ABCB1(1199G>A)基因多态性对多西他赛转运影响的分子机制

目的：在体外研究ABCB1（1199G>A）基因多态性对多西他赛转运影响的分子机制。方法：将ABCB1（1199G>A）野生型和突变型基因分别导入HEK293细胞,研究2种重组细胞株对多西他赛的摄取以及跨膜转运的差异。结果：在细胞毒性分析中,ABCB1_1199A/mut细胞对多西他赛表现出更强的耐药性。多西他赛在2种重组细胞中的含量均显著性的低于对照组细胞,证实了多西他赛是由P-糖蛋白介导转运的,并且在ABCB1_1199A/mut细胞中跨膜转运更高。ABCB1_1199A/mut细胞介导转运多西他赛的P-糖蛋白的活性较ABCB1_1199G/wt细胞的更强。结论：ABCB1（1199G>A）基因多态性能够显著性影响P-糖蛋白转运多西他赛的能力,由ABCB1突变型基因编码的P-糖蛋白能够更有效的转运多西他赛。因此ABCB1（1199G>A）基因多态性可能会影响P-糖蛋白的活性,并对药物的分布和消除产生影响,从而影响药物的治疗作用。     

pEGFP-NTCP稳定转染HEK293细胞系的建立及鉴定

目的高效快速地建立稳定高表达钠离子-牛磺胆酸共转运多肽(sodium taurocholate cotransporting polypeptide,NTCP)的HEK293细胞系。方法构建可表达EGFP-NTCP融合蛋白的p EGFP-NTCP重组质粒,并利用Fu GENE 6转染试剂将重组质粒转染至HEK293细胞中。用荧光显微镜观察绿色荧光蛋白表达情况,挑选转染细胞进行14 d G418筛选和单克隆培养,以获得稳定转染细胞株。用RT-PCR法、qRT-PCR法和Western blot技术检测稳定转染细胞及正常细胞中NTCP mRNA和蛋白的表达情况,并进一步用超高效液相色谱-串联质谱法(UPLC-MS/MS)考察稳定转染细胞的牛磺胆酸摄取能力。结果使用本文优化的方法,细胞转染率可达90%。RT-PCR、qRT-PCR、Western blot和牛磺酸摄取实验结果显示:相对于正常组,在荧光显微镜下呈绿色荧光的转染细胞;其NTCP表达均显阳性(P<0.01);且稳定转染细胞的牛磺胆酸摄取能力明显升高(P<0.05)。结论高效快速地建立了稳定高表达NTCP的HEK293细胞系,为胆酸衍生物摄取机制研究奠定了基础。     

稳定表达RASSFIA基因肝癌细胞株的建立

目的建立稳定表达RASSF1A基因的肝癌细胞株。方法真核表达载体pcDNA3．1( )RASSF1A经阳离子脂质体介导转染肝癌细胞株QGY-7703和Hep3B，通过G418筛选阳性细胞克隆，逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)和Western blot鉴定目的基因的表达。结果(1)QGY-7703，Hep3B细胞株的G418最佳筛选浓度分别为800ug／ml和400ug／ml；(2)QGY-7703和Hep3B细胞株各获得2个稳定表达RASSF1A基因的细胞克隆。结论成功建立了稳定表达RASSF1A基因的肝癌细胞株。     

稳定表达CRFR1的HEK293细胞株建立与功能鉴定

目的建立稳定表达CRFR1的HEK293细胞株,并鉴定cAMP评价体系构建是否成功。方法采用Lipofectamine2000将CRFR1质粒转染至HEK293细胞中,经G418筛选单克隆阳性细胞,采用Western blot技术、RT-PCR法、免疫荧光法证实稳定表达CRFR1细胞株构建成功。并用CRF刺激稳定表达CRFR1的HEK293细胞株,绘制CRF刺激HEK293-CRFR1细胞释放cAMP的量效曲线。结果 Western blot、RT-PCR、免疫荧光结果表明,CRFR1受体在HEK293细胞系中成功表达。cAMP释放量效实验显示,CRF刺激HEK293-CRFR1细胞释放cAMP的EC50为(5.64±0.05)×10-10mol·L-1。结论成功建立了稳定表达CRFR1的HEK293细胞株,并且cAMP含量评价体系构建成功,为研究CRFR1的生物学功能及筛选CRFR1受体靶向药物奠定了基础。     

