组蛋白去甲基化酶KDM4B促进根尖牙乳头干细胞中成骨和成牙本质分化

目的 研究组蛋白去甲基化酶KDM4B对根尖牙乳头干细胞定向分化能力的影响.方法 人重组骨形成蛋白4(BMP4)刺激根尖牙乳头干细胞后检测KDM4B的表达;利用慢病毒转染过表达或者基因敲除KDM4B进行获得性或丧失性功能研究.通过检测碱性磷酸酶(ALP)活性、茜素红染色、钙离子定量分析研究根尖牙乳头干细胞体外成骨和成牙本质分化能力.结果 BMP4促进根尖牙乳头干细胞KDM4B的表达.基因敲除KDM4B抑制根尖牙乳头干细胞ALP活性及体外矿化能力、促进转录因子PPAR-gamma的表达.过表达KDM4B增强根尖牙乳头干细胞ALP活性和体外矿化能力.结论 组蛋白去甲基化酶KDM4B具有促进根尖牙乳头干细胞成骨和成牙本质分化的潜能.     

组蛋白去甲基化酶KDM6A促进骨髓间充质干细胞成骨分化研究

目的研究组蛋白去甲基化酶KDM6A对骨髓间充质干细胞成骨定向分化能力的影响。方法构建Flag-KDM6A慢病毒表达质粒。利用慢病毒转染构建稳定过表达KDM6A的骨髓间充质干细胞。碱性磷酸酶活性实验检测成骨分化早期指标-碱性磷酸酶活性。茜素红染色及钙离子定量分析检测干细胞体外矿化能力。实时：毫量RT-PCR检测成骨分化相关基因．骨桥蛋白和骨钙素的表达。结果过表达KDM6A促进骨髓间充质干细胞碱性磷酸酶活性、骨髓间充质干细胞体外矿化能力以及骨桥蛋白和骨钙素的表达。结论组蛋白去甲基化酶KDM6A具有促进骨髓间充质干细胞成骨分化的潜能,可以作为一个候选的靶基因用于骨组织工程技术,促进骨组织再生。．     

组蛋白脱甲基酶KDM2A沉默可增强根尖牙乳头干细胞成脂和软骨向分化的潜能

间充质干细胞(MSCs)是组织再生的一个可靠来源,但其定向分化的分子机制仍不清楚,这限制了MSC的应用潜能。组蛋白脱甲基酶,又称赖氨酸-特异性脱甲基酶2A(KDM2A),是含有Jmj C结构的组蛋白脱甲基酶家族的成员,该家族进化保守且表达广泛。有研究表明KDM2A能调节MSCs的增殖和成骨/成牙本质向分化。KDM2A是否参与MSCs的其它多向分化还未可知。我们的研究表明,通过短发夹RNA沉默KDM2A可以增强人根尖乳头干细胞     

BMP4对牙源性干细胞精氨酸组蛋白甲基化酶表达影响的研究

目的 探索人重组骨形成蛋白4(BMP4)对牙源性干细胞精氨酸组蛋白甲基化酶表达的影响.方法 利用BMP4对根尖牙乳头干细胞和牙周膜干细胞进行诱导,Real-time PCR检测精氨酸组蛋白甲基化酶基因家族的主要相关基因PMRT1～9的表达变化.结果 Real-time PCR结果显示50 ng/ml BMP4促进根尖牙乳头干细胞精氨酸组蛋白甲基化酶基因家族中的PRMT2、PRMT4、PRMT5、PRMT6、PRMT7和PRMT9的表达,而在牙周膜干细胞50 ng/ml BMP4只促进PRMT6的表达.结论 BMP4促进根尖牙乳头干细胞和牙周膜干细胞部分精氨酸组蛋白甲基化酶的表达,可能在牙源性干细胞成骨分化中起一定的作用.     

