弓形虫速殖子分泌排泄抗原研究进展

弓形虫分泌排泄抗原具有重要功能。本综述了近年来速殖子棒状体，致密颗粒及微线体的主要分泌排泄抗原在分子生物学方面的研究进展。     

棘球蚴特异性抗原的蛋白质印迹分析

目的　寻找细粒棘球蚴 (Eg)和多房棘球蚴 (Em)特异性抗原组分用于免疫诊断。　方法　对Eg、Em的囊液、原头节、囊壁角质层、囊壁生发层及犬泡状带绦虫、犬豆状带绦虫、羊细颈囊尾蚴、猪囊尾蚴等 4种异源性绦虫 ,共14种粗抗原进行免疫学分析。采用蛋白质印迹试验 (Western blotting)、Genesnap和Genetool分析软件比较分析不同抗原蛋白条带分别与囊型棘球蚴病 (CE)及泡型棘球蚴病 (AE)患者血清反应的差异。　结果　 14种粗抗原中与CE、AE患者血清发生交叉反应的 11条蛋白条带相对分子质量 (Mr)为 130000、100000、94000、80000、75000、66000、62000、52000、38000、32000及 24000 ;与CE患者血清有特异性反应的 5条蛋白条带Mr为 41000、40000、22000、160 00和12000 ;与AE患者血清具有特异性反应的 8条蛋白条带Mr为 120000、109000、86000、59000、43000、28000、20000及 18000。　结论　确定了Eg和Em共有的交叉反应性抗原和具有进一步研究价值的特异性抗原组分 ,为进一步分离和鉴定具有诊断价值的特异性抗原提供了基础资料     

STAg和CT滴鼻免疫小鼠诱导的刚地弓形虫特异性黏膜及系统免疫应答

刚地弓形虫（Toxoplasma gondii）属专性细胞内寄生性原虫，人群感染极为普遍，全球约20亿人感染，2001—2004年中国人群血清阳性率高达7．88％。弓形虫感染在免疫缺陷、免疫抑制者可引起严重病变，孕期感染可经胎盘垂直传播致先天性弓形虫病。研制安全、有效、价廉的疫苗防治弓形虫感染乃当务之急。机体95％以上的感染发生在黏膜部位，皮下、肌肉接种疫苗不能有效诱导黏膜部位的免疫应答，只有从黏膜部位进行疫苗接种，才能有效预防黏膜感染。     

慢性弓形虫感染大鼠脊髓组织蛋白质的双向电泳分析和质谱鉴定

目的观察慢性弓形虫感染大鼠脊髓蛋白质组的变化与差异表达,为探讨慢性弓形虫感染对脊髓损伤的分子机制奠定基础。方法将6只SD雄性大鼠随机分为对照组和感染组,每组3只。感染组每鼠腹腔感染纯化的RH株弓形虫速殖子107/ml×2ml,对照组每鼠腹腔注射灭菌生理盐水2ml。大鼠感染弓形虫10周后解剖,采用双向凝胶电泳分离脊髓总蛋白,经考马斯亮蓝染色后用Image Master图象分析系统分析,从胶中选取分离蛋白质点,通过基质辅助激光解析电离飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)分析获取肽质量指纹图谱(PMF),采用Mascot软件搜索MSDP、SWISS2PROT数据库鉴定蛋白质。结果慢性弓形虫感染大鼠和正常对照组大鼠脊髓蛋白斑点数分别检出(268±13)个和(301±15)个,对2张电泳图进行匹配后发现有7个蛋白斑点在2组大鼠脊髓组织中的含量发生了3倍以上的变化,有差异的7个蛋白斑点经质谱鉴定的数据检索发现3个差异表达蛋白质,分别为甘油三磷酸脱氢酶(similar to glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase)、含缬酪肽蛋白(valosin-containing protein)和类肌动蛋白[cytoplasmic 2(Gamma-actin)]。结论慢性弓形虫感染对大鼠脊髓神经的损伤机制可能与能量代谢受阻和细胞增殖有关。蛋白差异点有可能成为慢性弓形虫感染的治疗靶点。     

