硫化氢信号系统在张应力下大鼠骨髓间充质干细胞成骨分化过程中的变化

目的 探讨张应力作用下大鼠骨髓间充质干细胞(BMMSCs)成骨向分化过程中硫化氢(H2S)信号系统的表达改变.方法 应用四点弯曲加力系统,对体外分离培养的大鼠BMMSCs施加不同大小的周期单一张应力40min,2h后检测检测H2S信号系统中重要的H2S和胱硫醚-.y-裂解酶的表达量,同时检测碱性磷酸酶、骨钙素表达量并进行成骨细胞转录因子-2mRNA定量分析.结果 随着张应力的增大,H2S信号系统的表达逐渐增强,同时成骨能力亦增强,但2000μstrain以后H2S信号系统的表达与成骨能力均下降.结论 适当的张应力可促进H2S信号系统表达和BMMSCs骨向分化,硫化氢信号系统可能在这一过程中起重要作用.     

应力对人牙周膜成纤维细胞Ⅰ型胶原和纤连蛋白mRNA表达的影响

目的 探讨机械应力下人牙周膜成纤维细胞(human periodontal ligament fibroblasts,hPDLF)Ⅰ型胶原和纤连蛋白mRNA表达的变化,为阐明力信号的细胞内转导机制提供依据. 方法 对体外培养的hPDLF分别施加不同动态张、压应力(强度为1000、2000、4000 μstrain,加力时间为0、0.5、1、4、8、12 h),定量聚合酶链反应(PCR)检测Ⅰ型胶原和纤连蛋白mRNA表达. 结果 随时间延长1000 μstrain张应力和压应力均使Ⅰ型胶原和纤连蛋白mRNA表达增强,2000 μstrain和4000 μstrain张应力均使Ⅰ型胶原mRNA表达先增强1 h后减弱,而2000 μstrain和4000μstrain压应力均使Ⅰ型胶原mRNA表达持续减弱,2000 μstrain张应力和压应力均使纤连蛋白mRNA表达持续增强,而4000 μstrain张应力和压应力均使纤连蛋白mRNA表达先增强4 h后减弱. 结论 本项实验提供的应力范围内动态张应力和压应力刺激可改变hPDLF Ⅰ型胶原和纤连蛋白mRNA的表达.     

非病毒载体介导pBMP-2转染MC3T3-E1细胞的体外成骨分化研究

目的 :探讨非病毒载体Gen Escort TM II介导质粒骨形态发生蛋白2(p BMP-2)转染对MC3T3-E1细胞增殖和体外成骨分化的影响。方法:以非病毒载体Gen Escort TM II介导报告基因质粒增强型绿色荧光蛋白(p EGFP)转染MC3T3-E1细胞,优化转染条件,荧光显微镜和流式细胞仪评价转染效率。p BMP-2转染MC3T3-E1细胞后,MTT法检测细胞增殖情况,染色法检测碱性磷酸酶(ALP)和茜素红S(ARS)的表达,Real-time PCR分析成骨细胞标志基因ALP、骨涎蛋白(BSP)、Runt相关转录因子2(Runx2)、骨钙素(OCN)和骨桥蛋白(OPN)的表达。结果 :Gen Escort TM II介导p EGFP转染MC3T3-E1细胞后,转染效率达35.02±4.42,MTT结果示基因转染对细胞增殖无影响(P>0.05)。p BMP-2转染组的ALP、ARS表达较p EGFP转染组和未转染组显著,同时Real-time PCR检测结果示,转染后6 d,p EGFP转染组和未转染组相比,p BMP-2转染组的成骨基因ALP、BSP、Runx2、OCN、OPN的表达量差异有显著性意义(P<0.05)。结论:非病毒载体Gen Escort TM II介导BMP-2转染MC3T3-E1细胞可诱导其向成骨方向分化。     