组蛋白去甲基化酶KDM5A在人牙髓细胞及成牙本质细胞分化中的表达

目的探讨组蛋白赖氨酸去甲基化酶KDM5A在人牙髓细胞（hDPC）中的表达模式及成牙本质分化诱导对其表达量的影响。方法体外培养hDPC,实时荧光定量聚合酶链反应和Western blot检测第1代至第8代（P1-P8代）hDPC中KDM5A mRNA和蛋白的表达量;免疫荧光检测KDM5A在hDPC中的分布;对P3代细胞进行成牙本质分化诱导,于第7天和第14天分别检测KDM5A mRNA和蛋白的表达水平。结果体外传代培养hDPC中可检测到KDM5A的表达,KDM5A mRNA和蛋白量均呈先增加后减少的趋势;hDPC细胞质及细胞核中均表达KDM5A;成牙本质向分化诱导7和14 d,KDM5A mRNA和蛋白量高于未诱导组细胞,诱导14 d表达量高于诱导7 d（P〈0.05）。结论 hDPC表达KDM5A,矿化诱导可提高KDM5A的表达。     

HOXC6同型蛋白2对根尖牙乳头干细胞成骨/成牙分化功能的影响

目的 探讨同源盒基因C6同型蛋白2对牙源性间充质细胞成骨/成牙分化的影响.方法 成骨诱导培养基诱导人根尖牙乳头干细胞体外成骨/成牙分化;逆转录病毒转染构建过表达HOXC6-ISO2稳定转染牙乳头干细胞进行HOXC6-ISO2获得性功能研究;碱性磷酸酶活性实验检测成骨/成牙早期分化指标-碱性磷酸酶活性;茜素红染色及钙离子定量分析检测干细胞体外矿化能力;实时荧光定量反转录PCR检测成骨/成牙分化相关基因-Sp7转录因子、Runt相关转录因子2和骨钙素及同源盒基因C6下游基因胰岛素结合蛋白5的表达.结果 结果显示过表达同源盒基因C6同型蛋白2明显抑制牙乳头干细胞的碱性磷酸酶活性;茜素红染色及钙离子定量分析结果显示过表达同源盒基因C6同型蛋白2明显抑制牙乳头干细胞体外矿化能力;实时荧光定量反转录PCR显示过表达同源盒基因C6同型蛋白明显抑制骨钙素的表达,并且抑制下游基因胰岛素结合蛋白5的表达.结论 同源盒基因C6同型蛋白2通过抑制下游基因胰岛素结合蛋白5抑制牙乳头干细胞体外成骨/成牙分化的功能.     

miR146a参与炎症条件下骨髓间充质干细胞成骨分化的降低及其机制研究

目的：阐明炎症对骨髓间充质干细胞成骨分化的影响及miR146a在此过程中的调控作用。方法：将骨髓间充质干细胞置于3种不同条件培养基下培养：①成骨分化诱导培养基、②成骨分化培养基联合BMP2、③成骨分化联合炎症刺激TNF（10 ng/mL）,观察其成骨分化情况。通过miRNA特异性的qRT-PCR观察miR146a在上述条件下变化情况,进而对细胞转染miR146a的拮抗体antago-miR146a观察炎症条件下骨髓间充质干细胞的成骨分化情况。结果：建立了稳定的骨髓间充质干细胞体外培养体系,在不同诱导条件下其能成骨、成脂、成软骨。BMP2能够促进MSC成骨分化,而模拟炎症刺激TNF则能抑制MSC的分化;分化条件下,miR146a表达下降;而TNF剂量依赖性能增强miR146a的表达;miR146a拮抗体则能逆转TNF引起的骨髓间充质干细胞成骨分化降低。结论：miR146a参与炎症条件下骨髓间充质干细胞成骨分化的抑制。     