ABCB1（1199G/A）基因多态性对甲磺酸伊马替尼转运的分子机制

摘 要 目的：探讨P 糖蛋白（P-gp）活性和所介导的甲磺酸伊马替尼胞内累积量及药物跨膜渗透性的影响。 方法: 将构建的ABCB1 1199G/wt和1199A/mut重组质粒分别转染HEK293细胞,利用RT-PCR法考察细胞中P-gp的mRNA表达水平。CCK-8法检测药物对细胞的毒性,高效液相色谱法（HPLC）检测细胞中药物浓度和胞内累积量,跨膜电阻实验考察药物跨膜渗透率,评价P-gp活性对药物转运的作用。结果: 细胞毒性实验表明,转染细胞内的药物浓度均低于对照组,证明P-gp具有介导药物转出胞外的作用。HPLC和跨膜电阻实验表明,与野生型ABCB1(1199G)细胞相比,突变型ABCB1(1199A)细胞抗甲磺酸伊马替尼的作用更强,P-gp对介导甲磺酸伊马替尼外排转运的作用较强且药物的跨膜渗透性也相应较强。结论:实验表明ABCB1（1199G/A）位点突变导致其编码蛋白P-gp活性改变,该位点多态性会导致甲磺酸伊马替尼清除率增加,抑制了药物在靶细胞中有效药物浓度,因此临床上应对ABCB1基因进行分型,指导甲磺酸伊马替尼的个体化用药。     

稳定转染细胞外基质磷酸糖蛋白细胞株构建及附着力改变研究

目的:检测细胞外基质磷酸糖蛋白对MRC5细胞附着能力的影响。方法:构建含细胞外基质磷酸糖蛋白基因及细胞周期检查点蛋白的质粒,稳定转染MRC5细胞,检测其附着能力的改变。结果:稳定转染细胞外基质磷酸糖蛋白与细胞周期检查点蛋白的MRC5细胞株的附着能力明显高于其他细胞株。结论:细胞外基质磷酸糖蛋白可以促进细胞附着。     

稳定表达RASSF1A基因肝癌细胞株的建立

目的建立稳定表达RASSF1A基因的肝癌细胞株。方法真核表达载体pcDNA3.1(+)RASSF1A经阳离子脂质体介导转染肝癌细胞株QGY-7703和Hep3B,通过G418筛选阳性细胞克隆,逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)和Western blot鉴定目的基因的表达。结果 (1)QGY-7703,Hep3B细胞株的G418最佳筛选浓度分别为800 μg／ml和400 μg／ml;(2)QGY-7703和Hep3B细胞株各获得2个稳定表达RASSF1A基因的细胞克隆。结论成功建立了稳定表达RASSF1A基因的肝癌细胞株。     

稳定高效表达人血栓调节蛋白的CHO细胞株的建立

目的:构建稳定高效表达人血栓调节蛋白(human thrombomodulin,hTM)的CHO细胞株,以便于大量生产纯化hTM蛋白。方法:利用脂质体li-pofectamine 2000将包含hTM基因全长序列的重组表达质粒pThr402转染CHO细胞。转染后用G418的选择性培养液筛选、挑取抗性克隆。采用流式细胞术和Western blotting检测hTM在CHO细胞膜表面的表达情况,筛选建立稳定高效表达hTM的CHO细胞株并对其稳定性进行观察。结果:重组表达质粒pThr402转染CHO细胞后,流式细胞术证实hTM稳定高效表达于随机挑选的5个抗性克隆细胞株的细胞膜表面,但表达量有差异。Western blotting分析检测显示hTM表达量较高的CHO-TM1、CHO-TM4与CHO-TM5细胞株的细胞裂解液出现了与预期值相符的约105000的特异性条带。CHO-TM5已经经过冻存复苏前后各20次传代,且无论有无G418选择压力存在,hTM表达水平无明显差异。结论:成功构建了稳定高效表达hTM的CHO细胞株,可望获得大量蛋白,为进一步研究hTM的生物学功能以及制备和筛选抗hTM的单抗开辟新的途径。     

稳定表达抗HER2单克隆抗体的FUT8基因敲除细胞株的建立

本研究在实验室前期构建的敲除α-1,6-岩藻糖基转移酶(FUT8)基因的中国仓鼠卵巢(CHO)细胞株(FUT8-/--CHO-S)基础上,建立了稳定表达IgG1型抗HER2单克隆抗体的稳转细胞株。以曲妥珠单抗为模式蛋白,构建了带有嘌呤霉素抗性基因的表达载体pIRES-HC和pIRES-LC,并用电穿孔法共转染入FUT8-/--CHO-S细胞,通过嘌呤霉素加压培养、Dot Blot和WesternBlot等检测方法,经过两轮有限稀释筛选出了高表达的稳转细胞株Tru-FUT8-/--CHO-S。该细胞株在批次培养(Batch)中最高生长密度达每毫升6.05×106个,抗体产量为168 mg/L。在补料培养(Fed-Batch)中,通过补料CHO Feed4的添加,最高生长密度提高到每毫升17.1×106个,抗体产量达到437 mg/L,试验结果表明改造的FUT8-/--CHO-S细胞株具有开发成工业细胞株的潜力。     