弓形虫缓殖子期特异性抗原1基因的克隆、表达及对重组抗原的免疫反应性分析

目的 克隆与表达弓形虫缓殖子期特异性抗原1(BAG1)的基因,并分析重组抗原的免疫反应性。方法 诱导体外培养的弓形虫RH株速殖子向缓殖子转化,用RT-PCR法从缓殖子期弓形虫扩增BAG1基因片段,进行序列分析;构建表达重组质粒pET32a(+)-BAG1,转入大肠埃希菌BL21(DE3)中诱导表达;表达蛋白经次氨基三乙酸镍(Ni-NTA)琼脂糖亲和层析纯化后,蛋白质印迹(Western blotting)分析与ELISA分析其免疫反应性。 结果 从缓殖子期弓形虫克隆的BAG1基因长690 bp,构建的重组质粒pET32a(+)-BAG1经异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导后,可高效表达重组BAG1。Western blotting分析显示纯化的重组BAG1(SAG1)能被弓形虫慢性感染血清识别。ELISA结果表明重组BAG1抗原检测350份人血清弓形虫IgG抗体的阳性率为17.4％,显著高于重组SAG1抗原的阳性率12.6％（P＜0.05）。 结论 原核表达的重组BAG1抗原具有特异的免疫反应性。     

弓形虫速殖子细胞质、细胞膜、排泄—分泌抗原蛋白分子测定及特异性免疫反应的试验分析

目的 研究弓形虫速殖子各类抗原的蛋白组分，主要蛋白分子的抗原性和用于血清学诊断的价值。方法 用聚丙烯酰胺凝胶电泳分析弓形虫速殖子各类抗原的蛋白组分和主要蛋白分子，用免疫印渍技术以弓形虫患者血清识别弓形虫各类抗原的免疫反应靶位。结果 弓形虫速殖子细胞质抗原、细胞膜抗原和分泌代谢抗原的主要蛋白分子分别为85、52、38ku；48、35、16、14ku和158、95、27、15、13ku及弓形虫患者特异性血清识别速殖子各类抗原的免疫反应靶位分别是32、40和27ku。结论 弓形虫速殖子各类抗原间存在各自独特的抗原决定簇和可被特异性记忆抗体识别的免疫反应受体。此对于提高弓形虫感染的免疫学诊断及免疫学预防均具有一定的实用价值。     

应用聚丙烯酰胺凝胶电泳及免疫印迹技术分析弓形虫蛋白质与抗原的研究

本研究应用聚丙烯酰胺凝胶电泳及免疫印迹技术，对我们分别引进或从畸胎中分离所得的弓形虫株－RH株、Z－2株、CN株和SH1、2、3、4、5、8株的蛋白质和抗原成份进行分析，结果表明，在蛋白质的主要区带方面，9株弓形虫比较接近，而在部分区带上有所不同；用高滴度的针对RH株的抗弓形虫抗体分析9株弓形虫抗原成份，可见有一些共同的抗原成份。     

刚地弓形虫RH株速殖子在HeLa细胞系体外培养的实验观察

目的 建立稳定高效的刚地弓形虫RH株速殖子(以下简称弓形虫速殖子)体外培养模型。 方法 ①将HeLa细胞（1×10⁴个）接种置于细胞培养皿内底部的盖玻片,12 h后将纯化的弓形虫速殖子接种于细胞培养皿（1×10⁴个/皿）,继续培养0.5～96 h,观察弓形虫速殖子在HeLa细胞内增殖情况;②将纯化的弓形虫速殖子接种于HeLa细胞后分为2组,一组于37 ℃分别培养24～120 h后,移入25 ℃培养120 h;另组于37 ℃培养48 h后,移入25 ℃分别培养72～168 h,观察不同温度和时间对弓形虫速殖子产率和活虫率的影响;③当培养的HeLa细胞80%发生细胞融合时更换速殖子培养液,同上法12 h后接种纯化的弓形虫速殖子进行培养,当80% HeLa细胞被感染增殖的弓形虫速殖子涨破时,收集、计数弓形虫速殖子,并用其感染（3×10⁶个/瓶）新的HeLa细胞,观察其连续传代情况;④每隔5代取弓形虫速殖子,腹腔接种昆明小鼠（3×10⁶个/只）,观察小鼠存活时间、评价该体外培养条件对弓形虫速殖子毒力的影响。 结果 接种弓形虫速殖子96 h后HeLa细胞均被感染及涨破,培养弓形虫速殖子30代（3～4 d为1代）增殖稳定,每代获得弓形虫速殖子1×10⁷～5×10⁷个,增殖5～20倍。各代弓形虫速殖子对昆明小鼠的平均致死时间为5.80～6.40 d, 毒力未见减弱(P>0.05)。HeLa细胞接种弓形虫速殖子,于37 ℃培养72 h后,移至25 ℃培养120 h,其产率高达40倍以上,活虫率为90%以上,仅残留极少量Hela细胞。 结论 刚地弓形虫RH株速殖子可在HeLa细胞中增殖并长期稳定传代。     