miR-335对牙囊干细胞成骨分化能力的影响

目的 体外研究大鼠牙囊干细胞成骨分化能力,以及miR 335对牙囊干细胞成骨分化能力的影响。 方法 双向差速法体外分离培养大鼠牙囊干细胞,进行成骨诱导。用茜素红染色检测成骨分化的能力,进而用qRT-PCR检测miR-335的表达,并且在瞬时转染miR-335 mimics和inhibitor后成骨诱导,用PCR和Western Blot的方法检测成骨能力的改变。 结果 双向差速法培养的牙囊干细胞具有成骨样细胞分化能力。成骨诱导的牙囊干细胞中miR-335表达降低,转染mimics后成骨能力降低,转染inhibitor后成骨能力升高。 结论 在体外条件miR-335可以抑制牙囊干细胞成骨分化。     

同源盒蛋白Msx1在骨形成蛋白-4成骨效应中的作用

目的:研究同源盒蛋白Msx1在骨形成蛋白-4(bone morphogenetic protein-4,BMP-4)成骨效应中的作用,并探讨Msx1与BMP-4的调控关系。方法:体外培养成纤维细胞C2C12,BMP-4处理C2C12细胞24h和36h后,用携带Msx1基因的腺病毒转染C2C12细胞,过度表达同源盒蛋白Msx1,4d后检测细胞中碱性磷酸酶(alkalinephosphatase,ALP)的活性,单独用BMP-4处理组和BMP-4连同空白腺病毒组为对照组,未用BMP-4处理组为阴性对照组。结果:在BMP-4处理24h后,Msx1腺病毒转染的细胞ALP活性非常低,而BMP-4处理36h后,Msx1腺病毒转染的细胞显示强ALP活性,单独用BMP-4处理和BMP-4连同空白腺病毒处理的细胞同样显示强ALP活性。结论:同源盒蛋白Msx1能抑制BMP-4的成骨效应,且具有一定的时段特性。     

张应力下成骨性转录因子在骨髓间充质干细胞中的表达

目的:探讨大鼠骨髓间充质干细胞(MSCs)对单一周期的机械力刺激的反应以及Ets-1、Cbfa1和ALP的基因表达.方法:密度梯度离心法体外分离培养大鼠骨髓MSCs;应用四点弯曲加力系统对细胞施加40 min、2 000μ8的机械牵张力,检测MSCs细胞增殖及ALP活性,并采用实时荧光定量RT-PCR检测Ets-1、Cbfa1和ALP的基因表达.结果:机械力刺激下,MSCs的增殖活力、ALP活性以及Ets-1、Cbfa1和ALP的基因表达均显著增高.Ets-1表达较早,加力后0.5 h达到最高峰;而Cbfa1表达较晚,加力后6 h达到最高峰;ALP的表达与Cbfa1相似.3个基因表达增高均在6～12 h后恢复到正常水平.结论:单一周期的张应力可诱导Ets-1、Cbfa1和ALP在MSCs中呈时间依赖性表达,并促使MSCs短暂性骨向分化.机械力刺激是MSCs骨向分化的关键驱动因子,对牵张成骨骨痂形成具有重要的作用.     

张应力对成骨样细胞MG-63增殖状态的影响

目的：研究体外培养的成骨样细胞在受到不同应变强度的张应力作用后其增殖状态的改变。方法：采用四点弯曲细胞力学加载仪对成骨样细胞MG-63分别以不同强度的张应力进行力学刺激，并对其受力后的增殖状态进行了研究。结果：在1000μstrain的张应力作用后成骨样细胞增殖指数有升高但与未受力时无显著差别；在2000～4000μstrain范围内的张应力作用后其增殖指数较未受力时显著升高，其中，2000μstrain张应力作用后增殖指数最高；4000μstrain以上则随着应变值的增加，细胞的增殖指数不断升高并显著高于受力位于4000μstrain以下时。结论：在生理受力范围内，2000μstrain的张应力对成骨样细胞的促增殖作用最强；而超过生理受力范围的张应力作用于成骨样细胞后，随着力值的增大，细胞增殖活性逐渐增强并高于细胞受生理范围内张应力作用时。     