组蛋白去甲基化酶Jmjd3对牙髓干细胞成牙本质向分化的影响研究

目的研究组蛋白去甲基化酶Jmjd3对牙髓干细胞(dental pulp stem cells,DPSCs)成牙本质向分化的影响。方法原代分离培养DPSCs,用流式细胞术和茜素红染色鉴定DPSCs。体外诱导DPSCs成牙本质向分化不同时间(0、3、5、7、14 d),qRT-PCR检测Jmjd3及成牙本质细胞标志物牙本质涎磷蛋白(dentin sialophosphoprotein,DSPP)、牙本质基质蛋白1(dentin matrix protein1,DMP1)的表达情况。用不同浓度(0、1、10μmol/L)的Jmjd3抑制剂GSK-J4处理DPSCs 14 d,q RT-PCR检测DSPP、DMP1的表达情况。结果原代培养的DPSCs表达间充质干细胞表面标记物CD44、CD29、CD146,体外诱导培养具有成骨分化潜能。DPSCs成牙本质向分化过程中,Jmjd3、DSPP、DMP1表达水平均上调(P<0.05),且可能具有时间依赖性。10μmol/L GSK-J4处理DPSCs可明显抑制DSPP、DMP1的表达(P<0.05)。结论Jmjd3在DPSCs成牙本质向分化过程中发挥正调节作用,且与其去甲基化酶活性相关。     

DLX5对牙源性间充质干细胞迁移及趋化作用的研究

目的 探究distal-less homeobox 5 (DLX5)对牙源性间充质干细胞(dental tissue-derived mesenchymal stem cells, DT-MSCs)迁移及趋化的作用。方法 利用逆转录病毒对根尖牙乳头干细胞(stem cells from apical papilla, SCAPs)进行转染,构建稳定过表达及敲减DLX5的细胞系。通过体外细胞划痕实验、transwell实验,探究DLX5对SCAPs迁移及趋化的影响。进一步观察DLX5过表达的SCAPs的条件培养基对牙周膜干细胞 (periodontal ligament stem cells, PDLSCs)迁移及趋化的影响。结果 ①逆转录病毒转染DLX5过表达的质粒后,DLX5在SCAPs中有效过表达;逆转录病毒转染DLX5敲减的质粒后,有效抑制了DLX5在SCAPs中的表达,与对照组相比,差异具有显著性。②过表达DLX5能明显促进SCAPs的迁移及趋化能力。③敲减DLX5能明显抑制SCAPs的迁移及趋化能力。④过表达DLX5的SCAPs的条件培养基促进了PDLSCs的迁移及趋化能力。结论 DLX5对SCAPs的迁移及趋化具有正向调控作用,过表达DLX5的SCAPs条件培养基可以促进PDLSCs的迁移及趋化能力。     

17β-雌二醇对人根尖牙乳头干细胞RANKL、OPG表达影响的研究

目的:探讨17β-雌二醇对人根尖牙乳头干细胞(stem cells from apical papilla,SCAPs)核因子-κB受体活化因子配体(receptor activator for nuclear factor-κB ligand,RANKL)、骨保护素(osteoprotegerin,OPG)表达的影响。方法:通过酶消化法分离培养SCAPs,将SCAPs分别于对照组(普通培养基+10μmol/L无水乙醇)和含0.1μmol/L17β-雌二醇的培养基培养3d和7d后,实时荧光定量PCR法和蛋白质免疫印迹法分别检测RANKL、OPG mRNA和蛋白表达。结果:17β-雌二醇刺激3d和7d组,OPGmRNA和蛋白表达均较对照组升高(P<0.01),RANKL mRNA和蛋白表达均较对照组降低(P<0.01)。结论:17β-雌二醇可能通过调节RANKL/OPG系统,参与调节SCAPs成牙/骨及破牙/骨活性。     

Human Stem Cells from the Apical Papilla Response to Bacterial Lipopolysaccharide Exposure and Anti-inflammatory Effects of Nuclear Factor I C

