问号钩体趋化相关基因特征分析

目的预测问号钩体黄疸出血群赖型赖株的趋化信号传导途径,并深入分析趋化相关基因.方法使用ProtParamtool,NCBI/Blastp进行蛋白参数分析和结构域分析,使用Clustalw软件进行多序列对比,与大肠埃希菌K-12趋化相关基因进行比较.结果问号钩体趋化相关基因共30个,分为MCPs和che两组基因,功能与大肠埃希菌趋化相关基因相似,并预测出问号钩体趋化信号传导途径.结论问号钩体趋化相关基因较大肠埃希菌、苍白密螺旋体和伯氏疏螺旋体多,提示其趋化传导途径更为复杂,适应宿主的能力也更强,可能是钩体的重要毒力因子之一.     

问号钩端螺旋体致病机制和新型疫苗及细菌耐药性研究进展

钩端螺旋体（简称钩体）病是重要的人兽共患传染病之一，但其致病机制至今不明，目前也无可预防所有问号钩体血清群、型感染的通用型疫苗。细菌耐药性一直是医学微生物学和传染病学关注的重大问题之一，近年发现二元信号传导系统（TCS）与某些细菌耐药性密切相关。根据近年国内外有关研究资料，文中就问号钩体致病物质及其作用机制、相关信号传导通路及其致病意义，以及TCS在肺炎链球菌对青霉素和头孢胺噻耐药性形成、结核分枝杆菌对异烟肼和乙胺丁醇耐药性影响的最新研究进展进行简要介绍。     

血流感染大肠埃希菌对多黏菌素耐药机制研究

目的探讨血流感染大肠埃希菌对多黏菌素的耐药机制及流行特点,为其治疗提供依据。方法收集2018年1月至2019年12月浙江省人民医院和杭州市余杭区第二人民医院门诊及住院患者中分离的血流感染大肠埃希菌241株,通过VITEK-2Compact系统检测大肠埃希菌药物敏感性;应用WHONET5.6软件统计药敏结果;通过PCR法检测多黏菌素耐药相关基因;应用多克隆序列位点（MLST）测定菌株克隆型别;应用接合试验验证多黏菌素耐药基因转移。结果241株血流感染大肠埃希菌中,分离出6株多黏菌素耐药大肠埃希菌,分离率为2.5%。PCR检测显示6株多黏菌素耐药大肠埃希菌均携带mcr-1耐药基因,MLST分析结果显示这些菌株属于不同克隆型别。此外,6株多黏菌素耐药大肠埃希菌mcr-1耐药基因均可以成功传递至受体菌大肠埃希菌J53菌株中。结论血流感染大肠埃希菌对多黏菌素的耐药机制主要是携带mcr-1基因,该基因定位于质粒进行水平播散,需密切监测携带mcr-1基因的菌株,防止其进一步传播。     

问号钩端螺旋体胶原酶结构和功能分析

目的：研究问号钩端螺旋体(简称问号钩体)致病机理，预测问号钩体胶原酶结构和功能，为进一步实验验证提供线索。方法：利用各种公共核酸及蛋白数据库资源，运用多种生物学软件对钩体胶原酶基因及其编码产物的结构和功能深入分析。结果：对问号钩体胶原酶进行了结构域归类；对其基因、蛋白的一般特性，蛋白一级结构，二级结构和超二级结构等作了对比性分析；对其序列中的部分片段：进行三维结构模拟；并绘制了其分子进化树，分析其垂直进化关系。结论：问号钩体胶原酶和其它多：种致病性微生物胶原酶具有不同层次、程度不等的相似性。它属于锌蛋白酶超家族和M9-蛋白酶家族。它可能在钩体浸润宿主并造成宿主多脏器出血等方面起重要作用。     

大肠埃希菌质粒型AmpC酶基因的检测分析

目的 调查大肠埃希菌质粒型Ampc酶基因的存在状况。方法 采用MH药敏平板对40株临床分离的大肠埃希菌进行抗菌药物敏感试验和ESBLs纸片法确诊，PcR方法检测DHA和ACT-1型Ampc酶基因。结果 40株大肠埃希菌呈多重耐药，20株ESBLs阳性菌AmpCM基因阳性率90％，20株ESBLs性菌Ampc酶基因阳性率45％，40株大肠埃希菌ACT-1和DHA基因阳性率分别为57．5％，40．0％，有12株大肠埃希菌同时携带ACT-1和DHA基因。结论 临床分离的大肠埃希菌多重耐药严重，质粒型AmpC酶基因携带率高。     