载碱性成纤维细胞生长因子温敏水凝胶对大鼠骨髓间充质干细胞体外成骨分化的作用研究

目的:实验合成载碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)壳聚糖/β-甘油磷酸钠/明胶温敏水凝胶,研究其对骨髓间充质干细胞(BMMSCs)成骨分化的作用.方法:制备壳聚糖/β-甘油磷酸钠/明胶水凝胶,冻干后电子显微镜下观察其表征;检测水凝胶毒性;CCK-8法筛选出载bFGF温敏水凝胶促BMMSCs增殖最适浓度并用于后续研究;碱性磷酸酶染色、茜素红染色及钙结节半定量分析观察其对BMMSCs成骨向分化能力的作用;实时荧光定量PCR检测其对BMMSCs成骨相关基因表达的影响.结果:(1)成功制备壳聚糖/β-甘油磷酸钠/明胶温敏水凝胶,扫描电镜下冻干后的水凝胶孔径为20～80μm.(2)活/死细胞染色结果显示壳聚糖/β-甘油磷酸钠/明胶温敏水凝胶具有良好的生物相容性.(3)载bFGF温敏水凝胶能显著促进BMMSCs增殖,并呈剂量依赖性,最适浓度为100 ng/mL(P<0.01).(4)载bFGF温敏水凝胶组碱性磷酸酶表达增多,钙结节形成增多(P<0.05).(5)载bFGF温敏水凝胶组成骨相关基因(ALP、BMP-2、Runx2)表达增高.结论:载bFGF温敏水凝胶能促进大鼠BMMSCs成骨分化.     

TNF-a对BMP-2诱导下小鼠BMSCs成骨分化miRNA表达的影响

目的：探讨肿瘤坏死因子α(TNF-α)对骨形态发生蛋白-2（BMP-2）诱导下小鼠骨髓间充质干细胞(BMSCs)成骨分化的微小核糖核酸（micro ribonucleicacid, miRNA）表达谱的影响。方法给予小鼠BMSCs以下分组刺激：①阴性对照组（ctrl）;②阳性对照组（pos）：BMP-2（200ng/ml）刺激48h;③实验组（48h）：BMP-2（200ng/ml）+TNF-α（10ng/ml）刺激48h;④实验组（72h）：BMP-2（200ng/ml）+TNF-α（10ng/ml）刺激72h,48h和72h后分别提取RNA,应用miRNA芯片检测获得miRNA表达谱,筛选部分差异表达的miRNA进行荧光实时定量PCR（ RT-PCR）验证。结果 miRNA表达谱分析结果表明,与阳性对照组相比,48h双因子刺激下检测到表达上调超过1.5倍的miRNA有44个,72h刺激下检测到22个miRNA,72h与48h相比,检测到24个表达上调超过1.5倍的miRNA,RT-PCR验证与芯片结果基本相符合。结论 miRNA参与调控TNF-α模拟炎症状态下BMP-2诱导BMSCs的成骨分化过程,且相关miRNA在TNF-α作用下表达上调,可能参与调控TNF-α的抑制成骨作用。由此可进一步解释炎性因子对成骨细胞分化的抑制机制,为发现新的药物靶点提供理论依据。     

天然衍生脱细胞牛心包复合BMP-2转染的BMSCs引导骨组织再生的体外实验研究

目的: 研究天然衍生脱细胞牛心包复合BMP-2转染BMSCs引导骨组织再生的可行性和有效性。方法: 天然衍生脱细胞牛心包体外复合BMP-2转染BMSCs,SEM评估细胞生长与增殖,MTT法检测牛心包对转染细胞的毒性,ELISA 检测BMP-2含量,结晶紫染色法测定BMSCs细胞粘附能力,ALP活性实验检测转染BMSCs成骨性能。结果: SEM发现天然衍生脱细胞牛心包复合BMP-2基因转染的BMSCs后,细胞生长并增殖良好;各组细胞的存活率没有显著性差异;天然衍生脱细胞牛心包增强了BMP-2转染BMSCs的细胞粘附能力和成骨细胞转化能力。结论: 天然衍生脱细胞牛心包复合BMP-2基因转染BMSCs后,具有良好的生物和细胞相容性,有望成为一种优良的天然GBR膜材料。     