IntroductionStem cells from the apical papilla (SCAPs) are important for tooth root development and may be candidates for regenerative endodontic procedures involving immature teeth. The potential use of SCAPs for clinical applications requires a better understanding of their responses to bacterial challenge. We have investigated the effects of exposure of these cells to lipopolysaccharide (LPS). Inflammatory responses arising from bacterial challenges can constrain postinjury tissue regeneration and the effects of nuclear factor I C (NFIC), which plays a critical role in tooth root development. NFIC has been explored for its anti-inflammatory action in the context of endodontic treatment of immature teeth where continued root development is an important outcome.MethodsSCAPs were exposed to LPS, and the expression of Toll-like receptor-4 (TLR4), interleukin (IL)-6, IL-8, and tumor necrosis factor (TNF-α) were assessed by real-time polymerase chain reaction (RT-PCR). The pLenti6.3/v5-NFIC plasmid encoding the full-length NFIC or NFIC silencing by si-RNA (small interfering RNA) in SCAPs were measured by Western blotting or RT-PCR; the effects of NFIC on IL-6, IL-8, and TNF-α were analyzed by RT-PCR. The protein levels were subsequently measured by enzyme-linked immunoassay.ResultsLPS induced the synthesis of IL-6, IL-8, and TNF-α in SCAPs in a time-dependent manner. Pretreatment with a TLR4 inhibitor significantly inhibited LPS-induced IL-6, IL-8, and TNF-α expression. Knockdown of NFIC increased the expression of IL-6, IL-8, and TNF-α, whereas the overexpression of NFIC resulted in the suppression of the inflammatory response stimulated by 1 μg/mL LPS, especially for IL-8. Together, these data show that LPS is recognized by the transmembranous receptor TLR4 to mediate inflammatory responses in SCAPs and NFIC overexpression can suppress LPS-initiated innate immune responses.ConclusionsThe anti-inflammatory effects of NFIC overexpression provide a valuable target to dampen inflammatory responses in the infected pulp to allow tissue regeneration to occur.     

不同浓度黄芩苷对人根尖乳头干细胞成骨分化的影响

目的 探讨不同浓度黄芩苷对人根尖乳头干细胞（stem cells from apical papilla,SCAPs）成骨分化的影响。方法 选取具备稳定传代能力的第3代SCAPs,采用Live/Dead细胞荧光染色,检测细胞在0、10、20、50、100 μmol/L不同黄芩苷浓度干预培养24 h后的存活情况及细胞活力;然后将SCAPs分为普通培养基组（DMEM）和成骨诱导培养基组（ODM）,根据黄芩苷的不同浓度,将实验组分为5个实验亚组,依次为0、10、20、50、100 μmol/L,利用碱性磷酸酶（ALP）染色法和ALP定量检测法,研究不同浓度黄芩苷对SCAPs培养7、14 d早期成骨分化的影响。应用茜素红染色法,定量检测不同浓度黄芩苷对SCAPs培养21 d后成骨矿化的影响。利用MTT法,检测不同浓度黄芩苷对SCAPs生长的影响。采用SPSS 20.0软件包对数据进行统计学分析。结果 活/死细胞荧光染色结果表明,经不同浓度药物干预处理后,细胞活力旺盛,无明显异常;但黄芩苷药物浓度高于50 μmol/L时,细胞死亡数目有上升趋势。ALP定量检测结果显示,ODM组诱导分化第14天时,20 μmol/L浓度组的ALP活性显著高于对照组（P<0.05）,100 μmol/L浓度组的ALP活性显著低于对照组（P<0.05）。DMEM组培养14 d后,20 μmol/L浓度组的ALP活性显著高于对照组（P<0.05）。茜素红定量显示,ODM组中100 μmol/L实验组的A值显著低于对照组（P<0.05）;20 μmol/L的黄芩苷浓度组是促进SCAP生长的最适浓度。结论 高于50 μmol/L浓度的黄芩苷对SCAPs的成骨分化表现出明显抑制作用,而低浓度黄芩苷,尤其是20 μmol/L的黄芩苷对SCAPs成骨分化及细胞生长有促进作用。     

Vitamin C intake inhibits serum lipid peroxidation and osteoclast differentiation on alveolar bone in rats fed on a high-cholesterol diet

Objective

A high-cholesterol diet stimulates osteoclast differentiation, which may be induced by increased serum lipid peroxidation. The inhibition of serum lipid peroxidation by vitamin C may offer beneficial effects on osteoclast differentiation including increased expression of receptor activator of nuclear factor (NF)-κB ligand (RANKL) and NF-κB. This study investigated the effects of vitamin C intake on RANKL and NF-κB expression in periodontal tissue of rats fed a high-cholesterol diet.

