介导Sonic Hedgehog基因传递载体的体外构建实验

目的：制备高纯度滴度的病毒载体，介导外源基因Sonic Hedgehog传递至骨组织工程的种子细胞内。方法：包装重组质粒pSNAV2．0-Shh，生产重组病毒rAAV—Shh，并感染小鼠颅骨前成骨细胞MC3T3-E1，流式细胞仪及实时定量PCR检测基因传递效果。结果：生产出高滴度及纯度的重组病毒rAAV—Shh，能有效感染MC3T3-E1，促进胞内成骨相关因子的表达升高。结论：这种重组病毒rAAV—Shh能有效传递外源基因，为骨组织工程中的种子细胞提供基因传递载体。     

Dlx2在MC3T3-E1细胞成骨分化过程中的作用

目的:探讨Dlx2(distal-less homeobox 2)基因过表达对体外培养的小鼠前成骨细胞系MC3T3-E1 向成骨方向分化的影响.方法:构建Dlx2过表达的反转录病毒载体,测序验证.体外病毒转染MC3T3-E1后,以嘌呤霉素行抗性筛选稳定细胞株,以RT-PCR和Western印迹检测转染后细胞中Dlx2的表达.应用实时定量PCR(RT-PCR)检测Dlx2过表达对部分成骨相关基因(ALP、OCN、Runx2、Msx2)表达的影响.以碱性磷酸酶(ALP)活性测定和茜素红染色法检测Dlx2过表达对MC3T3-E1细胞成骨分化的影响.采用SAS 6.04软件包对数据进行随机设计的方差分析.结果:本实验成功构建Dlx2过表达的反转录病毒载体,测序正确.体外转染后筛选出Dlx2稳定高表达细胞株MC3T3-E1-Dlx2,其mRNA和蛋白表达量显著高于对照组.在成骨诱导过程中,MC3T3-E1-Dlx2细胞ALP值在第4、7、14d均高于对照组细胞,茜素红染色显示实验组较对照组和空白组染色深.Dlx2过表达在成骨诱导早期能显著促进ALP和Msx2的表达(P<0.05),晚期则上调OCN表达(P<0.05),而Runx2表达无明显变化(P>0.05).结论:Dlx2过表达上调AIP、OCN等成骨相关基因的表达.促进MC3T3-E1细胞的成骨分化.     

非病毒载体介导pBMP-2转染MC3T3-E1细胞的体外成骨分化研究

目的 :探讨非病毒载体Gen Escort TM II介导质粒骨形态发生蛋白2(p BMP-2)转染对MC3T3-E1细胞增殖和体外成骨分化的影响。方法:以非病毒载体Gen Escort TM II介导报告基因质粒增强型绿色荧光蛋白(p EGFP)转染MC3T3-E1细胞,优化转染条件,荧光显微镜和流式细胞仪评价转染效率。p BMP-2转染MC3T3-E1细胞后,MTT法检测细胞增殖情况,染色法检测碱性磷酸酶(ALP)和茜素红S(ARS)的表达,Real-time PCR分析成骨细胞标志基因ALP、骨涎蛋白(BSP)、Runt相关转录因子2(Runx2)、骨钙素(OCN)和骨桥蛋白(OPN)的表达。结果 :Gen Escort TM II介导p EGFP转染MC3T3-E1细胞后,转染效率达35.02±4.42,MTT结果示基因转染对细胞增殖无影响(P>0.05)。p BMP-2转染组的ALP、ARS表达较p EGFP转染组和未转染组显著,同时Real-time PCR检测结果示,转染后6 d,p EGFP转染组和未转染组相比,p BMP-2转染组的成骨基因ALP、BSP、Runx2、OCN、OPN的表达量差异有显著性意义(P<0.05)。结论:非病毒载体Gen Escort TM II介导BMP-2转染MC3T3-E1细胞可诱导其向成骨方向分化。     