不同血清群问号钩端螺旋体mce基因序列分析及表达模式的研究

目的：确定问号钩端螺旋体（简称钩体）株携带侵袭相关mce基因情况，原核表达mce基因并制备其抗血清，了解问号钩体感染细胞前后mce基因转录水平的变化。方法：采用PCR扩增13株问号钩体和1株双曲钩体全长mce基因片段，T—A克隆后测序。采用基因工程技术构建mce基因原核表达系统，SDS—PAGE联合Bio—Rad凝胶图象分析系统检查目的重组蛋白rMce表达情况，采用Western Blot对表达的rMce进行鉴定。采用皮内免疫法制备兔抗rMce血清，免疫双扩散试验测定其效价。采用实时荧光定量RT—PCR，检测问号钩体黄疸出血群赖型56601株感染J774A．1细胞前后mce基因转录水平的变化。结果：我国13株问号钩体株均携带mce基因，双曲钩体三宝垄群patoc型PatocI株则否。与报道的序列（GenBank accession No．：NP_712236）比较，所克隆的mce基因核苷酸和氨基酸序列相似性分别为99．02％～100％和97．91％～100％。所构建的mce基因原核表达系统能表达rMce，其产量为细菌总蛋白的5％。问号钩体56601株全菌抗血清能有效识别rMce。问号钩体56601株感染细胞后mce基因转录水平明显上调。结论：mce基因仅存在于致病性的问号钩体中，且其转录水平呈细胞接触上调模式，表明该基因与问号钩体致病性密切相关。mce基因产物是序列保守的外膜蛋白。所构建的mce基因原核表达系统及所制备的rMce抗血清为深入研究该基因功能提供了有效的手段。     

肝病患者院内感染病原菌大肠埃希菌特征分析

本文的写作目的是研究肝病患者院内感染病原菌大肠埃希菌特征，以便于指导对肝病患者的临床治疗工作。本文采用的研究方法是对病原菌大肠埃希菌进行腹水培养筛选，并对这些培养出来的大肠埃希菌进行相关的医学检测，分析出大肠埃希菌的各项基本特征。经过检验之后，发进行实验的60株大肠埃希菌中，有17株发生变化，证明大肠埃希菌具有着较强的抗药性。本文的研究结果是肝病患者院内感染病原菌大肠埃希菌具有着一定的耐药性，可以在肝病患者的治疗过程之中选择亚胺培南等药物进行治疗。     

泌尿系感染患者大肠埃希菌fimH基因检测及尿便来源菌株同源性分析

目的：检测尿路致病性大肠埃希菌I型菌毛相关基因fimH携带率,调查相同泌尿系感染患者尿便大肠埃希菌的同源性,对相关基因fimH进行序列分析。方法：89株来自反复发作性尿路感染和急性单纯性膀胱炎患者清洁中段尿分离的大肠埃希菌。PCR方法检测I型菌毛基因fimH,采用Fisher确切概率法比较两组携带率是否有差异。取9名患者尿便同时培养的大肠埃希菌进行药敏初筛分型,同源性分析采用脉冲场凝胶电泳（PFGE）技术,对其fimH基因PCR扩增产物进行序列分析。结果：89株检出81株fimH阳性,两组检出率分别为（64／70）91．4％和（17／19）89．4％,P〉0．05。9名患者中5名患者尿便同时分离大肠埃希菌各自存在相同的PFGE型,同一患者尿便同型株中fimH阳性者序列比对无差异,不同型株fimH阳性者其序列均有6～7处变异。结论：fimH基因存在于绝大多数尿路致病性大肠埃希菌中。引起泌尿系感染的大肠埃希菌部分来源于肠道。     

群体感应系统受体SdiA与大肠埃希菌1型菌毛的相关性研究

目的 探讨群体感应系统受体SdiA与大肠埃希菌1型菌毛的相关性.方法 在有或无群体感应系统信号分子处理下检测大肠埃希菌SM10λpir的野生株、sdiA敲除株和sdiA过表达回复株与酵母细胞的黏附能力,并用荧光定量PCR检测1型菌毛相关基因fimC、fimF的表达情况.转录组测序分析上述菌株1型菌毛相关基因的表达差异....     