Design

Twenty-four rats (8 weeks old) were divided into four groups: a control group (fed a regular diet) and three experimental groups (fed a high-cholesterol diet supplemented with 0, 1 and 2 g/l vitamin C/day) in this 12-week study. Vitamin C was provided by its addition to drinking water. As an index of serum lipid peroxidation, hexanoyl-lysine (HEL) level was determined by a competitive enzyme-linked immunosorbent assay method. Immunohistological analysis was performed to evaluate RANKL and NF-κB expression on the alveolar bone surface. The number of tartrate-resistant acid phosphatase (TRAP)-positive osteoclasts was also counted.

Results

Feeding a high-cholesterol diet increased not only the serum HEL level but also the number of TRAP-positive osteoclasts on the alveolar bone surface, with an increase in RANKL and NF-κB expression on alveolar bone surface. Intake of vitamin C reduced the serum HEL level and osteoclast differentiation, with decreasing RANKL and NF-κB expression.

Conclusions

Vitamin C intake could suppress osteoclast differentiation, including RANKL and NF-κB expression on the alveolar bone surface, by decreasing serum lipid peroxidation in rats fed a high-cholesterol diet.     

西格列汀通过阻断核因子-κB信号通路抑制脂多糖诱导的人牙龈成纤维细胞炎症反应

目的 明确西格列汀对牙龈卟啉单胞菌脂多糖(LPS)诱导的人牙龈成纤维细胞(HGF)炎症反应的影响,并探讨其发挥作用的分子学机制,为未来西格列汀在牙周炎治疗中的应用提供初步的实验依据.方法 收集临床患者健康牙龈组织标本,利用酶消化法分离培养HGF并进行细胞来源鉴定;采用细胞增殖-毒性检测试剂盒检测LPS和西格列汀与HGF...     

骨化三醇对牙龈卟啉单胞菌脂多糖诱导的人牙周膜细胞IL-8、IL-6表达的影响研究

目的    观察活性形式的维生素D——骨化三醇（1,25D）对牙龈卟啉单胞菌脂多糖（Pg-LPS）诱导的人牙周膜细胞（hPDLCs）白细胞介素（IL）-8、IL-6表达的影响。方法    取3例患者因正畸需要拔除的前磨牙牙周膜,组织块法原代培养hPDLCs,分别用0.1%无水乙醇（对照组）、10 μg/mL Pg-LPS（单纯Pg-LPS组）、10-10 mol/L 1,25D（低浓度1,25D组）、10-8 mol/L 1,25D（高浓度1,25D组）、10-10mol/L 1,25D+ 10 μg/mL Pg-LPS（低浓度1,25D联合Pg-LPS组）、10-8mol/L 1,25D+ 10 μg/mL Pg-LPS（高浓度1,25D联合Pg-LPS组）处理第5代细胞。24和48 h后收集培养基上清液,酶联免疫吸附试验（ELISA）法检测hPDLCs IL-8和IL-6的表达水平。结果    （1）10 μg/mL Pg-LPS处理hPDLCs 48 h时,其IL-8表达水平最高,为对照组的38.86倍（P＜0.001）;处理hPDLCs 24 h时,其IL-6表达水平最高,为对照组的 6.19倍（P＜0.001）。（2）1,25D 以剂量和时间依赖方式抑制hPDLCs IL-8的内源性表达。10-8 mol/L 1,25D 处理hPDLCs 48 h时,其IL-8表达水平为对照组的49.94%（P＜0.001）。（3）1,25D 显著抑制Pg-LPS诱导的hPDLCs IL-8和IL-6的表达。处理48 h时,高浓度1,25D联合Pg-LPS组hPDLCs IL-8的表达水平为单纯Pg-LPS组的71.98%（P＜0.001）;处理24 h时,高浓度1,25D联合Pg-LPS组hPDLCs IL-6的表达水平为单纯Pg-LPS组的84.51%（P = 0.003）。结论    1,25D可以抑制hPDLCs IL-8的内源性表达,并抑制Pg-LPS诱导的hPDLCs IL-8和IL-6的表达,从而可能抑制牙周炎症反应。     

