口腔黏膜白斑基因表达谱中重要致病差异表达基因的筛选及分析

目的：筛选口腔黏膜白斑中重要致病差异表达基因,并对其进行相关生物信息学分析。方法：提取白斑黏膜组织的总RNA,合成单标Cy3荧光标记的cRNA,然后与含有41000个基因/ESTs序列的Agilent全基因表达谱芯片杂交,以Ratio≥2和Ratio≤0.5为阈值来筛选差异表达基因;对差异表达基因行GO（Gene Ontology）功能分类和pathway通路分析;用RT-PCR对部分差异表达基因进行验证。结果：在41000个基因/ESTs序列中,共筛选到892条差异表达基因,其中上调基因623条,下调基因269条。GO分析发现这些差异表达基因主要涉及代谢、细胞结构等12类功能基因;pathway通路分析共得到7条有显著性改变的通路,在667条已知差异表达基因中,有9条基因在以上7条通路上发生富集。对上调基因Cyp2b13和下调基因Tyms行RT-PCR验证结果与芯片结果相符。结论：口腔黏膜白斑的发生主要由Cyp2b13、Tyms、Casp3、Cc15、CXCL12、Cc124、Dhfr、Apoe、Alb基因的异常表达导致Caspase-3激活通路、趋化因子受体粘附活性通路、E2F转录因子对DNA复制调节通路、G1/S期过渡相关调控通路、脂蛋白代谢通路、花生四烯酸代谢通路、细胞色素P450代谢通路的改变,最终导致白斑的发生,因此通过对以上9条基因的靶向调控进而变所涉及的7条通路将成为预防口腔白斑的关键。     

白色念珠菌3-磷酸甘油醛脱氢酶基因的克隆及表达

目的 构建白色念珠菌3-磷酸甘油醛脱氧酶（GAPDH）的表达载体并使其在大肠杆菌中正确表达.方法 提取基因组总RNA,PCR方法获得GAPDH基因,构建其原核表达质粒pET-32a（＋）-GAPDH,转化大肠杆菌BL21菌株,经IPTG诱导产生蛋白,用SDS-PAGE和Western Blotting检测GAPDH蛋白表达情况.结果 构建的白色念珠菌GAPDH基因表达质粒经序列测定证实,与GenBank数据完全一致.双酶切鉴定证实,克隆基因正确插入pET-32a（＋）载体.在1.0 mmol·L-1的IPTG浓度诱导下表达,可观察到相对分子量51kDa的蛋白,经SDS-PAGE和Western Blotting检测证实为GAPDH蛋白.结论 实验成功克隆白色念珠菌GAPDH基因,并在大肠杆菌中正确表达,为白色念珠菌感染的候选疫苗奠定工作基础.     

巨噬细胞与三株念珠菌作用后MyD88和CARD9基因表达的研究

目的：通过检测三株不同白色念珠菌作用下,巨噬细胞激活的关键下游信号传导分子CARD9、MyD88基因表达水平以及所产生的活性氧ROS差异,探讨巨噬细胞对三株白色念珠菌杀伤能力产生差异的可能原因。方法：将骨髓来源小鼠巨噬细胞分别与三株念珠菌以l：10的比例共培养,30min、1h、2h和4h收集巨噬细胞,荧光定量PCR检测MyD88、CARD9基因的表达差异,采用流式细胞术检测所产生的ROS量。结果：RT－PCR结果显示,巨噬细胞与三株白色念珠菌共培养早期MyD88基因表达水平,3683组最高;CARD9基因表达水平,3630组最高;随着时间的增长,不同组别的MyD88基因相对表达无明显变化,而CARD9基因共培养2h相对表达量SC5314组高于3630组及3683组（P〈0．01）;4h,3683组相对表达量高于3630组、SC5314组（P〈0．01）。流式细胞检测结果显示ROS荧光强度3630组〉3683组〉SC5314组（p〈o．05）。结论：CARD9是白色念珠菌PAMPs与PRRs识别及产生抗念珠菌感染关键分子ROS信号通路的关键分子,其表达水平的差异有可能是导致巨噬细胞对不同念珠菌杀伤能力产生差异的机制之一。’     