应用环介导等温扩增技术检测弓形虫

目的 用环介导等温扩增（LAMP）技术检测弓形虫。 方法　 用酚-氯仿法提取弓形虫速殖子基因组 DNA,设计两对扩增弓形虫 B1基因的 LAMP 引物。以间日疟原虫、恶性疟原虫、卡氏肺孢子虫、日本血吸虫及小鼠白细胞作对照,进行LAMP反应,产物经 SYBR Green I显色及电泳后观察结果,绿色判为阳性,棕色判为阴性。将弓形虫速殖子经倍比稀释为（2～3）×106个/ml至（2～3）×10-1个/ml 等8个浓度,进行LAMP反应,验证该方法的敏感性。 结果 LAMP反应结果显示,弓形虫速殖子检测管经显色后呈绿色,对照组均呈棕色。弓形虫的LAMP产物经电泳后呈LAMP特征性梯状条带,对照组均无扩增产物。LAMP技术可检测到的弓形虫速殖子最低浓度为2～3个/ml。 结论 LAMP技术在弓形虫检测中显示出较好的特异性与敏感性。     

双氢青蒿素和阿奇霉素对小鼠体内弓形虫速殖子超微结构的影响

将30只昆明小鼠随机均分为3组,即双氢青蒿素治疗组（A组）、双氢青蒿素和阿奇霉素联合治疗组（B组）, 以及感染对照组（C组）。每鼠腹腔注射感染2×10³个弓形虫速殖子。感染8 h后,A组灌服双氢青蒿素75 mg/（kg·d）, 间隔12 h再给药1次;B组同A组,另于感染24 h后灌服阿奇霉素200 mg/(kg·d)1次。A、B两组均连续给药4 d,双氢青蒿素间隔12 h给药1次,阿奇霉素间隔24 h给药1次。C组不给药。治疗后（即于感染96 h后）,分别随机从各组取 1只小鼠解剖,抽取腹水,分离弓形虫速殖子。常规制备透射电镜标本,观察其超微结构变化。结果显示,A、B两组弓形虫速殖子均出现水肿,细胞膜结构模糊,局部断裂或破损。细胞质脂滴增多、形成空泡。而感染对照组未出现上述变化。     

弓形虫病大鼠T淋巴细胞和脾微量元素的测定

目的　观察感染弓形虫大鼠外周血T淋巴细胞及其亚型以及脾组织中 5种微量元素 (Fe2 + 、Cu2 + 、Zn2 + 、Ca2 + 、Mg2 + )含量的变化。方法　 2 0只大鼠随机分为实验组和对照组。实验组每鼠经腹腔注入 2ml含 1.5× 10 6弓形虫速殖子的生理盐水悬液 ,对照组每鼠腹腔注射 2ml生理盐水。 6 4d后将 2组大鼠处死 ,取外周血及脾组织。用细胞内α 醋酸萘酯酶标记T淋巴细胞的方法观察弓形虫病大鼠外周血T淋巴细胞 (TL)及其亚型辅助性T淋巴细胞 (Th)和抑制性T淋巴细胞 (Ts)的变化 ,同时用原子吸收分光光度仪测定其微量元素的变化。结果　实验组外周血TL和Th均低于正常对照组 (P <0 .0 1、P <0 .0 1) ,两组间Th/Ts比值差异显著 (P <0 .0 1) ;实验组脾Fe2 + 、Cu2 + 含量明显减少 (P <0 .0 1,P <0 .0 1) ,而Mg2 + 含量明显增加 (P <0 .0 1)。结论　弓形虫感染能引起大鼠外周血TL、Th和Ts改变及脾内微量元素的变化     

