16SrRNA克隆文库法分析成人龋病唾液微生物多样性

目的: 讨论汉族人群中高龋和无龋人群口腔唾液微生物结构的差异。方法: 采集符合WHO采样标准的唾液样本6例,其中高龋组(CA组)3例,无龋组(CF组)3例,提取细菌总DNA,构建16S rRNA克隆文库,挑取阳性克隆子进行测序,并用MOTHUR等软件对结果进行分析,MEGA4.0软件构建系统发育树。结果: 共获得80个OTUs,归属于5个门,9个纲,10个目,14个科,19个属,其中有13个优势属;CA组优势属为:链球菌属(53.16%)、普氏菌属(28.77%)、颗粒链球菌属(9.34%);CF组优势菌为:链球菌属(46.12%)、普氏菌属(23.41%)、奈瑟菌属(14.35%)。结论: 16S rRNA克隆文库法已成熟,可用于口腔微生物群落结构的研究,当地汉族人群中高龋和无龋人群口腔微生物群落结构存在一定的差异,高龋组中优势菌(链球菌属、普氏菌属、颗粒链球菌属)对龋病发生发展的作用还有待进一步的研究。     

与重症低龄儿童龋病相关的唾液微生物群落研究

目的通过高通量测序技术研究重症低龄儿童龋病和健康者唾液的菌群结构及其差异。方法 在青岛市崂山区儿童中,经口腔检查选取健康（H组）和重症低龄龋病（C组）儿童各24名,采取唾液样本,提取其DNA进行聚合酶链式反应扩增,利用454测序平台对16S rRNA V1—V3区进行双端测序,对细菌群落结构及多样性进行差异分析。结果 C组唾液菌群物种丰度高于H组（P<0.05）,两组唾液菌群结构的差异有统计学意义（P<0.01）,且C组的群落结构更为相似和保守（P<0.001）;鉴别出C组高表达的可疑致龋微生物（P<0.1）及H组高表达的健康相关微生物（P<0.1）;基于唾液菌属图谱建立的龋病风险评估模型区分健康和龋病者的准确率可高达70%以上。结论 唾液菌群和特定细菌种类,如比例升高的Prevotella菌属有助于评估和筛选低龄儿童龋病风险。     

基于唾液宏蛋白质组学的重度低龄儿童龋患者唾液微生物群落分析

［摘要］ 目的 采用宏蛋白质组学技术研究重度低龄儿童龋患者唾液微生物群落的特征。方法 采集重度低龄儿童龋及无龋儿童非刺激性唾液,提取唾液中的蛋白质、酶解形成多肽后进行质谱分析,对比微生物库分析唾液微生物群落的特征。结果 无龋儿童唾液微生物来源于19个门1 216个种,高丰度的微生物以变形菌门、厚壁菌门、拟杆菌门、放线菌门、梭杆菌门以及乳糖奈瑟氏菌、肺炎链球菌、干燥奈瑟氏菌、副流感嗜血杆菌、脑膜炎奈瑟氏菌、流感嗜血杆菌、浅黄奈瑟氏菌、淋病奈瑟氏菌、金氏金菌、黏膜奈瑟氏菌、多糖奈瑟氏菌等11种细菌为主;重度低龄儿童龋儿童唾液微生物来源于24个门1 698个种,高丰度的微生物以变形菌门、厚壁菌门、拟杆菌门、放线菌门、蓝藻菌门以及肺炎链球菌、乳糖奈瑟氏菌、干燥奈瑟氏菌、流感嗜血杆菌等4种细菌为主。结论 宏蛋白质组技术可以全面、快速分析口腔唾液微生物群落的构成。重度低龄儿童龋儿童唾液微生物群落结构相比无龋儿童更加复杂,这种复杂性可能与龋病的产生及唾液微生态失衡有关。     

甘肃保安族口腔健康儿童唾液微生物群落结构分析

目的:研究甘肃保安族口腔健康儿童唾液微生物群落结构,探寻优势微生物种群。方法:通过构建16S rRNA克隆文库法对测序结果进行分析,利用BLAST、Mothur、Clustalx 2.0等软件进行细菌群落结构多样性分析,构建系统发育树。结果:共检测到84个操作分类单位(OTU),归属于5个门,12个纲,15个目,18个科,19个属。其中以厚壁菌门(Firmicutes,88.60%)比例最多;6个优势菌属(检出率>1%),分别为链球菌属(Streptococcus,70.28%)、颗粒链菌属(Granu Iicatella,6.20%)、孪生菌属(Gemella,3.10%)、韦永氏球菌属(Veillonella,1.81%)、奈瑟菌属(Neisseria,1.03%)和嗜血杆菌属(Haemophilus,1.03%),其中链球菌属在8个样本中均出现。结论:保安族口腔健康儿童唾液微生物群落结构较为丰富;链球菌属为主要优势菌。     