BMP受体在大鼠骨髓间充质细胞成骨中的作用

目的:研究骨形成蛋白受体(BMP-R)在大鼠骨髓间充质细胞(BMSCs)成骨中的作用机制。方法:分离大鼠BMSCs,将原代细胞分为4组,分别应用普通培养基(CM)、成骨诱导培养基(OM)、骨形成蛋白-2(BMP-2)和OM+BMP-2诱导培养基培养。应用碱性磷酸酶(ALPase)活性和钙结节染色(Von Kossa法)检测成骨分化程度,RT-PCR检测骨形成蛋白受体(BMP-R)的表达情况。采用SPSS16.0软件包对数据进行单因素方差分析。结果:OM可诱导BMSCs成骨分化,表现出高碱性磷酸酶活性和基质矿化能力。BMP-2可提高OM诱导BMSCs成骨分化的能力;OM在早期即可诱导BMP-RⅠA和BMP-RⅡ的表达,而BMP-2诱导BMP-R较迟。结论:BMP-2可提高OM诱导BM-SCs分化成骨的能力,BMP-R在BMSCs分化成骨中起重要作用。     

不同来源骨髓间充质干细胞成骨能力的比较

目的 比较人不同来源骨髓间充质干细胞(human bone marrow mesenchymal stem cells,hBMSCs)的骨向分化能力,为骨组织工程筛选种子细胞提供一定的理论基础.方法 体外组织块培养法和有限稀释法培养颌骨来源骨髓间充质干细胞(jaw bone-marrow-derived mesenchymal stem cells,JMMSCs);骨髓穿刺法和密度梯度离心法培养长骨来源骨髓间充质干细胞(bone-marrow-derived mesenchymal stem cells,BMMSCs).流式细胞仪鉴定细胞表面抗原标记,成骨分化诱导后茜素红染色检测细胞矿化能力,成骨分化诱导后qRT-PCR及Western Blot检测细胞成骨相关分子:Runx2、1型胶原(Collagen Type 1,COL-1)、OCN.结果 JMMSCs和BMMSCs均阳性表达CD90、CD105,阴性表达CD34、CD14、CD45.成骨分化诱导21 d后,茜素红染色显示JMMSCs矿化能力强于BMMSCs.成骨诱导7 d、14 d、21 d后,JMMSCs成骨相关分子在基因和蛋白水平上均强于BMMSCs.结论 与BMMSCs相比,JMMSCs成骨分化能力较强,颌骨骨髓可能更适于用作骨组织工程的成体干细胞来源.     

Effect of Porphyromonas gingivalis Lipopolysaccharide on Bone Marrow Mesenchymal Stem Cell Osteogenesis on a Titanium Nanosurface

Background: Titanium (Ti) dental implants have been widely used for prosthetic reconstruction of dentition. Unfortunately, peri‐implantitis can result in failure of dental implant osseointegration. Lipopolysaccharide (LPS) acts as a chronic inflammatory stimulus and maintains peri‐implant inflammation, worsening the prognosis for implant osseointegration. The purpose of this study is to determine the effects of 10 M NaOH‐modified Ti surface with nanonetwork structure on the proliferation and osteogenic differentiation of rat bone marrow mesenchymal stem cells (BMMSCs) in the context of Porphyromonas gingivalis LPS exposure. Methods: Titanium disks treated with 10 M NaOH solution and control were incubated with BMMSCs and exposed to P. gingivalis LPS (0, 0.1, or 1 μg/mL). The effects of the modified nanonetwork structure on osteogenic differentiation of rat BMMSCs were evaluated in the context of different concentrations of P. gingivalis LPS exposure. Results: Rat BMMSCs on the 10 M NaOH‐modified Ti surface with nanonetwork structure had higher levels of osteogenesis‐related gene expression and significantly greater cell proliferation, alkaline phosphatase activity, and extracellular matrix deposition and mineralization than cells on the untreated Ti surfaces, in all the groups with different doses of P. gingivalis LPS exposure. Conclusion: The 10 M NaOH‐modified Ti surface with nanonetwork structure has better endotoxin tolerance under P. gingivalis LPS exposure than the non‐modified surface.     