刚地弓形虫速殖子与鼠星形胶质细胞体外共培养的实验观察

原代培养星形胶质细胞,待其长至培养皿的80%时,将星形胶质细胞与弓形虫速殖子(细胞与虫体的比例为1∶10)共培养0～72h,吉氏染色观察星形胶质细胞和弓形虫速殖子的变化。共培养1h,此时定为0点,再培养0～48h,单磺酰戊二胺染色在荧光显微镜下观察星形胶质细胞内自噬囊泡的变化。结果发现共培养1h时,弓形虫速殖子开始进入星形胶质细胞,并出现荧光颗粒;8h星形胶质细胞内荧光颗粒最多;12h后显著减少,星形胶质细胞开始被破坏;48h星形胶质细胞内荧光颗粒消失;72h大部分星形胶质细胞已被涨破,留下大量增殖的弓形虫速殖子。说明自噬在弓形虫速殖子体外感染星形胶质细胞的过程中是受到抑制的。     

RH株弓形虫速殖子体外入侵大鼠肠上皮细胞与增殖的动态观察

目的 动态观察弓形虫RH株速殖子（简称速殖子）体外入侵大鼠肠上皮细胞（IEC-6细胞）及其增殖过程。 方法 取24孔培养板,设实验组及对照组各3孔,每孔放置经预处理的盖玻片。将常规传代培养的IEC-6细胞接种于各培养孔,于37 ℃ 5% CO2培养箱培养24 h,吸弃培养液,实验组每孔加入1 ml速殖子悬液（含1×106个速殖子）,对照组每孔加入1 ml无抗生素培养液,共培养。用倒置显微镜连续观察速殖子粘附、入侵IEC-6细胞及其增殖过程,并分别于共培养5～30 min、1～48 h后取出盖玻片,经吉氏-瑞氏染色后光镜观察其入侵和增殖情况,计算入侵率。 结果 共培养5 min,速殖子即可入侵IEC-6细胞,随着共培养时间的延长入侵的速殖子逐渐增多,1 h为1～5个,入侵率为（55.0±6.6）%。2 h入侵率高达（81.8±10.2）%,有假包囊形成,速殖子可入侵细胞核并在核内增殖。4 h入侵率降为（80.8±9.2）%,假包囊破裂释出成簇排列的速殖子。6 h入侵率为（75.1±8.2）%,成簇排列的速殖子显著增多。12 h成簇排列的速殖子减少,多数速殖子游离细胞外,完整的IEC-6细胞明显减少。24 h只见部分IEC-6细胞和假包囊存在,有大量游离的速殖子。48 h见大量游离速殖子,未见贴壁细胞。 结论 体外培养的弓形虫速殖子可迅速入侵IEC-6细胞,并可在细胞质及细胞核内增殖。增殖周期为6～12 h。     

弓形虫研究的过去、现在与未来

弓形虫为顶复动物门寄生原虫,呈世界性广泛分布,可感染所有温血动物,并在宿主免疫功能低下或受抑制时导致严重的疾患,其极高的流行性和致病的机会性已越来越引起人们的关注。本文回顾了弓形虫研究的历史,综述了目前弓形虫研究的热点并提出了在今后研究中需要解决的问题。     

刚地弓形虫纳虫泡的形成机制及其作用

刚地弓形虫是寄生宿主广泛的细胞内寄生性原虫,人群感染相当普遍。弓形虫侵入宿主细胞后寄居于一个抗宿主细胞内涵体酸化作用和溶酶体融合作用的纳虫泡(parasitophorous vacuole)内,纳虫泡在弓形虫的寄生过程中起着非常重要的作用。本文就弓形虫纳虫泡形成的机制及其在弓形虫寄生宿主细胞过程中的作用进行综述。     

刚地弓形虫蛋白质组研究进展

随着基因组学的发展和完善,在基因组学的基础上,蛋白质组学作为一门新兴的前沿科学已经显示出了其巨大的发展前景.将蛋白质组学技术应用于弓形虫研究,在蛋白质水平上全面认识弓形虫的生理、病理等过程是目前弓形虫研究领域的热点之一.该文就弓形虫蛋白质组的研究进展进行综述,以期从蛋白质组学研究的角度为弓形虫研究提供新的思路.