (p < 0.05), especially in the ginsenoside Rg1 (5 μmol/L) group. ALP activity and gene expressions of DSPP and DMP1 were increased in the induction group, ginsenoside Rg1 group, and their combination group compared with the control group (p < 0.05). Conclusions:  The results indicate that ginsenoside Rg1 promotes the proliferation and differentiation of hDPCs.     

促红细胞生成素对人牙髓细胞增殖和成骨分化的影响

目的：探讨促红细胞生成素（EPO）对体外培养的人牙髓细胞（hDPCs）增殖和成骨分化的影响。方法：体外培养鉴定人牙髓细胞。使用 EPO 对在成骨诱导培养基中培养的牙髓细胞进行刺激,CCK-8检测 EPO 对牙髓细胞增殖的影响;20 U ／ml EPO 培养 hDPCs 7 d 和14 d,采用碱性磷酸酶活性（ALP）检测和茜素红染色观察 EPO 对牙髓细胞矿化的影响;利用 Real-time PCR 检测加入 EPO 后牙髓细胞成牙本质向分化相关基因的表达情况。结果：EPO 以时间和剂量依赖性方式促进牙髓细胞的增殖;20 U ／ml 的 EPO 后作用,牙髓细胞碱性磷酸酶活性显著提高（P ＜0．05）,钙结节形成明显增多;成牙本质向分化相关基因 DSPP、OCN、OSTERIX、RUNX2的表达明显上调（P ＜0．05）。结论：EPO 能促进人牙髓细胞的增殖和分化。     

组蛋白去甲基化酶KDM5A在人牙髓细胞及成牙本质细胞分化中的表达

目的探讨组蛋白赖氨酸去甲基化酶KDM5A在人牙髓细胞（hDPC）中的表达模式及成牙本质分化诱导对其表达量的影响。方法体外培养hDPC,实时荧光定量聚合酶链反应和Western blot检测第1代至第8代（P1-P8代）hDPC中KDM5A mRNA和蛋白的表达量;免疫荧光检测KDM5A在hDPC中的分布;对P3代细胞进行成牙本质分化诱导,于第7天和第14天分别检测KDM5A mRNA和蛋白的表达水平。结果体外传代培养hDPC中可检测到KDM5A的表达,KDM5A mRNA和蛋白量均呈先增加后减少的趋势;hDPC细胞质及细胞核中均表达KDM5A;成牙本质向分化诱导7和14 d,KDM5A mRNA和蛋白量高于未诱导组细胞,诱导14 d表达量高于诱导7 d（P〈0.05）。结论 hDPC表达KDM5A,矿化诱导可提高KDM5A的表达。     

MEPE基因沉默对人牙髓细胞增殖与成牙本质分化的作用研究

目的：研究细胞外基质磷酸化糖蛋白（Matrix Extracellular Phosphoglycoprotein,MEPE）基因沉默对人牙髓细胞（Human Dental Pulp Cells,hDPCs）增殖和成牙本质分化能力的影响,探讨其在牙髓损伤修复中的功能.方法：酶消化组织块法分离培养hDPCs,以lipo2000介导siRNA-hMEPE转染hDPCs,以阴性对照组和未转染组设为对照,l、3、5、7d后,CCK-8法检测细胞增殖情况;转染hDPCs后以矿化诱导液培养5、7、10d后,实时荧光定量RT-PCR检测骨涎蛋白（bone sialoprotein,BSP）、牙本质涎磷蛋白（Dentin Sialophos-phoprotein,DSPP）、骨钙蛋白（osteocalcin,OCN）、Collagen I mRNA表达水平.结果：CCK-8结果显示Si-h-MEPE转染hDPCsld后OD值下降,3d时到达最低值,且均低于未转染组与阴性对照组,3d时差异有统计学差异（P＜0.05）,未转染组与阴性对照组中,OD值持续升高,7d时到达峰值,与各自组内其他时间点比较有统计学差异（P＜0.05）;ALP活性检测结果显示,Si-h-MEPE转染hDPCs3d细胞OD值最低,且明显低于未转染组与阴性对照组（P＜0.05）,未转染组与阴性对照组hDPCsOD值呈现逐渐升高趋势,在7d时达到最大值（P＜0.05）.Si-h-MEPE转染hDPCs3d时BSP、DSPP、OCN、Collagen Ⅰ mRNA的表达量均较未转染组与阴性对照组下调（P＜0.05）.在未转染组中,BSP、DSPP、OCN、Collagen Ⅰ mRNA水平持续升高,在7d时达最高值,与3d比较差异有统计学意义（P＜0.05）.结论：MEPE基因瞬时沉默抑制hDPCs增殖、使BSP、DSPP、OCN、Collagen Ⅰ基因表达下调,ALP活性降低,与未转染组与阴性对照组比较结果提示MEPE可能通过调控hDPCs的增殖和成牙本质分化能力,在牙髓损伤修复中发挥重要作用.     

The Effect of SIRT6 on the Odontoblastic Potential of Human Dental Pulp Cells

Introduction

The aim of this study was to investigate whether SIRT6 is expressed in human dental pulp as well as the effect of SIRT6 on proliferation and odontoblastic differentiation of human dental pulp cells (HDPCs).

Methods

Immunohistochemical and immunocytochemical assays were used to detect the expression of SIRT6 in human dental pulp tissue and HDPCs. To determine the effect of SIRT6 on odontoblast differentiation, HDPCs with loss (HDPCs SIRT6 knockdown) and gain (HDPCs SIRT6 overexpression) of SIRT6 function were developed, and their proliferation ability was examined. Odontogenic differentiation of HDPCs was determined by alkaline phosphatase (ALP) activity, ALP-positive cell staining, alizarin red staining, and von Kossa staining. Mineralization-related genes, including ALP, dentin sialophosphoprotein (DSPP), and dentin matrix acidic phosphoprotein 1, were determined by real-time quantitative polymerase chain reaction. Western blot analysis was performed to detect the expression of DSPP protein.

Results

SIRT6 was found in the dental pulp tissue and HDPCs. SIRT6 knockdown decreased ALP activity in HDPCs; calcium nodule formation ability; and the expression of mineralization-related genes such as ALP, DSPP, and DMP1, whereas these were increased with the overexpression of SIRT6.

Conclusions

SIRT6 is expressed in human dental pulp and participates in the odontoblast differentiation of HDPCs.