CYP2C19基因多态性真核表达载体的构建及稳定转染细胞系的建立

目的:构建细胞色素P450CYP2C19*1、*2、*3真核表达载体,并分别转染人肝癌细胞(HepG2),建立高表达目的基因的稳定转染细胞系。方法:应用化学合成法合成CYP2C19*1(野生型)序列,再以此为模板,体外定点突变PCR法构建*2、*3(突变型)。DNA重组技术将其定向插入到真核表达载体pcDNA3.l(-),经菌落PCR、酶切以及测序鉴定后,脂质体转染法转染HepG2细胞,通过G418选择培养,建立稳定转染细胞系,RT-PCR、Western Blot分别检测CYP2C19*1、*2、*3 mRNA以及蛋白的表达。结果:成功构建了pcDNA3.1(-)-CYP2C19*1、*2、*3表达质粒,并建立了相应稳定转染细胞系。进一步的RT-PCR和Western Blot检测结果表明,目的基因均得到了稳定的表达。结论:人CYP2C19*1、*2、*3稳定表达细胞系为研究创新药物或新药先导化合物临床前代谢性质的筛选和预测以及为临床潜在药物相互作用提供了有效实验平台。     

阿尔采末病淀粉样前体蛋白(APP)和早老素-1(PS-1)双重基因稳定转染细胞系的建立

目的　构建APP751和PS 1(M14 6L)双重基因稳定转染的中国仓鼠卵巢 (CHO)细胞系 ,以用于 β 分泌酶或γ 分泌酶抑制剂的研究和相关药物的筛选。方法　从人胎盘基因文库中用多聚酶链反应 (PCR)方法扩增野生型和突变型PS 1(M14 6L)基因 ,并重组克隆到PCI neo质粒 ,用脂质体 (Lipo fectAmine)法将野生型和突变型 (M14 6L)PS 1转染至含APP751表达基因的CHO细胞 ,选择培养液筛选能稳定表达目的基因的CHO细胞株。用免疫沉淀和ELISA测定分析细胞表达产物。结果　建立了数株能表达Aβ和PS 1的CHO细胞。在转染细胞株中高表达的SP 1为全长 4 5kd的PS 1蛋白 ;野生型PS 1和突变型PS 1(M14 6L)以及单纯APP751转染的CHO细胞株均可分泌Aβ多肽 ,且突变型PS 1(M14 6L)转染的细胞株分泌到条件培养液中的Aβ1～ 42 比其它细胞株增加了近两倍。结论　突变型PS 1(M14 6L)的高表达可促使Aβ1～ 42 的分泌增加。我们建立的PS 1和APP双重基因稳定转染的CHO细胞株模型 ,可用于 β 分泌酶或γ 分泌酶抑制剂的研究和相关药物的筛选     

Toll样受体4重组质粒及稳转HepG2细胞株的构建

目的 将Toll样受体(TLR4)野生型及突变型(包括单突变和双突变)基因分别转入HepG2细胞,建立稳定表达TLR4蛋白的细胞株.方法 PCR扩增用于合成TLR4的cDNA,设计引物应用PCR点突变的方法合成1196T及896G单突变质粒和TLR4-1196T,896G双突变质粒.经慢病毒包装后,将合成的pLVX-TLR4-Puro、pLVX-TLR4(A-G)-Puro、pLVX-TLR4(C-T)-Puro、pLVX-TLR4(A-G,C-T)-Puro质粒转染HepG2细胞.在细胞贴壁后加入嘌呤霉素进行筛选;Western blot检测各组细胞TLR4的表达量.结果 嘌呤霉素筛选出含有抗性基因的细胞,说明TLR4重组质粒成功转入细胞;Western blot结果表明TLR4在HepG2细胞中稳定过表达.结论 成功构建了4组TLR4过表达的细胞株,为研究TLR4基因多态性对HepG2细胞生物学功能的影响奠定基础.     

State-dependent blockade of human ether-a-go-go- related gene （hERG） K＋ channels by changrolin in stably transfected HEK293 cells

Aim:

To study the effect of changrolin on the K⁺ channels encoded by the human ether-a-go-go-related gene (hERG).

Methods:

hERG channels were heterologously stably expressed in human embryonic kidney 293 cells, and the hERG K⁺ currents were recorded using a standard whole-cell patch-clamp technique.

Results:

Changrolin inhibited hERG channels in a concentration-dependent and reversible manner (IC₅₀=18.23 μmol/L, 95% CI: 9.27–35.9 μmol/L; Hill coefficient=−0.9446). In addition, changrolin shifted the activation curve of hERG channels by 14.3±1.5 mV to more negative potentials (P<0.01, n=9) but did not significantly affect the steady-state inactivation of hERG (n=5, P>0.05). The relative block of hERG channels by changrolin was close to zero at the time point of channel opening by the depolarizing voltage step and quickly increased afterwards. The maximal block was achieved in the inactivated state, with no further development of the open channel block. In the “envelope of tails” experiments, the time constants of activation were found to be 287.8±46.2 ms and 174.2±18.4 ms, respectively, for the absence and presence of 30 μmol/L changrolin (P<0.05, n=7). The onset of inactivation was accelerated significantly by changrolin between −40 mV and +60 mV (P<0.05, n=7).