微弧氧化钛片与大鼠牙髓干细胞的生物相容性及成骨诱导研究

目的：观察大鼠牙髓干细胞（dental pulp stem cells,DPSCs）在微弧氧化（micro-arc oxidation,MAO）钛片表面粘附和分化情况,初步评价MAO钛片对DPSCs的成骨诱导性能。方法：实验组：DPSCs与MAO钛片共培养,阳性对照组：DPSCs成骨诱导培养,空白对照组：DPSCs无诱导普通培养。扫描电镜（SEM）观察DPSCs在MAO钛片表面粘附情况,碱性磷酸酶（ALP）活力检测,实时定量PCR分析Runx2、Osterix、DSPP和DMP-1基因表达和钙结节茜素红染色,鉴定DPSCs的成骨能力。结果：SEM观察MAO钛片表面粗糙多孔,DPSCs在MAO钛片表面粘附紧密,有触角向微孔内伸展。ALP活力检测和钙结节染色,实验组与阳性对照组无显著差异（P〉0.05）,与空白对照组有显著差异（P〈0.05）。实验组Runx2、Osterix表达增强,DSPP和DMP-1表达无明显变化。结论：粗糙多孔的MAO钛片与DPSCs有良好的生物相容性,DPSCs在MAO钛片表面粘附紧密,具有向成骨细胞系分化的能力。     

Addition of bone morphogenetic protein type 2 to ascorbate and β-glycerophosphate supplementation did not enhance osteogenic differentiation of human adipose-derived stem cells

Bone morphogenetic protein type 2 (BMP-2) is a potent local factor, which promotes bone formation and has been used as an osteogenic supplement for mesenchymal stem cells.

Objectives

This study evaluated the effect of a recombinant BMP-2 as well as the endogenous BMP-4 and BMP-7 in the osteogenic differentiation of adipose-derived stem cells (ASCs) in medium supplemented with ascorbate and β-glycerophosphate.

Material and Methods

Human ASCs were treated with osteogenic medium in the presence (ASCs+OM+BMP-2) or absence (ASCs+OM) of BMP-2. The alkaline phosphatase (ALP) activity was determined and the extracellular matrix mineralization was evaluated by Von Kossa staining and calcium quantification. The expressions of BMP-4, BMP-7, Smad1, Smad4, and phosphorylated Smad1/5/8 were analyzed by western blotting. Relative mRNA expressions of Smad1, BMP receptor type II (BMPR-II), osteonectin, and osteocalcin were evaluated by qPCR. Results: ASCs+OM demonstrated the highest expression of BMP-4 and BMP-7 at days 21 and 7, respectively, the highest levels of BMPR-II mRNA expression at day 28, and the highest levels of Smad1 mRNA at days 14 and 28. ASCs+OM+BMP-2 demonstrated the highest levels of Smad1 mRNA expression at days 1, 7, and 21, the highest expression of Smad1 at day 7, the highest expression of Smad4 at day 14, the highest ALP activity at days 14 and 21, and expression of phosphorylated Smad1/5/8 at day 7. ASCs+OM and ASCs+OM+BMP2 showed similar ALP activity at days 7 and 28, similar osteonectin and osteocalcin mRNA expression at all time periods, and similar calcium depositions at all time periods.

Conclusions

We concluded that human ASCs expressed endogenous BMP-4 and BMP-7. Moreover, the supplementation of ASCs with BMP-2 did not increase the level of osteogenic markers in the initial (ALP activity), intermediate (osteonectin and osteocalcin), or final (calcium deposition) phases, suggesting that the exogenous addition of BMP-2 did not improve the in vitro osteogenesis process of human ASCs.