应用RNA-Seq技术筛选唾液腺腺样囊性癌嗜神经侵袭相关差异表达基因

目的: 应用RNA-Seq技术分析与施万细胞共培养前、后的唾液腺腺样囊性癌细胞（SACC）的基因表达水平变化,明确嗜神经侵袭（perineural invasion,PNI）相关基因。 方法: 采用腺样囊性癌与SD大鼠施万细胞共培养模型,分析共培养前、后SACC细胞基因表达变化,对差异表达基因进行聚类分析、GO功能富集分析、KEGG通路富集分析,并采用qRT-PCR对其中6个关键差异表达基因进行验证。采用edgeR软件（3.12.1）进行表达差异显著性分析,将P≤0.05、差异表达倍数的绝对值大于1作为差异显著性标准。 结果: 在腺样囊性癌单独培养组与共培养组之间发现395个差异表达基因（P≤0.05,|logFC|≥1.0）,其中135个基因上调（34.2%）,260个基因下调（65.8%）。GO功能富集分析结果表明,这些PNI相关差异表达基因参与了血管再生、细胞外基质的组成、细胞增殖、凋亡和上皮形态发生;KEGG通路富集分析结果表明,这些基因参与组氨酸代谢、肿瘤坏死因子、趋化因子等细胞因子受体相互作用等重要生物学通路。利用qRT-PCR技术对其中6个关键基因进行验证,验证结果与RNA-Seq趋势一致。 结论: 得到了SACC嗜神经侵袭PNI的相关差异基因,为阐明SACC的嗜神经侵袭机制提供了实验依据。     

小鼠帽状期和钟状早期磨牙牙胚差异表达基因的初探

目的筛选小鼠帽状期(E14.5)和钟状早期(E18.5)磨牙牙胚的差异表达基因。方法分离小鼠E14.5和E18.5磨牙牙胚,采用基因芯片技术检测相关的差异表达基因。结果共得到76条差异表达基因,上调基因71条,下调基因5条。结论 E18.5磨牙牙胚,调控细胞代谢、分化、极性形成酶类,调控免疫应答相关基因,转录、翻译相关基因,信号通路的信号分子、受体以及应激反应相关基因等功能的基因表达都显著上调,而细胞凋亡相关基因、氨基酸代谢激酶等的表达下调。     

口腔扁平苔藓基因表达谱中差异表达基因初步探讨

目的筛选口腔扁平苔藓组织中的差异表达基因,并对其进行功能分类。方法用4 000种人类基因多聚酶链反应产物制成BiostarH- 40s型表达谱芯片,分离纯化正常口腔黏膜组织和口腔扁平苔藓病变组织mRNA,制备表达谱探针,用ScanArray 4000 荧光扫描仪扫描芯片荧光信号图像,分析正常口腔黏膜组织和口腔扁平苔藓组织之间差异表达的基因。结果1）在4 000条基因中,有213条基因表达差异,其中122条基因表达上调,91条基因表达下调。2）在表达上调基因中,功能分类主要包括免疫相关基因、代谢相关基因、癌基因、细胞因子、细胞信号和传递蛋白。3）在表达下调基因中,功能分类主要包括DNA结合、转录和转录因子、细胞信号和传递蛋白、免疫相关基因、细胞因子、代谢相关基因。结论口腔扁平苔藓的发生、发展过程中存在着多条不同功能基因表达调控的改变。     