16SrRNA高通量测序技术分析肾移植患者唾液菌群分布特征

目的 以高龋均患者唾液菌群为参照，应用高通量测序技术分析肾移植患者唾液菌群分布情况。方法 选取9名肾移植术后1年的患者为实验组，9名高龋均的患者（DMFT≥6）为对照组，采集唾液，提取DNA进行PCR扩增、测序，分析两组唾液菌群结构及多样性差异。结果 肾移植组患者与高龋均组患者唾液菌群有相似的多样性指数，指数比较差异无统计学意义（P> 0.05）。肾移植组与高龋均组患者唾液菌群均具有特定的优势菌，且保持相对稳定性，在相对丰度上存在差异，其中厚壁菌门（Firmicutes），梭杆菌门（Fusobacteria），纤毛菌属（Leptotrichia spp.），坦纳菌属（Tannerella spp.），梭菌属（Clostridium spp.）在两组间具有显著差异。结论 肾移植患者口腔微生物群落结构与高龋均人群存在差异。     

健康儿童及成人唾液微生物多样性研究

目的:16S rRNA高通量测序技术分析口腔健康儿童与成人唾液微生物多样性的差异。方法:选择11位受检者(5例口腔健康成人(AJ组),6例口腔健康儿童(CJ组))的唾液样本进行细菌DNA提取,后利用Illumina MiSeq测序平台对11例样本DNA的16S rRNA V4-V5区进行测序,并分析两组唾液样本间菌群多样性。结果:11个样本总获得 474119 条序列,共9223OTUs,归属于26个门,374个属;PcoA检测显示两组微生物群落结构有明显差异;T-检验显示两组间差异菌属为:纤毛菌属(Leptotrichia)、卟啉单胞菌属(Porphyromona)、密螺旋体属(Treponema)、孪生球菌属(Gemella)、颗粒链菌属(Granulicatella);其中,卟啉单胞菌属、密螺旋体属、纤毛菌属在AJ组的相对丰度高于CJ组,孪生球菌属、颗粒链菌属在CJ组相对丰度高于AJ组。结论:健康成人与健康儿童口腔唾液微生物群落结构在种类上相似,而在丰度上存在差异,差异提示:健康成人较健康儿童更倾向患牙周病;健康儿童较健康成人更倾向于患龋病。     

涎腺腺样囊性癌患者口腔微生物多样性研究

目的 探讨涎腺腺样囊性癌（SACC）患者口腔微生物的多样性和群落差异。方法 采集13例SACC患者与10例健康人的唾液样本,提取其口腔菌群的总DNA,经通用引物扩增16s rRNA基因,利用高通量测序平台进行细菌16S rRNA基因（V3-V4）区高通量测序分析后,利用Mothur软件分析微生物的多样性和群落结构。结果 SACC组优势种群有16种（相对丰度>1%）,依次是:链球菌属（36.68%）,奈瑟菌属（8.55%),普雷沃菌属_7（7.53%）,韦荣球菌属（6.37%）等。对照组优势种群有15种,依次有:链球菌属（18.41%）,奈瑟菌属（18.20%）,普雷沃菌属_7（8.89%）,卟啉单胞菌属（6.20%）,梭杆菌属（5.86%）,韦荣球菌属（5.82%）等。2组间有统计学差异的菌门包括厚壁菌门、变形菌门、梭杆菌门（P<0.05）。有统计学差异的菌属包括链球菌属、奈瑟菌属和卟啉单胞菌属（P<0.05）,而嗜二氧化碳噬细胞菌属仅在SACC患者中检出。结论 SACC患者的唾液微生物与健康人群唾液微生物的种群结构存在明显差异。     

不同龋状况母子间口腔微生物群落结构分析

目的：应用PCR-DGGE（变性梯度凝胶电泳）技术,分析20对不同龋状况母子口腔唾液中微生物群落组成的多样性。方法：分别采集20名不同龋状况儿童及母亲的唾液样本,提取细菌总DNA,进行16SrDNA的PCR扩增及DGGE,克隆测序分析。结果：母子口腔唾液中分别检出42、48个菌种,其共同菌种为37个,归属于16个菌属,同时,检出新菌种Megasphaeraspp.,且在无龋儿童及高龋母亲唾液中分别检出Abiotrophiaspp.和Olsenellaspp.两个特异菌属。无龋组母子唾液中嗜血菌属的相对数量显著高于高龋组（P〈0.001）;无龋儿童携带的放线菌属相对数量也多于高龋组（P〈0.001）;而链球菌属,奈瑟菌属低于高龋组（P〈0.001）,而高龋组母亲口腔微生物中相对数量最多的为乳杆菌属,其次为放线菌属,奈瑟菌属,与无龋组比较差异显著（P〈0.001）。结论：母子口腔唾液菌群组成具有多样性,且随龋状况不同而有所差异。     