同源盒蛋白(Msx1)过度表达抑制成骨细胞碱性磷酸酶表达的实验研究

目的:观察同源盒蛋白(Msx1)过度表达在成骨细胞MC3T3-E1分化培养过程中对碱性磷酸酶的调节作用,以探讨Msx1蛋白对细胞成骨分化过程的调控机制。方法:将成骨细胞MC3T3-E1分为5组:未转染病毒组作为对照组1(A组);空白腺病毒载体组作为对照组2(B组);未分化组作为空白对照组(C组);分化前1 d转染携带同源盒基因Msx1的腺病毒载体组(D组);分化后1 d转染Msx1腺病毒载体组(E组)。在成骨分化培养基中培养4 d后,检测成骨细胞MC3T3-E1在成骨分化培养过程中碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)的活性。结果:A、B两组成骨细胞MC3T3-E1在成骨分化培养基培养4 d后,ALP活性呈强阳性;C组中未分化成骨细胞MC3T3-E1无ALP活性,D、E两组的成骨细胞MC3T3-E1在成骨分化培养4 d后的ALP活性明显较A、B组减低,而且D、E两组间ALP活性无区别。结论:过度表达同源盒蛋白(Msx1)能抑制成骨细胞MC3T3-E1的ALP表达,在其成骨分化的过程中起一定的抑制作用。     

PP-1蛋白稳定高表达MC3T3-E1成骨样细胞系的建立

目的建立稳定高表达蛋白质磷酸酶-1(protein phasphatase-1,PP-1)的MC3T3-E1成骨样细胞系。方法采用RT-PCR技术从MC3T3-E1细胞中扩增蛋白质磷酸酶-1(PP-1)基因,将获得的基因定向插入pCI-neo真核表达质粒中,PCR及双酶切鉴定后用脂质体将表达载体转染入MC3T3-E1细胞,经G418加压有限稀释筛选,建立稳定高表达PP-1的MC3T3-E1成骨样细胞系,采用Western blot法检测PP-1的蛋白表达情况。结果 PCR及双酶切鉴定表明表达载体pCI-neo-PP-1构建正确;Western blot检测结果显示PP-1蛋白能在转染pCI-neo-PP-1的MC3T3-E1细胞中稳定高表达。结论成功建立了稳定高表达PP-1的MC3T3-E1成骨样细胞系,为进一步深入研究PP-1在细胞力学信号转导通路中的功能及作用机制奠定了实验基础。     

MC3T3-E1 Subclone 14体外诱导成骨模型的建立及Ano5基因表达的研究

目的 建立MC3T3-E1 Subclone 14体外诱导成骨模型,探讨Ano5基因表达与成骨细胞形成的关系,了解其对成骨分化的影响.方法 MC3T3-E1 Subclone 14细胞贴壁培养,加入条件培养基,分别培养至0d、3d、7d、14d、21d.倒置显微镜下观察细胞形态,通过碱性磷酸酶活力测定和茜素红染色,鉴定成骨细胞.利用REALTIME-PCR检测Ocn、Colα1、Opg/Rankl、Osterix和Runx2等成骨相关因子的基因表达水平,同时检测Ano5基因在成骨细胞形成过程中的表达趋势.结果 体外诱导MC3T3-E1 Subclone 14倒置光学显微镜下观察细胞形态呈梭形.成骨细胞碱性磷酸酶活力逐渐增高.成骨诱导培养至14d和21d,茜素红染色可见细胞表面出现矿化结节.成骨相关因子基因表达均逐渐增高,至21d达到高峰.Ano5基因从诱导分化的第3d开始表达,随后表达量逐渐增高,至14d达到高峰,21d表达量下降.结论 在MC3T3-E1 Subclone 14体外诱导分化为成骨细胞过程中,Ano5基因表达量逐渐升高,至14d达到高峰,21d开始表达量具有下降趋势.     

骨形态发生蛋白-7真核表达载体的构建及其在MC3T3-E1细胞中的表达

目的构建一个能在MC3T3-E1细胞中表达骨形态发生蛋白-7（bmp-7）基因表达载体。方法采用RTPCR技术从人胚肾中扩增人bmp-7基因,将获得的基因定向插入pcDNA3.1（+）真核表达质粒中,测序正确后用脂质体将表达质粒转染入MC3T3-E1细胞,转染后72 h提取细胞全蛋白,采用Western blot检测BMP-7蛋白表达。结果通过基因测序表明获得的bmp-7与GeneBank登录的序列一致,构建的质粒为bmp-7/pcDNA3.1（+）质粒,Westernblot检测结果表明bmp-7基因转染MC3T3-E1后能在细胞中表达。结论成功构建能在MC3T3-E1细胞中表达BMP-7的真核表达载体。     