随机引物扩增多态性DNA技术在大肠埃希菌分型中的应用

目的：应用随机引物扩增多态性DNA(RAPD)技术分析大肠埃希菌DNA多态性，并对其进行分型，观察敏感株、耐药株基因型之间的关系。方法：利用蛋白酶K、酚—氯仿抽提DNA模板，应用一对随机引物建立RAPD的检测分析方法，并对12株敏感型、15株耐药型(ESBLs)大肠埃希菌进行基因分析。结果：12株敏感型有8种基因型；15株耐药型中有12种基因型。27株大肠埃希菌在250bp处有共同条带；15株耐药型在1200bp处有共同条带，而敏感型则没有。结论：大肠埃希菌属间有特异性共同条带；耐药菌株中存在共同的特异性条带，与耐药性有关。因此，大肠埃希菌对β-内酰胺类耐药，可利用RAPD基因分型技术进行鉴定。     

以λgt11作载体构建赖型钩体基因文库及其重组质粒pDL121的…

为探讨赖型钩体抗原基因特点及其表达产物作为疫苗的可行性，采用问号赖型０１７株钩体经Ｈｈａ Ｉ和Ａｌｕ Ｉ限制性内切核酸酶部分消化，行ＥｃｏＲ Ｉ限制酶切位点甲基化，加上ＥｃｏＲＩ接头与去磷酸化的λｇｔ１１ＤＮＡ－ＥｃｏＲ１臂连接，体外包装后转染Ｅ．ｃｏｌｉ Ｙ１０９０，建成含２．１×１０＾４重组子的问号赖型０１７株钩体基因文库。用抗赖型钩体兔血清从上述基因文库中筛选出中阳性克隆，λＤＬ１２，亚克隆     

问号钩端螺旋体胶原酶体内和体外的活性研究

目的通过检测致病性钩端螺旋体（钩体）胶原酶在体内、外的活性,探讨问号钩体黄疸出血群赖型赖株（赖株）假定的胶原酶（LA0872）在钩体病出血中的可能作用。方法在大肠杆菌中克隆、表达重组赖株la0872,并行相关鉴定及蛋白酶学活性检测。比较不同毒力菌株赖株、赖株减毒株和双曲钩体三宝垄群montevalerio型Monte Valerio株钩体胶原酶的基因序列特异性及转录和酶活水平的差异。测定豚鼠和沙鼠赖株感染模型的血清胶原酶活性水平变化。结果成功构建的重组质粒经酶切和测序鉴定显示位点连接正确,插入序列与GenBank公布的la0872序列完全一致,并证实其具有胶原酶活性;不同毒力菌株中的钩体胶原酶基因序列一致,转录和酶活水平均无显著性差异;豚鼠和沙鼠感染赖株后,宿主体内血清胶原酶活性水平与未感染赖株动物比较差异无统计学意义（P〉0.05）。结论首次表达和鉴定了有活性的钩体胶原酶,但其在钩体病出血中的作用尚待证实和探讨。     

问号钩端螺旋体胶原酶体内和体外的活性研究

目的 通过检测致病性钩端螺旋体(钩体)胶原酶在体内、外的活性,探讨问号钩体黄疸出血群赖型赖株(赖株)假定的胶原酶(LA0872)在钩体病出血中的可能作用.方法 在大肠杆菌中克隆、表达重组赖株la0872,并行相关鉴定及蛋白酶学活性检测.比较不同毒力菌株赖株、赖株减毒株和双曲钩体三宝垄群montevalerio型Monte Valerio株钩体胶原酶的基因序列特异性及转录和酶活水平的差异.测定豚鼠和沙鼠赖株感染模型的血清胶原酶活性水平变化.结果 成功构建的重组质粒经酶切和测序鉴定显示位点连接正确,插入序列与GenBank公布的la0872序列完全一致,并证实其具有胶原酶活性;不同毒力菌株中的钩体胶原酶基因序列一致,转录和酶活水平均无显著性差异;豚鼠和沙鼠感染赖株后,宿主体内血清胶原酶活性水平与未感染赖株动物比较差异无统计学意义(P>0.05).结论 首次表达和鉴定了有活性的钩体胶原酶,但其在钩体病出血中的作用尚待证实和探讨.     

赖型钩体重组质粒pDJH_2亚克隆及其在大肠杆菌中的高效表达

为了探讨ｐＤＪＨ２的１．９ｋｂ０１７株钩体ＤＮＡ片段可否作为钩体重组疫苗广谱保护性抗原的候选，采用重组ＤＮＡ技术，将ｐＤＪＨ２的１．９ｋｂＤＮＡ片段分别与ｐＴ７－７，ｐＲＳＥＴ系列重组，转化入大肠杆菌进行亚克隆，ＩＰＴＧ诱导表达。结果显示：阳性亚克隆ｐＤＪｔ．ｐＤＪｒＢ１能在大肠杆菌中高效表达；对其进行ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析，可见６８ｋｄ和２３ｋｄ处出现新带，与钩体０１７株外膜同分子量蛋白带位置一致，免疫印迹（特异性抗０１７株外膜抗血清）在６８ｋｄ和２３ｋｄ处分别有印迹；用ｐＤＪｔ亚克隆重组质粒主动免疫豚鼠，可抵抗强毒力株攻击，表现出免疫保护作用。本实验结果提示：（１）ｐＤＪＨ２１．９ｋｂ重组ＤＮＡ片段能以不同质粒为载体，在不同大肠杆菌株中高效表达；（２）该重组ＤＮＡ片段表达产物——６８ｋｄ和２３ｋｄ蛋白，可能是赖型钩体０１７株外膜的保护性抗原。     