2型糖尿病患者龈上菌斑致龋菌分布与功能研究

目的 探讨2型糖尿病患者口腔微生物中致龋菌群落分布特征与功能基因,提高对2型糖尿病与龋病关系的认识。方法 试验组选取空军军医大学第一附属医院内分泌科口腔健康的2型糖尿病患者（10例）;正常对照组选取社区人群中口腔健康且不患2型糖尿病受试者（10例）。采集口腔健康的2型糖尿病患者组和正常对照组的龈上菌斑样本,分别进行宏基因组学测序,对变异链球菌、乳酸杆菌、黏性放线菌、白色念珠菌等致龋菌进行生物信息学及统计学分析。结果 口腔健康的2型糖尿病患者龈上菌斑样本中变异链球菌、乳酸杆菌、黏性放线菌、白色念珠菌丰度稍低于正常对照组,但差异均无统计学意义（P>0.05）。KEGG Pathway功能代谢差异分析结果显示2型糖尿病患者龈上菌斑微生物的D-精氨酸和D-鸟氨酸代谢、生物膜形成-大肠杆菌代谢、己内酰胺降解、精氨酸生物合成等代谢通路较正常对照组丰富,而硫胺素代谢、硒化合物代谢、丙酮酸代谢等代谢通路较正常对照组降低。结论 口腔健康的2型糖尿病患者的致龋菌含量与正常对照组并无明显差异,功能基因差异代谢途径表明精氨酸代谢通路富集,有助于维持口腔微生态坏境的酸碱平衡。     

附着状态对口腔白色念珠菌ALS基因mRNA的影响

目的　比较生物膜和游离状态下,白色念珠菌ALS基因在mRNA水平上的表达差异。方法　一步法 RT-PCR观察白色念珠菌临床分离株和标准菌株,在游离状态和生物膜状态下ALS1和ALS4的mRNA的丰度差异。 结果　白色念珠菌临床分离株在生物膜状态下,ALS1和ALS4的mRNA丰度明显强于游离状态,而标准株在游离状 态和生物膜状态下,ALS1和ALS4的mRNA丰度没有显著性差异。结论　生物膜状态下的白色念珠菌,ALS基因在 转录水平的表达有增强,提示该基因在生物膜形成发展中可能有一定的作用,但其增强的程度在菌株之间可能有 较大的差别。     

口腔黏膜白斑的基因表达谱分析

目的 探讨口腔黏膜白斑(OLK)组织基因表达谱的变化及相关信号通路的改变.方法 采用 Affymetrix U133 plus 2.0基因芯片检测OLK和正常口腔黏膜差异表达基因;采用GO分析和Pathway分析等生物信息学方法进一步了解相关信号通路的改变.结果 OLK和正常黏膜组织相比存在682个差异表达基因,其中645个表达上调、37个表达下调.Pathway分析显示黏着斑通路、过氧化物酶体增殖物激活受体通路、胰岛素信号通路、紧密连接、糖原异生、脂肪细胞因子通路、细胞骨架肌动蛋白调节等通路变化较显著,其中黏着斑(Focal adhesion)通路变化最显著,该通路中的MYLPF、ACTN2、MYLK3、CAV3、IGF-1、COL11A1基因表达均有显著变化,提示Focal adhesion通路可能参与了白斑的发生发展.结论 OLK的发生是一个多基因改变、多条信号通路协同作用的过程;黏着斑通路异常可能与白斑的发生密切相关.     

舌鳞癌Tca8113细胞株干细胞相关差异表达基因的筛选及分析

目的应用抑制消减杂交（SSH）技术筛选舌鳞癌干细胞相关差异表达基因。方法以舌鳞癌Tca8113细胞株中的醛脱氢酶（ALDH）高表达（ALDHbr）细胞与低表达（ALDHlow）细胞互为实验组和对照组,进行正反向消减杂交后建立差异表达基因文库,随机挑选差异基因克隆进行测序及生物信息学分析。结果经Blast比对分析,得到62条差异表达基因;功能聚类发现多数与细胞周期调节、细胞分化等生物行为相关;信号通路分析显示有11条基因参与的12条信号通路发生显著改变。结论应用SSH技术成功筛选出了与舌鳞癌干细胞相关的一些基因,进一步研究这些基因对探索舌鳞癌干细胞特异性表面标志物具有重要意义。     

