BMP-2、bFGF基因转染的大鼠骨髓干细胞与牙胚细胞在体外混合培养对成牙基因的影响

目的:观察骨形态发生蛋白-2和(或)碱性成纤维细胞生长因子转染的大鼠骨髓干细胞(BMSCs)和牙胚细胞在体外混合培养对牙本质基质蛋白1、成釉蛋白、Ⅰ型胶原蛋白、同源异型盒基因1的影响。方法:采用实时定量PCR和Western blot的方法,检测 BMP-2和(或)bFGF对成牙基因的影响。结果:对照组、bFGF组、BMP-2组、bFGF/BMP-2组四组间,AMBN、COLLAGEN-Ⅰ、DLX1、DMP1基因在mRNA和蛋白水平表达量上存在明显差异(P<0.05)。结论:BMP2和bFGF有一定的协同交互作用,BMP2/bFGF/BMSCs/牙胚细胞可以作为构建组织工程牙的种子细胞。     

牙胚细胞与骨形态发生蛋白4转染的骨髓间充质干细胞相互诱导的体外实验研究

目的:探讨牙胚细胞和骨形态发生蛋白4(BMP4)转染的骨髓间充质干细胞(BMSCs)相互间的成牙诱导作用。方法:构建骨形态发生蛋白4慢病毒载体,转染SD大鼠骨髓间充质干细胞,并将骨髓间充质干细胞和BMP4转染的骨髓间充质干细胞分别与SD大鼠牙胚细胞按1∶1比例混合培养,同时将细胞分为5组,BMSCs组、BMP4/ BMSCs组、牙胚细胞组、BMSCs/牙胚细胞组(混合组1)、BMP4/ BMSCs/牙胚细胞组(混合组2),分别采用实时荧光定量PCR和western-blotting检测五组细胞Ⅰ型胶原蛋白、成釉蛋白、牙本质基质蛋白1、同源异型盒基因1成牙相关基因mRNA水平和蛋白水平相对表达量的变化。结果:与混合组1相比,混合组2Ⅰ型胶原蛋白、成釉蛋白、牙本质基质蛋白1、同源异型盒基因1 mRNA水平和蛋白水平表达量增多,差异有统计学意义(P<0.05)。结论:牙胚细胞与BMP4转染的骨髓间充质干细胞共培养,促进了成牙相关基因的表达,可作为组织工程牙的备选种子细胞。     

bFGF/BMP-2转染大鼠骨髓干细胞体内成牙的研究

目的: 牙胚细胞和成纤维生长因子(Fibroblast growth factor bFGF)/骨形成蛋白2(bone morphogenetic protein 2 BMP-2)联合转染的骨髓间充质干细胞 (bone marrow stem cells,BMSCs)混合培养,复合明胶海绵支架构建牙组织工程植入大鼠体内,探究其成牙能力。方法: 取健康SD大鼠128只,随机分为4组:细胞团块组;明胶海绵组;细胞团块+明胶海绵组;空白对照组,不做任何干预,均在全麻下植入大鼠肾被膜下。术后按4个时间点(5、10、14、28 d各8只)分期取材,进行大体组织观察,Masson染色和免疫组化染色。结果: 大体组织和Masson染色:术后5、10、14、28 d形态学观察显示细胞团块+明胶海绵组形成牙样组织。免疫组化:析因分析显示细胞团块+明胶海绵组在5、10、14 d DMP-1、BMP-4、DSP表达量最高且均高于其余各组,随着时间推移表达量逐渐有减小趋势,差异有统计学意义(P＜0.05)。结论: 牙胚细胞和基因转染BMSCs混合培养,复合明胶海绵构建牙组织工程的体内实验结果形成牙样组织,为组织工程牙的成功构建奠定了一定的基础。     

RFP标记及bFGF/BMP-2信号诱导的牙组织工程的体内实验研究

目的 RFP标记的牙胚细胞和b FGF/BMP-2转染的骨髓间充质干细胞混合培养,复合3D打印聚乙烯醇(PVA)/双相陶瓷骨支架(DCCP)材料构建牙组织工程的体内孵育,探究其分化能力。方法取健康SD大鼠128只,随机分为4组:细胞团块组;PVA/DCCP支架材料组;细胞团块+PVA/DCCP支架材料组;空白对照组,不做任何干预,均在全麻下植入大鼠肾被膜下。术后按4个时间点(5、10、14、28 d各8只)分期取材,进行免疫组化染色和激光共聚焦切片观察。结果免疫组化:析因分析显示细胞团块+PVA/DCCP支架材料组在5、10 d DMP-1、BMP-4表达量最高且均高于其余各组,随着时间推移表达量逐渐有减小趋势,差异有统计学意义P<0.05;DSP在各组各时间点均为阴性表达,差异无统计学意义P>0.05。激光共聚焦显微镜显示:细胞团块+PVA/DCCP支架材料组各时间点切片组织中都可观测到荧光标记的牙胚细胞。结论 RFP标记的牙胚细胞和b FGF/BMP-2转染骨髓间充质干细胞混合培养,复合PVA/DCCP支架材料,构建牙组织工程成活并分化,其分化机制有待进一步研究。     