S-ECC患儿经治疗后菌斑微生物群落短期内改建过程分析

目的 从微生物角度探究重度低龄儿童龋（severe early childhood caries,S-ECC）患儿一次完成龋病治疗前、治疗后3个月内菌斑微生物群落构成和多样性的变化及治疗对于远期无龋状态维持的作用。方法S-ECC患儿在全身麻醉下一次完成龋病治疗,采集治疗前（C）、术后7 d(C-7D)、1个月（C-1M）、3个月（C-3M）无龋牙面集合菌斑,并纳入无龋儿童（CF）为对照组,分析治疗前后菌斑微生物群落短期内的动态改建过程。结果 S-ECC组和CF组菌斑群落组成高度相似;组间α多样性指数差异无统计学意义（P>0.05）;从相对丰度值分析,纤毛菌属、聚集杆菌属等在治疗后较术前下降（P<0.05）,C-7D组血链球菌较C组上升并在3个月内逐渐下降;治疗前韦荣菌属、放线菌属、拟普雷沃菌属、二氧化碳嗜纤维菌属、变异链球菌在C组和CF组间存在显著差异（P<0.05）,其中变异链球菌经治疗后的C-7D、C-1M组与CF组未存在显著差异,而C-3M组较CF组出现上升（P<0.01）。结论 S-ECC患儿在接受治疗后菌群结构的迅速改变,并在治疗后1～3个月逐渐开始建...     

不同牙龋病状况患者龈上菌斑及龋损组织微生物多样性分析

目的： 探讨不同龋病状况患者龈上菌斑及龋损组织微生物的组成特点及多样性差异。方法： 随机双盲法选择2019年1月—12月于西安医学院第一附属医院口腔科确诊的龋病患者33例（轻度、中度、重度各11例）,无龋病健康者10例。收集龈上牙菌斑和龋损组织,采用细菌DNA测序方法对细菌16S rRNA-cDNA高可变区进行测序,比较各组微生态种属和相对丰度。采用SPSS 23.0软件包对数据进行统计学分析。结果： 与无龋组相比,龋病组龈上菌斑、龋损组织中微生物含量和丰富度均显著降低（P<0.05）。轻、中、重度组患者龋损组织微生物主要为拟杆菌门、螺旋体门、变形菌门、梭杆菌门、厚壁菌门、放线菌门,各组菌属比例有显著差异（P<0.05）。轻、中、重度组患者龈上菌斑微生物主要有21种,其中,梭杆菌、科里亚细菌、奈瑟菌目、放线菌目、乳杆菌目占比高,其他均小于1%,各组5种菌属比例无显著差异（P>0.05）。结论： 龋病的发生由多菌种所致,且为多种细菌的共同作用。不同龋病状况患者龈上菌斑及龋损组织微生物丰度有显著差异,随着龋病的发生,微生物的多样性下降。     

Shifts in the Microbial Population in Relation to in situ Caries Progression

The shift in microbial diversity from young to mature plaque, related to caries activity on sound and restored surfaces, was studied using denaturing gradient gel electrophoresis. During a 20-week in situ study on caries progression 8 subjects wearing restored and unrestored dentin and enamel sections, biofilm was sampled after 1 and 20 weeks (young or mature plaque). A higher microbial diversity (mature plaque) was seen in caries-active compared to caries-free subjects. Rothia dentocariosa and Scardovia inopinata were absent from all caries-free sites, but appeared in 50% of the caries-active sites.     