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??Objective    To explore the effect of calcitriol on IL-8 and IL-6 expression in Porphyromonas gingivalis lipopolysaccharide ??Pg-LPS??-induced human periodontal ligament cells. Methods    Primary cultures of hPDLCs were established and obtained from the extracted premolars of 3 patients for orthodontic treatment. hPDLCs of were respectively treated with 0.1% absolute ethyl alcohol ??control group???? 10 μg/mL Pg-LPS ??simple Pg-LPS group??A???? 10-10 mol/L 1??25D ??low 1.25 D group??B???? 10-8 mol/L 1??25D ??High 1.25 D group??C???? 10-10 mol/L 1??25D+10 μg/mL Pg-LPS ??group D???? 10-8mol/L 1??25D+ 10 μg/mL Pg-LPS ??group E?? for 24 h and 48 h. The supernatant fluid samples were collected and the IL-8 and IL-6 concentration was determined with enzyme-linked immunosorbent assay ??ELISA?? method. Results    ??1?? The 10 μg/mL Pg-LPS exerted the highest promotion effect on the expression level of IL-8 by 38.86-folds at 48 h ??P??0.001?? and that of IL-6 by 6.19-folds at 24 h ??P??0.001?? respectively. ??2?? 1??25D down-regulated the IL-8 level in a dose- and time- dependent manner. The highest inhibition effect occurred at 48 h?? the IL-8 level of cells treated with 10-8mol/L 1??25D was 49.94% of that of the control cells ??P??0.001??. ??3?? 1??25D significantly decreased the LPS-induced IL-8 and IL-6 production. At 48 h?? 10-8mol/L 1??25D combined with Pg-LPS significantly down-regulated the IL-8 level in hPDLCs?? 71.98% of that in the cells treated with Pg-LPS alone??P??0.001??. ??4?? At 24 h?? the level of IL-6 in cells treated with Pg-LPS combined with 10-8mol/L 1??25D was 84.51% of that in cells treated with Pg-LPS alone ??P=0.003??. Conclusion    Our results suggest that vitamin D may suppress the periodontal inflammation partly by inhibiting the expressions of innate IL-8 and Pg-LPS-induced IL-8 and IL-6 in hPDLCs.     

唑来膦酸对大鼠骨髓间充质干细胞增殖及成骨分化的作用研究

目的 研究唑来膦酸对大鼠骨髓间充质干细胞（BMSCs）增殖及成骨分化的作用。方法 取大鼠BMSCs体外原代培养,使用含不同浓度（1、5、10、20 μmol·L ^-1）唑来膦酸的成骨诱导培养基干预细胞作为实验组,不含唑来膦酸的培养基干预细胞作为对照组。CCK-8检测各组细胞增殖活性;茜素红和碱性磷酸酶染色检测各组细胞成骨分化能力;实时荧光定量聚合酶链反应（qRT-PCR）检测各组细胞碱性磷酸酶（ALP）、骨形态发生蛋白2（BMP-2）、Ⅰ型胶原酶（COL-Ⅰ）、Runt相关转录因子2（Runx-2）、锌指结构转录因子（Osx）、骨钙蛋白（OCN）、骨桥蛋白（OPN）的mRNA表达量。结果 1 μmol·L ^-1唑来膦酸对BMSCs的增殖、成骨分化无影响,与对照组比较差异无统计学意义（P>0.05）。浓度大于1 μmol·L ^-1唑来膦酸抑制BMSCs的增殖和成骨分化,且抑制作用呈浓度依赖性,与对照组比较差异有统计学意义（P<0.05）。当唑来膦酸浓度为5 μmol·L ^-1时,ALP、BMP-2、COL-Ⅰ等成骨相关基因的表达量高于对照组（P<0.05）,而当唑来膦酸浓度大于5 μmol·L ^-1时,成骨相关基因的表达量低于对照组（P<0.05）。结论 低浓度唑来膦酸对BMSCs增殖和成骨分化无影响,5 μmol·L ^-1唑来膦酸抑制BMSCs增殖但促进其成骨分化,高浓度唑来膦酸抑制BMSCs的增殖和成骨分化。