地高辛配基标记DNA打点杂交和原位杂交...

DNA of Leptospira interrogans sv. lai strain 017 was labelled with digoxigenin or alpha 32P or biotin and used as probes to detect DNA of leptospires. Probes labelled with digoxigenin were able to detect 0.1-1 pg of homologous DNA and 10(2) of L. interrogans sv. lai strain 017. Probes alpha 32P and biotin detected 1 pg and 10 pg of homologous DNA and 10(3), 5 x 10(3) of L. interrogans sv. lai strain 017 respectively. These three probes couldn't detect L. biflexa sv. patoc strain Patoc I, L. illini strain 3055, Escherichia coli. Bacillus aerogenes capsulalus, Salmonella anatis, K-DNA of Leishmania, and of human WBC. Comparison of digoxigenin-, alpha 32P- and Biotin-labelled probes in the dot-blot hybridization assay on different serogroup sv. of leptospires revealed that digoxigenin-labelled probes were more sensitive than alpha 32P and biotin-labelled probes. The results indicate that digoxigenin-labelled probes DNA can be used for detection of leptospires in field and clinic. We also report procedures in situ hybridization with leptospira in tissues smear and plasma sediment of an experimentally infected guinea pig. It offers the advantage of recognizable of leptospiral morphology in combination with a hybridization signals. The results indicate that digoxigenin-labelled DNA probes of 017 strain might provide tool for routine diagnosis and classification in cases of leptospiral interrogans infection.     

miR-340在膀胱尿路上皮癌中的表达及其靶基因预测的生物信息学分析

目的探讨miR-340在膀胱尿路上皮癌中的表达,并对其预测的靶基因进行生物信息学分析,为miR-340在膀胱尿路上皮癌发生中的作用机制研究提供理论基础。方法采用miRNA芯片技术检测膀胱尿路上皮癌及正常膀胱黏膜组织中miRNA表达谱,用实时定量PCR法进行验证,挑选具有显著表达差异的miR-340为进一步研究对象,利用生物信息学方法,对miR-340的靶基因进行预测,并对其靶基因进行基因本体（GO）功能富集分析及KEGG信号转导通路富集分析。结果miRNA表达谱芯片、实时定量PCR法均提示miR-340在膀胱尿路上皮癌中较癌旁正常膀胱组织中表达明显降低。miR-340预测靶基因集合功能富集于细胞黏附（celladhesion）、生物黏附（biologicaladhesion）和细胞间黏附（cell-celladhesion）等,KEGG通路分析涉及癌通路（pathwaysincancer）和细胞周期通路（pathwaysincellcycle）等。结论miR-340在膀胱尿路上皮癌中呈低表达,miR-340预测靶基因集合显著富集在与肿瘤发生相关的信号通路中。     

KIAA0101调控胃癌细胞周期的相关基因筛选

目的筛选KIAA0101 基因对细胞周期影响的相关基因。方法以RT-PCR方法分析胃癌组织相对于配对癌旁组织中 KIAA0101基因表达量,利用DAVID数据库对差异基因进行GO功能富集分析和KEGG通路富集分析,使用KEGG绘制通路 图,将与KIAA0101表达模式相关的基因列表回带入TCGA cBioPortal进行基因之间相互网络作用的关系研究,并借由系统生 成基因拓扑关系图。最后采用RT-PCR方法对候选基因进行筛选。结果癌组织中KIAA0101 mRNA表达水平为1.104±0.379, 显著高于配对癌旁组织（0.421±0.172;P=0.0179）。系统通过汇总分析全部基因探针的表达强度,对来自478 例组织中与 KIAA0101相关的基因进行了筛选。GO功能分析显示差异基因主要富集在蛋白磷酸化、RNA加工、细胞周期、DNA代谢过程、 蛋白质转运、乙酰化、细胞凋亡、蛋白质水解、氧化还原等功能。KIAA0101表达水平的改变主要影响的胃癌相关通路有：细胞周 期、剪接体、DNA复制、p53 信号转导通路等。KEGG通路图及基因拓扑图显示,BUB1B、MAD2L1、CDC45、CDK1、CCNE1、 CCNB2等与KIAA0101相关的基因也与细胞周期相关,RT-PCR结果证实BUB1B、MAD2L、CDK1、CCNE1、CCNB2 mRNA表 达水平显著高于配对癌旁组织（P<0.05）,CDC45 mRNA表达水平无显著性差异（P>0.05）。结论KIAA0101 可能通过影响 BUB1B、MAD2L1、CDK1、CCNE1、CCNB2 表达产生对细胞周期的影响,这个结果可以为KIAA0101 影响细胞周期的作用机 制、肿瘤标志物的筛选和药物靶点的选择提供参考。     