不同龋敏感青少年口腔细菌多样性分析

目的 通过聚合酶链反应（PCR）-变性梯度凝胶电泳（DGGE）分析无龋及高龋青少年的唾液细菌多样性的差异。方法 随机选择20名12~18岁青少年分为无龋组（n=10）和高龋组（n=10）,收集其非刺激性唾液,提取细菌全基因组DNA,采用通用引物进行PCR扩增,采用Quantity One软件对扩增产物DGGE指纹图谱进行分析。结果 DGGE图谱分析表明：唾液细菌的组成具有个体差异性;唾液样本中检测到的条带数无龋组为32.5±3.7,高龋组为27.3±3.4,差异有统计学意义（P=0.008）。高龋组和无龋组的Shannon-Wiener’s指数分别为2.5±0.2和2.6±0.2,二者之间的差异无统计学意义（P=0.405）。聚类分析发现,同组内大部分样本聚类位置相近,群落结构表现出较高的相似性;不同组的大部分样本未聚类在一起,群落结构呈现出一定的差异。结论 无龋青少年唾液细菌的多样性显著高于高龋青少年,唾液细菌的多样性在龋病发展过程中有减少的趋势。     

唾液及菌斑液中蛋白成分与龋易感性的关系

目的：探讨纯腮腺液，全唾液及菌斑液中蛋白成分与龋易感性的关系。方法：选39名无龋者（caries free,CF)和27例高龋者（caries susceptible,CS)，用Folin酚法测定纯腮腺液，全唾液及菌斑液的总蛋白含量，SDS－PAGE和图像分析系统定量分析各蛋白成分。结果：总蛋白含量菌斑液高于唾液近10倍，其中仅CF组全唾液与菌斑液有较大相关性（r=0.804).3种液体共有的蛋白为14000，66000及76000蛋白，菌斑液中14000，15000及38000蛋白和全唾液中14000蛋白的含量CS组显著低于CF组，结论：无龋组菌斑液蛋白受全唾液影响较大。3种液体中总蛋白含量均与患龋无关，但菌斑液和全唾液中某些蛋白可能有重要的抗龋作用。     

龋齿及牙周病患者与健康人群口腔微生态的比较研究

目的:利用高通量测序技术比较健康人和口腔患者口腔微生物的组成和变化。方法:选取典型的龋齿和牙周病患者,收集受刺激的唾液和口咽样本并进行高通量测序,利用生物信息学分析和比较各样品之间的物种组成差异。结果:各组的平均操作分类单元(OTU)为315个,其中健康人口腔内硬壁菌(Firmicutes)、拟杆菌(Bacteroidetes)、蛋白菌(Proteobacteria)、放线杆菌(Actinobacteria)和梭杆菌(Fusobacteria)对应的OTU数目分别73、64、53、19和18个;此外,相对丰富度结果表明硬壁菌(Firmicutes)在儿童组中减少而在青年组和成年组中增多,而蛋白菌(Proteobacteria)在儿童组中增多而在青年组和成年组中减少。结论:年龄段和口腔疾病对牙齿的发育和口腔微生物的组成影响巨大,传统意义上的致病菌可能在口腔健康中同样发挥着维护口腔稳态的作用。     

The relationship between dental caries status and dental plaque urease activity

INTRODUCTION: Ammonia production from the metabolism of urea by urease enzymes of oral bacteria moderates plaque acidification and may inhibit dental caries, as suggested by in vitro studies and indirect clinical observations. The objective of this study was to examine the relationship of urease activity with dental caries at the clinical level. METHODS: Urease activity was measured in dental plaque and saliva samples from 25 caries-free subjects (CF) and in eight subjects with six or more open caries lesions (CA). Plaque and saliva collection was repeated for each subject 1 week later using identical procedures. RESULTS: Urease-specific activity in the dental plaque of CF subjects was significantly higher compared to that in the subjects with caries. The association of low plaque urease levels with increased caries was further supported by odds ratio analysis using different plaque urease cut-off points. Using a receiver operating characteristic curve it was estimated that there was an approximately 85% probability of correctly classifying the subjects as CA or CF based on the relative ordering of their plaque urease activity levels. No statistically significant differences were observed in salivary urease activity. CONCLUSION: This study suggests that loss of alkali-generating potential of tooth biofilms via the urease pathway has a positive relationship to dental caries.     

Immunological and microbiologic changes during caries development in young children

We explored the association between caries development, colonization with caries-associated microflora, and immunity as children begin the transition to mixed dentition. Forty children received dental examinations at 3-4 years of age, repeated a year later. Children were grouped into caries-free (n = 23; CF) and caries-active (n = 17; CA ≥3 new lesions on follow-up). Salivary IgA and IgA antibody to Streptococcus mutans virulence epitopes were measured by Luminex assay. Mutans streptococci (MS), lactobacilli and total microorganisms were enumerated on selective media from plaque samples. There was no significant difference in baseline levels of MS or lactobacilli between CF and CA groups. However, both MS and lactobacilli levels were higher at follow-up in the CA group. Furthermore, children with detectable lactobacilli at baseline had significantly higher caries risk. Salivary IgA concentrations increased significantly in both groups during the study. Both CF and CA groups also displayed significant increases in salivary IgA antibody levels to glucosyltransferase, glucan-binding protein (Gbp) and antigen I/II salivary binding region. CF antibody levels to seven peptides associated with domains of biological importance increased at follow-up, in contrast to increases to only three peptides in CA saliva samples. Multivariate modeling showed that a lower baseline level of salivary IgA anti-GbpB was associated with higher caries risk. These data indicate that MS and lactobacilli are associated with caries in this population, that the secretory immune system is undergoing significant maturation during this period, and that the breadth of mucosal IgA response to epitopes of S. mutans virulence components may influence the degree to which these cariogenic microorganisms can cause disease.     