不同浓度无机磷对MC3 T3-E1细胞系成骨及破骨相关基因表达的影响

目的：探讨不同浓度的无机磷液对体外培养MC3T3-E1细胞的成骨和破骨相关基因mRNA表达的影响。方法：体外常规培养MC3T3-E1细胞。根据所用培养液外加无机磷浓度的不同,将实验细胞分为4组：0 mM组（对照组）、1 mM组、3 mM组和5 mM组。每组设3个复孔,培养48 h后收取细胞标本,通过Real-time PCR检测MC3T3-E1细胞成骨和破骨相关基因mRNA的表达。结果：与对照组相比,成骨相关基因ALP、BSP、OC及OSXmR-NA的表达在1 mM组和3 mM组增加,而在5 mM组则减少,差异具有统计学意义（ P＜0.05）;成骨抑制基因SOST及破骨相关基因CTSK、TRAPmRNA的表达,在1 mM 组、3 mM 组和5 mM 组都增加,差异具有统计学意义（ P ＜0.05）。结论：高浓度（5 mM）的无机磷环境对MC3T3-E1细胞的成骨相关基因表达起显著抑制作用,对破骨相关基因表达起显著增强作用,提示高浓度无机磷抑制MC3T3-E1细胞的成骨活性。     

MicroRNA-103-3p对小鼠前成骨细胞MC3T3-E1成骨分化早期的影响

目的:探讨miR-103-3p对小鼠前成骨细胞MC3T3-E1成骨分化早期的影响。方法:以小鼠前成骨细胞MC3T3-E1为实验对象,对MC3T3-E1细胞进行成骨诱导,分别在0、3、5、7 d应用实时荧光定量PCR（real-time PCR）检测细胞中Runx2、Osx、ALP、miR-103-3p表达水平,Western免疫印迹（Western blotting）检测Runx2、Osx蛋白表达并进行碱性磷酸酶（ALP）染色。通过脂质体lipofectamine2000瞬时转染miR-103-3p模拟物 （miR-103-3p mimics）及模拟物阴性对照进入MC3T3-E1细胞内,Real-time PCR检测2组细胞miR-103-3p的表达水平,CCK-8试剂盒检测细胞增殖。分别对2组细胞进行成骨诱导,在成骨诱导后0、3、7 d,分别使用Real-time PCR和Western免疫印迹检测2组细胞Runx2、Osx等成骨相关基因mRNA和蛋白的表达变化,并对2组细胞进行ALP染色。实验数据采用SPSS19.0软件包进行统计学分析。结果:MC3T3-E1经成骨诱导0、3、5、7 d后,细胞内Runx2、Osx、ALP转录水平持续显著升高;Runx2、Osx蛋白表达升高。ALP染色逐渐加深。在成骨诱导3、5、7 d的MC3T3-E1细胞中,miR-103-3p水平较诱导前受到持续显著抑制(P<0.05)。瞬时转染miR-103-3p mimics后,MC3T3-E1细胞中的miR-103-3p表达水平较对照组显著上调(P<0.05),细胞增殖受到抑制,Runx2、ALP转录水平显著抑制（P<0.05）,Runx2蛋白表达显著抑制。对转染后的细胞进行成骨诱导3、7 d后,miR-103-3p转染组细胞Runx2、Osx、ALP在转录水平的表达较对照组显著降低,Runx2、Osx在蛋白水平的表达较对照组显著降低,且miR-103-3p转染组细胞ALP活性较对照组显著降低。结论:miR-103-3p可能对小鼠前成骨细胞MC3T3-E1的成骨分化早期起抑制作用。     

不同大小机械牵张力对成骨细胞MMP-13/TIMP-1表达的影响

目的:研究不同大小机械牵张力对成骨细胞MMP-13/TIMP-1表达的影响.方法:通过自制的多通道细胞牵张应力加载系统对小鼠成骨样细胞MC3T3-E1同时施加0%、6%、12%和18%的机械牵张力,作用24h后,用RT-PCR方法检测细胞受力后MMP-13/TIMP-1 mRNA表达的变化,用免疫印迹法检测其蛋白表达的变化.结果:细胞受力后,MMP-13 mRNA/TIMP-1 mRNA及蛋白表达随牵张力值的增大明显增加.结论:不同大小机械牵张力可以影响成骨细胞的MMP-13/TIMP-1表达,进而影响骨改建.     