白色念珠菌ALS基因家族在生物膜形成过程中的差异表达

目的:研究白色念珠菌凝集素样粘附素(agglutinin-like sequence,ALS)基因家族成员在生物膜形成过程中的表达。方法:构建白色念珠菌标准株ATCC 10231和ATCC 90028体外生物膜模型,在生物膜形成的早期、中期和成熟期分别提取总RNA,应用半定量RT-PCR检测8个ALS基因的表达情况。结果:在生物膜形成的整个过程中,ALS1、ALS2、ALS3和ALS5持续高表达,是主要表达的粘附素基因,ALS6、ALS7、ALS9,尤其是ALS4表达较弱。ALS1、ALS2和ALS3在生物膜形成中期比在早期表达显著上调,但在成熟期表达下降。ALS基因家族成员的表达模式在菌株间无明显差异。结论:ALS1、ALS2、ALS3和ALS5在白色念珠菌体外生物膜形成过程中优势表达,对这些ALS基因的靶向抑制将为控制白色念珠菌生物膜相关疾病提供新的思路。     

Gene profile in periodontal ligament cells and clones with enamel matrix proteins derivative

AIM: Evaluate enamel matrix proteins derivative effect on gene expression profiles in cultured human periodontal ligament cell population and its clones. MATERIAL AND METHODS: Human periodontal ligament (PDL) cells were explanted. Cell cloning was performed and clones classified into fibroblastic (FB) and mineralized tissue forming (MTF) according to their capacity to express alkaline phosphatase and form mineralized tissue. All cell cultures were grown for 7 days, with and without enamel proteins added to the medium. Following RNA extraction, expression profiling was performed by hybridization with a DNA micro-array. Selected genes differed from the control at a significant level smaller than p<0.01. RESULTS: Enamel proteins induced major qualitative changes in mRNA expression in all PDL cell populations, differently affecting the entire PDL cell population and its clones. In the entire PDL cell population, enamel proteins significantly enhanced PDL cell function, with a general effect on enhanced cell functional metabolism. CONCLUSIONS: Enamel proteins enhanced gene expression responsible for protein and mineralized tissue synthesis in the entire PDL population. In the MTF clones, nucleic acid metabolism, protein metabolism and signal transduction related genes were up-regulated, while in the FB clones, up-regulated genes were related to cell adhesion, nucleic acid metabolism and signal transduction.     

饥饿状态对白念菌生物膜及滞留菌形成的影响

目的:探讨饥饿环境对白念菌生物膜形成以及其中耐药滞留菌形成的影响。方法:体外分别构建对数期、稳定期和饥饿态白念菌24 h生物膜,两性霉素B(Amphotericin B)冲击24 h,冲击前、后行活菌菌落计数(CFU),计算得出滞留菌比例并进行统计学分析,同时以共聚焦显微镜观察和分析各组生物膜形成状况。采用SPSS11.70软件包对数据进行统计学分析。结果:对数期、稳定期和饥饿态白念菌生物膜形成能力依次下降 (P<0.05),具有显著差异,前2组形成菌丝相生物膜,而饥饿态菌形成酵母相生物膜。药物作用后,滞留菌比例依次升高(P<0.05),具有显著差异。结论:营养状态对白念菌滞留菌的产生有影响,饥饿状态能够提高滞留菌的产生比例。     

Gene expression profile of compressed primary human cementoblasts before and after IL-1β stimulation

Objectives

Root resorptions due to a reduced repair function of cementoblasts are common side effects during orthodontic tooth movement (OTM). The mechanisms, which lead to an impaired cementoblast function, are not fully understood. Therefore, we aimed to investigate changes in the gene expression of cementoblasts during mechanical stimulus under inflammatory conditions.