bFGF重组慢病毒对羊骨髓间充质干细胞成骨功能影响的研究

目的:探讨碱性成纤维生长因子(basic Fibroblast Growth Factor,bFGF)基因转染对体外培养的骨髓间充质干细胞(Bone Marrow mesenchymal Stem Cells, BMSCs)的增殖和骨向分化的影响,为构建组织工程骨的种子细胞做理论依据。方法:构建携带人bFGF基因的慢病毒载体,转染诱导后羊的BMSCs,得到bFGF转染组,选择未转染的BMSCs为对照组。两组细胞采用实时定量PCR技术和蛋白质印迹法技术检测Collagen-Ⅰ、OC、OPN等成骨相关基因的mRNA水平及蛋白水平相对表达量的变化情况。结果:bFGF组OPN和Collagen-Ⅰ基因mRNA水平表达量较对照组增高,差异有统计学意义(P<0.05),两组细胞在OC基因mRNA水平表达量上差异无统计学意义;bFGF组细胞在OPN、OC和Collagen-Ⅰ基因蛋白水平上表达量均高于对照组,且差异有统计学意义。结论:bFGF基因转染能增强羊BMSCs增殖和骨向分化的能力,可作为组织工程骨的种子细胞。     

bFGF基因转染的骨髓间充质干细胞在珊瑚骨表面的生长特性

目的：将转染bFGF基因的骨髓间充质干细胞（BMSCs）与珊瑚骨复合培养，观察转染bFGF基因的BMSCs在珊瑚支架材料上的生长状况。方法：穿刺抽取新西兰大白兔胫骨骨髓，采用密度梯度离心法分离BMSCs．采用贴壁筛选法对分离出的BMSCs进行纯化，利用脂质体转染bFGF—pcDNA3到BMSCs。取生长良好的转染bFGF基因的BMSCs和未转染的BMSCs，分别接种于不同珊瑚表面，利用扫描电镜观察珊瑚支架上BMSCs的生长状况：采用MTT法观察细胞一支架复合培养的BMSCs增殖情况，采用SPSS10．0软件包对数据进行t检验。结果：扫描电镜观察显示．复合培养的BMSCs贴附在珊瑚上，并在材料上完全铺展，形态多样，细胞跨越微孔表面或向孔内长人，部分区域有细胞外基质形成。MTT法检测显示，细胞-支架复合培养转染组与复合培养未转染组的BMSCs增殖状况相比有统计学差异（P〈0．05），复合培养转染组，BMSCs生长增殖强于未转染组。而复合培养的转染组与单纯培养转染组BMSCs增殖相比无统计学差异（P〉0．05）。结论：转染bFGF基因的BMSCs在珊瑚支架材料上的生长状况较未转染组好，珊瑚人工骨可以作为BMSCs支架材料，用于构建组织工程骨。     

英文文摘

1.猪牙胚细胞条件培养基可诱导人牙髓干细胞的牙向分化(英)/Wang YX…//J Tissue Eng Regen Med.-2011,5(5).-354～362牙源性干细胞的分化受其所处的局部微环境所调控。以往研究表明牙胚细胞条件培养基可诱导牙髓干细胞向成牙的细胞谱系分化。然而,采用人牙胚细胞条件培养基诱导在实际操作中不可行,所以推测异种的牙胚细胞条件培养基可能对人牙髓干细胞产生类似的效应。本研究采用猪的牙胚细胞条件培养基(pTGC-CM)来诱导人牙髓干细胞,评估其诱导前后的     