Conclusion:

The results demonstrate that changrolin is a potent hERG blocker that preferentially binds to hERG channels in the open and inactivated states.     

人胚肺成纤维细胞c-Ha-ras~(V12G)基因转染细胞系促癌剂检测模型的建立

为建立一个促癌剂检测模型 ,采用电穿孔法 ,将突变的c Ha rasV12G 基因转入人胚肺成纤维细胞WI 38中 ,将获得的G4 18抗性 (G4 18r)单克隆细胞株进行DNADot 印迹及RT PCR分析后 ,进一步用佛波醇酯 (PMA)处理 ,并选用克隆形成率 ,锚着独立性生长及裸鼠成瘤性等表型改变对受试细胞进行了恶性程度检测 .结果表明 :在促癌剂PMA作用下 ,WI38基因转染细胞发生了恶性转化 ,c Ha rasV12G基因使细胞对PMA的促癌敏感性增强 .由此可见 ,该模型可直接用于促癌剂的检测     

Inhibition of hERG K+ currents by antimalarial drugs in stably transfected HEK293 cells

Several antimalarial drugs are known to produce a QT interval prolongation via a blockade of the rapidly activating delayed rectifier K+ current (IKr), encoded by the human-ether-a-go-go-related gene (hERG). We investigated the influence of lumefantrine and its major metabolite desbutyl-lumefantrine, as well as halofantrine, chloroquine, and mefloquine, on wild type hERG K+ channels in stably transfected human embryonic kidney cells (HEK293) using the whole cell patch-clamp technique. All of the tested antimalarial drugs inhibited the hERG K+ channels in a concentration- and time-dependent manner. Only halofantrine blocked hERG tail currents voltage-dependently. The ranking of the half-maximal inhibitory concentrations (IC50) of the antimalarials was: halofantrine (0.04 microM)相似文献   

Association of the MDR1 (ABCB1) gene 3435C> T polymorphism with male infertility

Infertility is a common problem affecting one in six couples, and in 30% of infertile couples, the male factor is a major cause due to defective sperm quality. P-glycoprotein (P-gp), a product of the MDR1 (ABCB1) gene, may be a link between genetic and environmental factors contributing to the development of male infertility because pesticides (P-gp substrates) are well established factors of male infertility. The aim of the present study was to examine the effect of the MDR1 gene 3435C>T polymorphism on male infertility. In total, 162 male patients undergoing semen analysis due to initial infertility workup were included in the study. The control group consisted of 191 healthy males with proven fertility. MDR1 3435C>T genotyping was performed by the polymerase chain reaction-restriction fragment length polymorphism (PCR-RFLP) method. Assessment of MDR1 genotypes among the infertile men showed that 17.9% of subjects were carriers of the CC genotype, 58.0% were CT and 24.1% were TT. Among fertile men, 30.4% of subjects were characterised by the CC genotype, 49.7% were CT and 19.9% were TT. In addition, the frequency of carriers of at least one T allele (i.e., CT and TT genotypes) among infertile and fertile subjects was 82.1% and 69.6%, respectively. The risk of infertility was significantly elevated by two-fold in individuals carrying at least one T allele (CT and TT genotypes: p = 0.009, OR = 2.00, 95% CI: 1.20–3.32). Furthermore, this elevated risk was still found when considering each of the CT and TT genotypes alone (TT genotype: p = 0.027, OR = 2.05, 95% CI: 1.09–3.86; CT genotype: p = 0.013, OR = 1.98, 95% CI: 1.16–3.36). This preliminary report suggests that P-gp may play some role in male infertility, mediating detrimental effects of environmental factors.     

稳定表达TRPA1通道的HEK-293T细胞模型的建立

目的建立稳定表达TRPA1的HEK-293T细胞模型,并鉴定模型构建是否成功。方法构建TRPA1真核表达质粒,采用脂质体转染法将其转入HEK-293T细胞中,经G418筛选稳定表达株,采用RT-PCR、免疫组化技术,检测HEK-293T细胞TRPA1基因的转录和蛋白的表达。结果经酶切、测序证明,TRPA1基因的真核重组表达质粒已成功构建;PCR、免疫组化检测结果表明,将此重组质粒转入HEK-293T细胞可稳定表达TRPA1基因。结论成功构建了能稳定表达TRPA1通道的HEK-293T细胞株,为体外研究TRPA1生理病理功能和筛选相关TRPA1通道调节剂奠定了基础。