Effects of two vitamins,two growth factors and dexamethasone on the proliferation of rat bone marrow stromal cells and osteoblastic MC3T3-E1 cells

The purpose of this investigation was to examine the effects of the addition of five cytokines such as vitamin C, vitamin D, bone morphogenetic protein (BMP), transforming growth factor-beta (TGF-beta) and dexamethasone (Dex) to Dulbecco's modified Eagle (DME) medium on the proliferation of Sprague-Dawley (SD) rats' bone marrow stromal cells and osteoblastic MC3T3-E1 cells by conducting 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl tetrazolium bromide (MTT) assay. For bone marrow stromal cells, vitamin C was needed for doubling the cell viability. While BMP, TGF-beta and vitamin D maintained the growth rate given by vitamin C, Dex with beta-glycerophosphate (beta-GP) slightly reduced this cell proliferation rate. For MC3T3-E1 cells, the addition of four cytokines examined (vitamin C, vitamin D, TGF-beta and BMP) did not significantly increase the cell proliferation while Dex with vitamin C and beta-GP slightly enlarged the cell proliferation. It can be pointed out that vitamin C in DME medium is indispensable for rapid proliferation of bone marrow stromal cells that contain many osteo-progenitor cells but is not effective for quick increase of osteoblastic MC3T3-E1 cells. This finding appears to contribute to tissue engineering therapy to fix bone and periodontal defects in dentistry.     

RGD多肽修饰的无机小牛骨粉对MC3T3-E1细胞黏附、增殖及分化的影响

目的:研究小鼠前成骨细胞MC3T3-E1在RGD修饰的无机小牛骨粉上的黏附、增殖及分化。方法:浸泡法制备RGD/Bio-Oss复合材料。MTT法检测细胞1 h、2 h、3 h黏附,扫描电镜观察细胞黏附形态,DNA浓度定量分析细胞1 d、3 d、5 d、7 d的增殖。碱性磷酸酶(ALP)试剂盒检测细胞7 d、14 d的分化。结果:1 h、2 h、3 h细胞黏附结果Bio-Oss/RGD组明显高于Bio-Oss组及空白对照组;1 d、3 d、5 d、7 d Bio-Oss/RGD组和Bio-Oss组的DNA浓度差别无统计学意义,但都低于空白对照组;细胞分化第14天时Bio-Oss/RGD组的结果明显高于Bio-Oss组与空白对照组。结论:RGD对细胞黏附及分化有一定的促进作用,但对细胞增殖无显著促进作用。     

Proliferation and differentiation of MC3T3-E1 cells on calcium phosphate/chitosan coatings

The incorporation of chitosan into electro-deposited calcium phosphate (CaP) coatings increases bone marrow stromal cell attachment. We hypothesized that such electrodeposited CaP/chitosan coatings can also enhance the proliferative ability and differentiation potential of osteoblasts. To verify this hypothesis, we cultured osteoblast-like MC3T3-E1 cells on these CaP coatings. It was found that MC3T3-E1 cells cultured on the electrodeposited CaP/chitosan coatings had cell proliferation rates higher than those on the electrodeposited CaP coatings. At the same time, both alkaline phosphatase activity and collagen expression were increased, and both bone sialoprotein and osteocalcin genes were up-regulated when MC3T3-E1 cells were cultured on the electrodeposited CaP/chitosan coatings. Additionally, within the range of selected chitosan concentrations in solution, no significant difference was found between the CaP/chitosan coatings. Our results suggest that the electrodeposited CaP/chitosan coatings are favorable to the proliferation and differentiation of MC3T3-E1 cells, which may endow them with great potential for future applications.     

hBMP-2修饰β-TCP/I型胶原复合材料对MC3T3-E1细胞增殖的影响

目的:探究含人的骨形成蛋白-2为目的基因的质粒DNA修饰纳米β-磷酸三钙(Tricalcium phosphate)/I型胶原溶液复合材料对小鼠前成骨细胞增殖的影响。方法:含hBMP-2为目的基因的质粒DNA修饰纳米β-TCP/I型胶原溶液复合材料,建立MC3T3-E1细胞株与纳米复合材料体外培养体系。将其分为支架组和平皿组,扫描电镜、光镜观察细胞学形态,Alamar Blue法检测细胞增殖,MuseTMCell Analyzer法检测细胞周期,实时荧光定量PCR检测Cdk2、Cdk4等细胞增殖基因。结果:复合材料细胞黏附数、增殖数及表面分布高于平皿组(P<0.05),实验结果显示支架组均优于平皿组。结论:复合材料与单纯含hBMP-2为目的基因的质粒DNA相比, 更能促进前成骨细胞黏附、增殖及功能代谢, 表明其对前成骨细胞具有良好细胞相容性,可成为一种新型的具有应用前途的骨修复或组织工程材料。