BMP-2对大鼠骨髓间充质干细胞成骨作用的影响

目的:携带骨形态发生蛋白2(bone morphogenetic protein-2,BMP-2)基因的慢病毒载体感染大鼠骨髓间充质干细胞(bone mesenchymal stem cells,BMSCs)后,观察BMP-2对BMSCs成骨作用的影响。方法:原代培养大鼠BMSCs并进行传代及鉴定,用携带BMP-2的慢病毒感染第3代BMSCs后,进行骨向诱导,通过茜素红染色观察钙沉积。观察细胞黏附能力及对成骨标志分子骨桥蛋白(OPN)、骨钙素(OCN)、胶原蛋白Ⅰ(Col-Ⅰ)及smad(drosophila mothersagainst decapentaplegic protein)表达的影响。采用SPSS11.0软件包对数据进行统计学分析。结果:①原代培养出大鼠骨髓间充质干细胞并进行鉴定;②携带BMP-2和EGFP的慢病毒感染第3代BMSCs后,免疫荧光检测和RT-PCR及WB检测感染成功;③大鼠骨髓间充质干细胞感染慢病毒后进行骨向诱导,钙沉积明显增加;④BMSCs细胞黏附能力增强;⑤OPN、OCN、Col-Ⅰ及smad表达增加。结论:BMP-2通路增强了细胞黏附及相关成骨分化因子的表达,可明显促进大鼠...     

BMP受体在大鼠骨髓间充质细胞成骨中的作用

目的:研究骨形成蛋白受体(BMP-R)在大鼠骨髓间充质细胞(BMSCs)成骨中的作用机制。方法:分离大鼠BMSCs,将原代细胞分为4组,分别应用普通培养基(CM)、成骨诱导培养基(OM)、骨形成蛋白-2(BMP-2)和OM+BMP-2诱导培养基培养。应用碱性磷酸酶(ALPase)活性和钙结节染色(Von Kossa法)检测成骨分化程度,RT-PCR检测骨形成蛋白受体(BMP-R)的表达情况。采用SPSS16.0软件包对数据进行单因素方差分析。结果:OM可诱导BMSCs成骨分化,表现出高碱性磷酸酶活性和基质矿化能力。BMP-2可提高OM诱导BMSCs成骨分化的能力;OM在早期即可诱导BMP-RⅠA和BMP-RⅡ的表达,而BMP-2诱导BMP-R较迟。结论:BMP-2可提高OM诱导BM-SCs分化成骨的能力,BMP-R在BMSCs分化成骨中起重要作用。     

降钙素基因相关肽通过Hippo通路调控小鼠骨髓间充质干细胞成骨分化的实验研究

目的 前期研究发现降钙素基因相关肽（CGRP）能够促进成骨细胞的生物学活性,为了进一步揭示CGRP在骨修复中的作用,检测CGRP对小鼠骨髓间充质干细胞（BMSCs）成骨分化的影响,并对Hippo通路在这个过程中的作用进行了初步探讨。方法 在体外诱导培养的BMSCs中加入不同浓度的CGRP,处理48 h后测试碱性磷酸酶（ALP）活性,以筛选的优势浓度;处理7 d后进行茜素红染色,分别检测细胞的分化情况。应用Western blot检测CGRP作用于BMSCs后,Hippo通路核心分子Mst1/2蛋白磷酸化的表达水平;利用Hippo通路抑制剂维替泊芬（Verteporfin）阻断下游Yap信号,逆转录聚合酶链反应检测其对成骨相关因子Ⅰ型胶原蛋白（ColⅠ）、Runt相关转录因子2（Runx2）mRNA的表达影响。结果 ALP活性检测结果显示,与空白对照组相比,10^-9、10^-8、10^-7 mol·L^-1浓度范围的CGRP都能显著促进小鼠ALP活性的增加（P<0.05）,以10^-8 mol·L^-1浓度的CGRP为最佳刺激浓度。用10^-8mol·L^-1浓度的CGRP处理后,茜素红染色显示钙化结节明显增多。CGRP能够显著上调p-Mst1/2蛋白的表达（P<0.05）;当运用了抑制剂Verteporfin时,显著降低了CGRP诱导的Runx2、ColⅠ mRNA的表达（P<0.05）。结论 CGRP能够促进小鼠BMSCs的成骨分化,且Hippo信号通路介导了CGRP作用于小鼠BMSCs成骨分化的过程。     