基于多重数据库的肾癌转移相关基因生物信息分析及功能初探

［摘要］目的: 通过生物信息学技术探讨肾癌转移瘤细胞与原发性肾癌细胞基因表达差异，寻找关键的差异基因及与其可能相关的分子机制。方法: 从GEO基因芯片数据库中下载人肾癌转移瘤和原发性肾癌的相关基因芯片数据GSE85258，用GCBI在线工具分析肾癌转移瘤和原发性肾癌的差异表达基因。分析差异表达基因GO及Pathway；筛选出既符合GO又符合Pathway的差异基因；将差异基因之间的相互作用及共表达关系构建基因网络图；构建差异基因Pathway网络图。通过体外细胞侵袭实验验证差异基因在肾癌细胞中的功能。结果： GSE85258数据集中共筛选出3 000个差异基因，其中表面活性蛋白2(SFTPA2)升高最显著，SLC17A3降低最明显。GO分析显示，差异基因主要参与DNA依赖性转录，信号转导，小分子代谢过程等多个生物学功能。Pathway分析显示，差异基因主要参与内质网蛋白质加工，代谢途径，癌症途径等生物学过程。差异基因相互作用分析显示MAPK1为核心信号传递中介，PRKCA、NRAS、NOS1等基因与其直接作用。差异基因间共表达既有正相关也有负相关，其中与周围基因关系最多的10个基因，互为正相关。Pathway网络分析显示MAPK信号通路是上下游通路最多的信号通路，其包含细胞周期、细胞凋亡、P53信号通路、癌症途径等与肿瘤发生相关的信号通路。侵袭实验显示，抑制SFTPA2表达可降低肾癌细胞的侵袭能力(t=18.44，P <0.01)。结论： 肾癌转移瘤细胞与原发性肾癌细胞存在表达差异基因，其中SFTPA2、MAPK1、PRKCA、NOS1可能是关键差异基因，其可能参与MAPK信号通路等，促进肾癌转移。     

通过生物信息学分析鉴定调控神经母细胞瘤骨髓转移的中枢基因

目的:利用生物信息学的方法，探讨神经母细胞瘤骨髓转移的中枢基因及其可能的分子机制。方法: 选取GEO数据库中神经母细胞瘤基因骨髓转移的芯片数据集GSE42548，应用在线分析工具Networkanalyst筛选差异表达基因。使用DAVID数据库对上述差异表达基因进行GO功能分析及KEGG通路分析。应用STRING在线数据库和Cytoscape软件构建蛋白质相互作用（PPI）网络，并筛选hub genes、枢纽模块和seed genes，利用Venn图对hub genes和seed进行分析。结果: 分析芯片数据，筛选得到990个差异表达基因，GO和KEGG分析结果显示，差异表达基因与信号转导、生物膜合成等过程有关，并富集在Hematopoietic cell lineage通路上。通过构建PPI网络筛选得到了10个hub genes、6个枢纽模块和17个seed genes。通过Venn图确定关键基因Cxcr4。结论: 研究中筛选出了10个hubgenes和17个seed genes，其中Cxcr4基因在神经母细胞瘤骨髓转移起到关键作用，提示基于CXCR4- SDF-1之间的调控关系可能为神经母细胞瘤骨髓转移的早期诊断提供新的见解。     

用分子杂交技术分析不同毒力钩端螺旋体基因组DAN同源性

用~(32)P标记钩端螺旋体(钩体)基因组DNA,以Dot-blot和Southern-blot杂交法分析5株钩体DNA同源性。结果表明:问号钩体黄疸出血群赖型017株和601株及七日热群七日热型245株与双曲钩体patoc型Patoc I株、细螺旋体illini型3055株同源程度极低;3株问号钩体有不同程度同源;illini型3055株与各株同源性均低。