3岁高龋与无龋儿童龈上菌斑微生物差异的宏基因组学分析

目的    用16S rDNA测序技术，探讨不同龋患程度儿童乳牙龈上菌斑微生物多样性及差异。方法    选择3岁龄儿童为研究对象，高龋组（dmft ≥ 5）和无龋组（dmft = 0）各12名，采集光滑面龈上菌斑，基于Ion S5TMXL平台（Thermo Fisher，美国）进行16S V4区域测序并对比分析。结果    通过与SILVA132数据库比对，可注释到14个菌门、21个菌纲、53个菌目、93个菌科、150个菌属、159个菌种。Alpha多样性分析提示高龋组物种丰富度和均匀度低于无龋组。Beta多样性分析显示高龋和无龋样本群落结构相似，组间无显著分离。两组中，优势菌门为放线菌门、变形菌门、厚壁菌门、拟杆菌门、梭杆菌门等；优势菌属为放线菌属、棒状杆菌属、奈瑟菌属、罗氏菌属、链球菌属、二氧化碳嗜纤维菌属等。LEfSe分析显示，高龋组显著丰富的微生物菌群有罗氏菌属、嗜血杆菌属、金氏菌属、龋齿罗氏菌、奈瑟杆菌等（P < 0.05）；无龋组显著丰富的微生物菌群有梭杆菌门、纤毛菌属、Leptotrichia_sp_oral_clone_IK040、颗粒二氧化碳嗜纤维菌等（P < 0.05）。变形链球菌的相对丰度在两组之间不存在显著差异（P > 0.05）。远缘链球菌仅在高龋组中被检出。此外，两组微生物样本中均存在低丰度的未曾定义新物种。PICRUSt分析显示，高龋组的微生物物质代谢与能量代谢等较无龋组更为丰富。结论    3岁儿童乳牙龈上菌斑微生物群落呈现多样性，不同龋患程度儿童口腔微生物群落在不同分类和功能水平上呈现显著差异，为乳牙龋的微生物因素研究提供了新数据。     

3岁高龋与无龋儿童龈上菌斑微生物差异的宏基因组学分析

 目的    用16S rDNA测序技术，探讨不同龋患程度儿童乳牙龈上菌斑微生物多样性及差异。方法    选择3岁龄儿童为研究对象，高龋组（dmft ≥ 5）和无龋组（dmft = 0）各12名，采集光滑面龈上菌斑，基于Ion S5TMXL平台（Thermo Fisher，美国）进行16S V4区域测序并对比分析。结果    通过与SILVA132数据库比对，可注释到14个菌门、21个菌纲、53个菌目、93个菌科、150个菌属、159个菌种。Alpha多样性分析提示高龋组物种丰富度和均匀度低于无龋组。Beta多样性分析显示高龋和无龋样本群落结构相似，组间无显著分离。两组中，优势菌门为放线菌门、变形菌门、厚壁菌门、拟杆菌门、梭杆菌门等；优势菌属为放线菌属、棒状杆菌属、奈瑟菌属、罗氏菌属、链球菌属、二氧化碳嗜纤维菌属等。LEfSe分析显示，高龋组显著丰富的微生物菌群有罗氏菌属、嗜血杆菌属、金氏菌属、龋齿罗氏菌、奈瑟杆菌等（P < 0.05）；无龋组显著丰富的微生物菌群有梭杆菌门、纤毛菌属、Leptotrichia_sp_oral_clone_IK040、颗粒二氧化碳嗜纤维菌等（P < 0.05）。变形链球菌的相对丰度在两组之间不存在显著差异（P > 0.05）。远缘链球菌仅在高龋组中被检出。此外，两组微生物样本中均存在低丰度的未曾定义新物种。PICRUSt分析显示，高龋组的微生物物质代谢与能量代谢等较无龋组更为丰富。结论    3岁儿童乳牙龈上菌斑微生物群落呈现多样性，不同龋患程度儿童口腔微生物群落在不同分类和功能水平上呈现显著差异，为乳牙龋的微生物因素研究提供了新数据。