高迁移率族蛋白B1在人牙髓细胞成牙本质分化中的表达

目的:检测人牙髓细胞(human dental pulp cells,hDPCs)诱导矿化过程中高迁移率族蛋白B1(high-mobility group box 1,HMGB1)的表达变化,探讨HMGB1在人牙髓细胞损伤修复中的可能作用。方法:组织块法分离培养hDPCs,收集矿化诱导0、3、7、11、14d后hDPCs的mRNA、蛋白质及细胞爬片,实时荧光定量反转录聚合酶链反应(RT-PCR)和蛋白质印迹法(western blot)分别检测HMGB1、牙本质涎磷蛋白(dentin sialophosphoprotein, DSPP)、牙本质基质蛋白1(dentin matrix protein 1, DMP1)及碱性磷酸酶(alkaline phosphatase, ALP)的mRNA及蛋白表达水平;并检测ALP活性,免疫荧光检测HMGB1在hDPCs矿化过程中的表达。结果:hDPCs矿化诱导后,DMP1、DSPP、ALP及HMGB1的mRNA表达显著性上调,DMP1、DSPP和ALP的mRNA以及碱性磷酸酶活性在诱导7 d、11 d和14 d后与对照组间差异有统计学意义(P<0.05),HMGB1mRNA在矿化诱导11d和14d后与对照组的差异具有统计学意义(P<0.05)。蛋白印迹法检测示细胞内各矿化标记的蛋白表达均较对照组上调,而细胞内HMGB1的蛋白表达较对照组下调。免疫荧光结果显示hDPCs矿化过程中,HMGB1逐渐从胞核转移至胞浆。结论:在hDPCs诱导成牙本质细胞分化过程中,HMGB1在mRNA水平上与DMP1、DSPP和ALP的表达变化趋势相似,而细胞内HMGB1蛋白水平表达下调,且HMGB1在hDPCs细胞内出现转位,提示HMGB1与hDPCs的成牙本质分化有关,可能在牙髓细胞损伤修复中发挥作用。     

当归多糖对高糖状态下大鼠骨髓间充质干细胞成骨向分化的影响

目的 探讨当归多糖（ASP）对高糖状态下大鼠骨髓间充质干细胞（BMSCs）成骨向分化的影响。方法 培养并收集第3代BMSCs进行成骨成脂分化诱导鉴定。将BMSCs分为3组进行培养：正常对照组（葡萄糖浓度5.5 mmol·L ^-1）、高糖组（葡萄糖浓度25.5 mmol·L ^-1）、ASP+高糖组（葡萄糖浓度25.5 mmol·L ^-1+40 mg·L ^-1 ASP）。CCK8检测各组BMSCs的增殖活性,茜素红染色和碱性磷酸酶活性检测成骨活性。实时荧光定量聚合酶链反应检测成骨标记基因Runt相关转录因子2（Runx-2）、锌指结构转录因子（Osx）、骨钙蛋白（OCN）、Ⅰ型胶原酶（COL-Ⅰ）mRNA及Wnt/β-catenin信号通路关键因子CyclinD1及β-catenin的mRNA表达。建立2型糖尿病大鼠模型,将大鼠分为3组：正常对照组（正常大鼠）、糖尿病组（糖尿病大鼠）、糖尿病+ASP组（糖尿病大鼠,ASP喂养）,制备大鼠胫骨骨缺损,进行组织学检测,观察骨缺损修复情况。结果 高糖组、ASP+高糖组的BMSCs增殖高于正常对照组（P<0.05）,高糖组和ASP+高糖组二者之间无统计学差异（P>0.05）。高糖组中BMSCs钙结节数量、碱性磷酸酶活性及Runx-2、OCN、Osx、COL-Ⅰ、CyclinD1、β-catenin的mRNA表达均低于正常对照组和ASP+高糖组（P<0.05）,正常对照组和ASP+高糖组之间无统计学差异（P<0.05）。组织学检测结果显示,糖尿病组骨小梁数量少于正常对照组和糖尿病+ASP组（P<0.05）,而正常对照组和糖尿病+ASP组二者之间无统计学差异（P>0.05）。结论 ASP可促进高糖状态下大鼠BMSCs的成骨分化及2型糖尿病大鼠的骨缺损修复,这种促进作用可能与Wnt/β-catenin信号通路的激活有关。     

成釉细胞微环境对胚胎干细胞特性的影响

目的研究胚胎干细胞诱导后成牙分化的可行性。方法使用成釉细胞无血清条件培养液诱导胚胎干细胞分化,观察诱导后细胞形态学变化以及体外检测基因表达和免疫表型分析。结果成釉细胞无血清条件培养液诱导胚胎干细胞后,拟胚体的外周有鹅卵石样的细胞,类似于上皮样的细胞生成。同时,诱导组细胞中可检测CK14、AMBN及AMGN mRNA的表达,DMP1和DSPP表达阴性,进一步免疫表型分析显示,诱导组胚胎干细胞表达CK14、AMBN及AMGN阳性。结论利用成釉细胞无血清条件培养液分泌的信号分子在体外模拟上皮的微环境,使得胚胎干细胞实现了向牙源性上皮细胞方向的表型转化。     