Materials and methods

Human primary cementoblasts (HPCB) were exposed to compression for 6 h or stimulation with IL-1β for 96 h and subsequent 6 h compression. Genome-wide expression analysis was performed using microarray analysis. Prominent gene expression alterations (COX2, AXUD1, FOSB, CCL2, IFI6, and PTGES) were verified by quantitative RT-PCR (qRT-PCR) in two HPCB populations. A caspase 3/7 activity assay was used to determine caspase-3 and caspase-7 activity in stressed cells.

Results

Gene expression cluster analysis revealed apoptosis as an important process induced under both conditions. Apoptosis (pro- and anti-apoptotic) related gene expression was most relevant after pro-inflammatory stimulation and compression. qRT-PCR analysis confirmed significant up-regulation of COX2, AXUD1, and FOSB in both HPCB populations after compression, while selected genes significantly increased after pro-inflammatory stimulation and compression. Compression of cementoblasts increased caspase. The combination of pro-inflammatory stimulation and compression led to a slightly smaller increase of caspase activity.

Conclusions

Gene ontology analysis showed that compressed HPCB up-regulate genes that are associated with apoptosis. Combining compression with a pro-inflammatory stimulus (IL-1β) augmented the positive regulation of apoptosis-related pathways. The induction of apoptosis related gene expression (pro- and anti-apoptotic genes) in cementoblasts suggests an involvement of apoptosis in cementoblast regulation during OTM.

Clinical relevance

As apoptosis is induced in HPCB after compression and inflammation, it is conceivable that HPCB cell death might contribute to root resorptions due to a loss of repair activity of cementoblasts. Further studies should be conducted to clarify the implication of the identified genes on root resorptions in order to develop therapeutic strategies to prevent a shortening of roots.     

基于重水拉曼技术的氯己定对白色念珠菌 抑菌效能的研究

目的评价重水拉曼技术的普适性及氯己定(CHX)对白色念珠菌的抑菌效能。方法1)采用分光光度计测定吸光度值OD600,重水拉曼技术测定C?D ratio(重水峰所占比例)随时间的变化,探索重水对白色念珠菌生长的影响及该菌对重水的吸收规律,以评价重水拉曼技术的普适性。2)采用肉汤稀释法和重水拉曼技术,测定CHX对白色念珠菌的最低抑菌浓度(MIC)及最小代谢活性抑制浓度(MIC?MA),评价CHX对白色念珠菌生长及代谢的抑制效果。结果1)白色念珠菌在质量分数≤30%重水中,生长未受到明显抑制(P>0.05);白色念珠菌能活跃代谢重水并通过拉曼图谱检测,且C?D ratio与重水质量分数呈线性正相关关系(R^2=0.9894,P<0.05)。2)CHX对白色念珠菌的MIC为4μg·mL^-1,MIC?MA为8μg·mL^-1。在MIC下,白色念珠菌的生长受到完全抑制,但仍具有很高的代谢活性;只有达到2×MIC,即MIC?MA,该菌的代谢才能得到完全抑制。结论重水拉曼技术适用于评价药物对真菌代谢活性的影响,临床常用质量分数的CHX可完全抑制白色念珠菌的生长及代谢。     

Differential gene induction in macrophage-like human cells by two types of Porphyromonas gingivalis: a microarray study

Several studies have provided clinical evidence that FimA clonal variation may contribute to the periodontopathogenicity of Porphyromonas gingivalis (P.g.). We studied the gene expression profiling of the macrophage-like human cell line U937 after infection of two types of P.g. (fimA type I; Pg-I and fimA type II; Pg-II) using microarray. Of 1088 genes examined, 394 genes were detectable. Bioinformatics algorithms were used to analyze the detectable genes. Hierarchical clustering analysis showed that gene expression patterns of Pg-II and the control (no infection) were grouped together. K-means clustering grouped 79 genes into Pg-II dominance and 88 genes into Pg-I dominance. A large number of genes related to cell signaling, extracellular communication proteins, cell receptors (by ligands), protein turnover and cell adhesion receptors/proteins were grouped into clusters of Pg-I dominance. Our results indicate that compared with Pg-I, Pg-II induces a low host response as measured by its weak induction of gene expression.