调节Lnk/干细胞因子-干细胞因子受体通路对糖尿病状态骨髓间充质干细胞成骨功能的影响

目的 探讨调节Lnk/干细胞因子（SCF）-干细胞因子受体（cKit）通路对糖尿病状态大鼠骨髓间充质干细胞（BMSCs）成骨功能的影响。方法 分离糖尿病大鼠BMSCs,免疫细胞化学染色鉴定后,将细胞分为空白对照组、阴性对照组、RNA干扰组,并用免疫印迹实验检测干扰效果。体外模拟糖尿病状态下诱导BMSCs成骨分化,并检测Lnk/SCF-cKit通路主要蛋白Lnk、SCF、cKit及成骨相关蛋白碱性磷酸酶（ALP）、骨钙素（OCN）、Ⅰ型胶原蛋白a1（ColⅠa1）的表达。结果 分离培养的细胞表达CD₄₄、CD₉₀,不表达CD_11b、CD₄₅,符合BMSCs表面标记物特征。与其他糖尿病状态BMSCs相比,RNA干扰组Lnk表达降低,SCF、cKit表达增加（P<0.05）。成骨诱导分化28 d,与其他糖尿病状态BMSCs相比,RNA干扰组细胞Lnk表达降低,SCF、cKit、ALP、OCN、ColⅠa1表达增加（P<0.05）。结论 抑制Lnk表达、激活SCF-cKit通路可改善糖尿病状态大鼠BMSCs的成骨功能。     

过表达骨形态发生蛋白-4对小鼠诱导性多能干细胞生物学活性的影响

目的 构建过表达骨形态发生蛋白-4（BMP4）基因的慢病毒载体,探讨其过表达后对小鼠诱导性多能干细胞（iPS）生物学活性的影响。方法 采用慢病毒转染建立稳定过表达BMP4的iPS细胞株（BMP4过表达组）,未作任何转染的细胞为空白组,转染慢病毒阴性对照组的细胞为空载体组。CCK8检测各组细胞增殖活性,碱性磷酸酶（ALP）活性检测细胞分化程度,荧光定量聚合酶链反应检测BMP4、成釉细胞蛋白（AMBN）、细胞角蛋白（CK）14、牙本质涎磷蛋白（DSPP）、骨唾液酸蛋白（BSP）及骨细胞特异转录因子Runx2的mRNA表达。结果 与空白组及空载体组相比,BMP4过表达组的细胞增殖活性及ALP活性升高（P<0.05）,Runx2、AMBN、CK14、DSPP、BSP mRNA的表达增加（P<0.05）。结论 BMP4基因能够促进iPS的牙向分化。     

根尖孔大小对牙髓组织再生及牙齿抗压强度的影响

目的:探讨根尖孔大小对牙髓组织再生及牙齿抗压强度的影响。方法:收集因正畸拔除的牙根发育完成、 无牙根折裂的单根下前磨牙,离体牙截冠后,保留12 mm牙根,随机分为5组,每组25颗牙,根管预备至不同主锉号数,分别为30#、40#、60#、80#及100#主锉组,其中30#主锉组为对照组。体外培养人牙髓干细胞并接种于0.25%水凝胶支架中,将其分别注入不同主锉预备过的根管内,每组均取5颗牙,其牙根于Transwell小室分别培养14、21、28 d,提取水凝胶中细胞的总RNA,进行实时定量聚合酶链反应(real-time polymerase chain reaction,Real-time PCR)检测;每组余下的10颗牙,其牙根冠部封闭后植入裸鼠皮下,28 d后取出,5颗进行组织学观察,5颗进行静态载荷实验。结果:Real-time PCR检测牙本质涎磷蛋白(dentin sialophosphoprotein, dspp)、牙本质基质蛋白-1(dentin matrix protein-1, dmp-1)的表达,第28天时,各实验组均高于对照组(P<0.05),且40#主锉组高于其它实验组(P<0.05)。组织学分析表明,30#、40#、60#主锉组均未见连续的牙髓样组织形成,80#、100#主锉组可见组织形成,但未表现出典型牙髓样组织结构。静态载荷实验结果表明,40#主锉组的平均抗压载荷与对照组比较差异无统计学意义,其它实验组均低于对照组(P<0.05)。结论:根尖孔预备至100#(1 mm)以内时,根尖孔大小对牙髓组织再生没有明显影响,但根尖孔预备大于40#时,抗压强度明显下降。